Введение к работе
Актуальность проблемы. л-Талассемия является тяжелым
наследственным аутосомно-рецессивным заболевании с высокой долей летальности у гомозигот.
По последним данным частота носительства дефектных генов при этом заболевании в среднем в мире составляет около ЗЖ
/Kazazian Н.Н. & Bohem 1488/. Распространение ЭТОГО
заболевания носит характер краевой патологии, затрагивая районы, неблагоприятные по малярии. В Азербайджане частота носительства Р-талассемического гена достигает ЮЖ /Токарев D.H. 1983/.
Основными методами лечения ^-талассемий является инфузии хелатора железа "Десферала" в сочетании с . трансфузией эритроцитарной массы или трансплантация нормального костного мозга. Стоимость таких методов терапии исключительно высока.
Альтернативным методом является существенно более дешевая процедура - профилактика гэ-талассемий, где главным этапом является пренатальная ДНК-диагностика, проводимая в первом триместре беременности. В ряде стран успешно действуют программы, направленные на определение группы риска и проведение пренатальной ДНК-диагностики /з-галассемий. Детская' смертность от данного заболевания в этих странах понизилась в 5-Ю раз по отношению к уровню, который мог бы быть при отсутствии профилактических мероприятий.
Основным моментом, определявдим возможность проведения пренатальной ДНК-диагностики, является либо знание конкретных молекулярных дефектов в ^-глобиновом гене, приводящих к tf-талассемии, либо возможность дискриминации нормальных и талассемических хромосом по полиморфным сайтам рестрикции. Можно считать доказанным, что основные fJ-талассемические мутации в разши этнических группах или популяциях нежестко сцеплены с характерными гаплотипами (т.е. распределением полиморфных сайтов рестрикции вдоль р-глобшового кластера генов).
Изучение молекулярных дефектов, приводящих к ^-талассемии. показало значительное разнообразив мутаций, лежащих в основе данной болезни. К настоящему времени известно более 85 мутаций / чи,>- а. і-?вч/. среди них наиболее часто встречающимися являются точковые замены,
делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, влияющие на разные этапы функционирования /э-глобинового гена.
Результаты предыдущих исследований показали, что в Азербайджане возможно существуют несколько форм /э-талассемий, как р, так и f>+. Прямое определение мутаций путем клонирования дефектного гена и последующего секвенирования позволили выявить одну мутацию (р* ivsi-no) /Лимборская 1987/. Введение в практику исследований метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило значительно упростить и ускорить выявление р-талассемических мутаций. С использованием ПЦР и прямого секвенирования по Максаму-Гилберту были выявлены 5 р- мутации: fbcb <-аа),
CacC'V (С-Т), ГЬСЄ2/ЄЇ (-G), FbC3h/37, РЗС44 /ialovyev іЗ.Уа.
1990, Гольцов А.А. 1990/. Кроме того, дот-гибридизацией амшшфицированных фрагментов ^-глобинового гена с аллельспецифическимиолигонуклеотвдами (АСО) были обнаружены мутации: ivsi-l ivsi-6, ivsa-t /Гольцов A.A. I99Q/. Существенно отметить тот факт, что среди обследованных ранее больных в большом числе случаев (40%) каких-либо мутаций выявить не удалось.
Полученные до настоящего времени данные свидетельствуют о существовании еще многих ^э-талассемических мутаций в Азербайджане. Можно также сделать вывод о высокой частоте встречаемости мутаций в гетерозиготном состоянии, что в значительной степени затрудняет их идентификацию и требует усовершенствования применяемых методов.
Шль_Вв(Зота состояла в установлении наиболее полного спектра молекулярных дефектов, приводящих к /?-талассемии в Азербайджане, с использованием методов, позволяющих достоверно тестировать мутации в гетерозиготном состоянии. Наряду о этим существенно оыло выяснить набор гаплотипов, сцепленных с л-талассемическими мутациями в Азербайджане, наиболее простыми и точными методами, основанными на ПЦР.
Задачи исследования;;. Поставленная цель определила
постановку задач:
I. Выявление /9-талассемических мутаций, характерных для
Азербайджана, и установление частоты их встречаемости с использованием прямого секвенирования амплифщироввнных фрагментов ^-глоОинового гена.
-
Внедрение модифицированного метода секвенирования по Сэнгэру с использованием термостабильной полимеразы для тестирования мутаций в гетерозиготном состоянии.
-
Разработка методов для выявления полиморфных сайтов рестрикции в кластере гг-глобиновых генов на основе ПЦР.
4. Определение при помощи разработанных методов гаплотипов,
характерных для Азербайджанской популяции, и оценка их
сцепленности. с 0-талассемическими .«утациями.
Научная новизна^ С помощью модифицированного метода
Сэнгера прямым секвенированием амплифицировашшх в ПЦР фрагментов /э-глобиновых генов больных /з-талассемией из Азербайджана, выявлено 6 новых для данного региона мутаций
(FSC3/9, FSC14, ConUS, CodT-O. IVBL-5, СО>;2г/23/24 ),
две из которых ранее в мировой популяции не встречались (инсерция нуклеотида Т в 14 кодоне (fsci4), делеция семи нуклеотдов -ааштш в кодонах 22-24). Кроме того, прямым-секвенированием доказано существование еще трех мутаций (tvsi-i. ivsi-в, ivaz-i), найденных ранее гибридизацией с АСО-зондами. Обнаружено 6 новых гаплотипов, характерных для Азербайджана.
_Практическая_ценность. Осуществленная в данной работе характеристика р-талассемических мутаций позволяет проводить пренатальную ДНК-диагностику у 4/5 семей в Азербайджане.
Апр^оация_диссертации. Материалы диссертации
опубликованы в 7 научных работах и докладывались на II съезде гематологов Азербайджана в 1990г., на II съезде медицинских генетиков в 1990г.и на Всесоюзной конференции "Геном человека" в 1990г.
Работа была апробирована на заседании проблемной комиссии "Экспериментальная гематология и биотехнология" ВГЩ АМН РСФСР 26 сентября 1991 г.
J3y5ffin
2бъем_и_структща_иссвртации. Диссертация изложена на во страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, вывода. Указатель литературы включает 7 отечественных и &Z иностранных источника. Диссертация иллюстрирована і0 рисунками и ІЗ таблицами.
Работа начата в лаборатории генной инженерии (зав. -доктор химических наук, профессор Н.И.Гринева), завершена в лаборатории генных диагностикумов (зав. - кандидат биологических наук Г.Я.Соловьев) НИИ экспериментальной гематологии и'биотехнологии ВГНЦ. Исследование выполнено при консультативной помощи ст.н.с. лаборатории генных диагностикумов В.Л.Сурина.
Соавторами по публикациям были Г.Я.Соловьев, В.Л.Сурин, А.В.Лукьянанко, А.А.Гольцов.