Введение к работе
Актуальность проблемі, в последние годы в диагностике клещевого
энцефалита (КЭ) получили распространение иммунологические методы, основанные на взаимодействии антигена и антитела. Однако, их чувствительность часто недостаточна для прямой детекции вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в исследуемом материале от больных, в связи с чем требуется предварительное накопление вируса в биологической системе, увеличивающее длительность анализа. Кроме того, указанные методы не обеспечивают ранней диагностики заболевания, необходимой для выбора рационального метода лечения, из-за низкой концентрации антигена, с одной стороны, и латентного периода при образовании антител, с другой. Существенный недостаток при обнаружении антигена в клиническом материале - возможность получения ложноположительных результатов за счет полиспецифических антител, присутствующих в сыворотке как больных, так и здоровых людей.
Радиоактивный вариант точечной дот-гибридизации с
Op ft
использованием Р-меченого ДНК-зонда выявляет около 10 молекул РНК ВКЭ, что соответствует 10 пг вирусной РНК. Однако, он не нашел широкого применения в клинике ввиду проблем, связанных с нестабильностью метки и радиационной опасностью при работе с ней. ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Цель данной работы - создание нерадиоактивного высокочувствительного высокоспецифичного метода выявления РНК ВКЭ в клинических образцах. Для увеличения чувствительности использовалась полимеразная цепная реакция (ПЦР), высокую специфичность обеспечивали анализом продуктов ПЦР обратной дот-гибридизацией.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: I) получить мембраны с ковалентно присоединенными олигонуклеотидами-зондами для специфического связывания амплифици-рованного фрагмента; 2) сконструировать праймеры, меченные биоти-ном, эффективно и специфично инициирующие реакции обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР, универсальные для исследования широкого спектра штаммов ВКЭ; 3) разработать технологию получения стрептавидина, необходимого для синтеза его коныогатов с ферментами, обеспечивающих выявление комплементарного дуплекса; 4) оптимизировать условия гибридизации биотинилированного амплифицированного фрагмента кДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами и последующего выявления гибрида; 5) апробировать созданный метод выявления РНК ВКЭ в кли-
гоческих образцах (индивидуальные клещи, кровь больных).
Научная новизна и практическая ценность, впервые для использования в гибридиз анионном анализе получены аффинные мемораны на основе отечественного полимерного материала - лавсана с ковалентно присое динёнными олигонуклеотидами, способными образовывать прочные комплементарные комплексы. Аффинные лавсановые мемораны были применены при выявлении определённых нуклеотидных последовательностей, также они могут быть использованы для выявления точечных мутаций и выделения индивидуальных НК.
Для биотинилирования олигонуклеотидов по предварительно введенной аминогруппе спейсера впервые использованы водорастворимые реагенты (2-нитро-4-сульфофеншговый и п-сульфотетрафторфениловый эфиры биотина), позволяющие получать продукты с высокими выходами в течение 1 ч в водно-щелочной среде (рН 9.2), благодаря тому, что время аминолиза данных реагентов на порядок меньше времени их гидролиза.
Впервые получена кДНК (1427 нуклеотидных звеньев) с РНК ВКЭ штамма Софьин с использованием в качестве ревертазы фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I и осуществлена последующая амплификация фрагмента кДНК в но нуклеотидных звеньев.
Разработан практически важный нерадиоактивный метод для выявления РНК ВКЭ в клинических образцах, основанный на обратной дот-гибридизации в сочетании с реакциями ОТ и ПЦР с биотинилированными праймерами. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, универсален для исследования широкого спектра штаммов ВКЭ. Практическая ценность разработанного метода продемонстрирована на примерах выявления вирусной РНК в индивидуальных клещах и крови больных.
Предложен способ выделения стрептавидина с высоким выходом гель-хроматографией на Сефадексах типа G, что исключает очистку на аффинных сорбентах., получение которых трудоёмко. Полученный стреп-тавидин может использоваться в генно-инженерных работах и в ИФА. Производство стрептавидина внедрено в НИКТИ БАВ. Публикации и апробация работы. по материалам диссертации опубликовано 3 работы, получены положительные решения по з заявкам на изобретения. Результаты докладывались на Международном симпозиуме по проблемам и перспективам применения синтетических
олигонуклеотидов (Москва, 1991); II Всесоюзной конференции "Геном человека-91" (Переславль-Залесский, І99Г).
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 15Л страницах машинописного текста, состоит из введения, двух глав, выводов и списка цитируемой литературы из 176 наименований, содержит 7 таблиц и 24 рисунка.