Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 17
1.2 Эпидемиология ротавирусной инфекции 20
1.3 Патогенез ротавирусной инфекции 21
1.4 Профилактика ротавирусной инфекции 31
1.4.1 Живые аттенуированные противоротавирусные вакцины 31
1.4.2 Кандидатные вакцины на основе инактивированных ротавирусов 37
1.4.3 Кандидатные противоротавирусные вакцины на основе рекомбинантных белков 42
1.5.1 Флагеллин бактерии рода Salmonella 42
1.5.2 CRM197 - нетоксичный вариант дифтерийного токсина 45
1.6 Гибридные белки, содержащие фрагменты белков капсида VP6, VP8 ротавируса группы А в качестве активного агента кандидатной вакцины для профилактики ротавирусной инфекции 52
2. Материалы и методы 55
2.1 Плазмидная ДНК рЕТ-28а(+) 55
2.2 Бактериальные штаммы 56
2.3 Штаммы вируса 56
2.4 Лабораторные животные 57
2.5 Реакции ферментативной модификации ДНК 57
2.5.1 Синтез последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 57
2.5.2 Амплификация генов vp6vp8 и flicvp6vp8 58
2.5.4 Лигирование фрагментов плазмидной ДНК 60
2.6 Микробиологические методы 60
2.6.1 Приготовление компетентных клеток E.coli для трансформации 60
2.6.2 Трансформация бактериальных клеток 61
2.6.3 Скрининг рекомбинантн ых клонов на наличие тре буемой плазмидной ДНК 61
2.6.4 Индукция экспрессии генов, кодирующих гибридные рекомбинантные белки 62
2.6.5 Автоиндукция экспрессии 0,2% лактозой по методу Штудиера 63
2.7 Анализ и очистка нуклеиновых кислот 63
2.7.1 Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле 63
2.7.2 Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля 63
2.7.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 64
2.7.4 Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК по методу Сенджера 65
2.8 Анализ и очистка рекомбинантных белков 67
2.8.1 Электрофорез белков в денатурирующих условиях по Леммли 67
2.8.2 Определение концентрации белка по методу Лоури 67
2.8.3 Получение и отмывка телец включения 69
2.8.4 Иммобилизованная металлоаффинная хроматография 70
2.8.5 Гель-фильтрация 71
2.8.6 Определение остаточных белков штамма-продуцента 71
2.8.7 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента 72
2.8.8 Определение остаточных эндотоксинов 73
2.8.9 Расчет алифатического индекса 74
2.8.10 Western-blotting 74
2.8.11 Масс-спектрометрический анализ 75
2.9 Иммунологические методы 76
2.9.1 Определение иммуногенных свойств рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 76
2.9.2 Определение титра антител в сыворотках иммунизированных животных 77
2.9.3 Определение титра антител к антигенам ротавируса в сыворотках крови иммунизированных животных 78
2.9.4 Реакция нейтрализации вируса в культуре клеток 80
2.9.5 Исследование иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197 81
2.9.6 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo 82
2.9.7 Определение ротавирусного антигена методом иммуноферментного анализа 85
2.9.8 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo 87
2.10 Статистический анализ полученных результатов 89
2.11 Компьютерные методы анализа данных 89
3. Результаты 91
3.1 Получение белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 91
3.1.1 Моделирование белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 91
3.1.2 Создание нуклеотидных последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 97
3.1.3 Создание и анализ плазмидных ДНК pET-28a(+)-vp6vp8 и pET-28a(+)-flicvp6vp8 и штаммов E.coli для их амплификации 98
3.1.4 Создание штаммов-продуцентов гибридных белковVP6VP8 и FliCVP6VP8 101
3.1.5 Индукция экспрессии гибридных генов vp6vp8 и flicvp6vp8 и оценка локализации гибридных белков в клетках штаммов-продуцентов 102
3.1.6 Очистка гибридных рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 111
3.1.7 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 115
3.1.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 119
3.1.9 Определение остаточного белка штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 120
3.1.10 Определение остаточных эндотоксинов штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 122
3.2 Получение и характеристика рекомбинантного белка CRM197 122
3.2.1 Расчет алифатического индекса и индекса GRAVY для рекомбинантного белка CRM197 123
3.2.2 Индукция экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный CRM97 123
3.2.3 Очистка рекомбинантного белка CRM197 с использованием металлоаффинной хроматографии 137
3.2.4 Диализ препарата высокоочищенного белка CRM197 138
3.2.5 Определение подлинности рекомбинантного белка CRM197 138
3.2.6 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного белка CRM197 139
3.2.7 Определение остаточных белков штамма-продуцента 142
3.2.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента 142
3.2.9 Определение содержания бактериального липополисахарида 143
3.3 Результаты исследования рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro 144
3.3.1 Иммуногенная активность рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 144
3.3.2 Определение титра антител к ротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 148
3.3.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 150
3.3.4 Определение иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197 153
3.3.5 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo 155
3.3.6 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo 162
4. Обсуждение результатов 169
4.1 Введение 169
4.2 Получение рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 170
4.2.1 Молекулярный дизайн и клонирование последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 в плазмиде pET-28a(+) 170
4.2.2 Динамика биосинтеза рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 в клетках E.coli 172
4.2.3 Очистка гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 с помощью металлоаффинной хроматографии и гель-фильтрации 175
4.2.4 Контроль качества полученных образцов рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 177
4.3 Получение и характеристика рекомбинантного белка-адъюванта CRM197 178
4.4 Анализ результатов, полученных при изучении рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro 180
4.4.1 Иммуногенные свойства гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 180
4.4.2 Титр антител к ротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 184
4.4.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8 185
4.4.4 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo 186
4.4.5 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo 188
Заключение 190
Выводы 193
Список литературы 194
Список условных сокращений и обозначений 219
- Патогенез ротавирусной инфекции
- Моделирование белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
- Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo
- Иммуногенные свойства гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
Патогенез ротавирусной инфекции
Клетки, выстилающие тонкий кишечник, делятся на два типа: энтероциты и клетки крипт. Энтероциты, располагающиеся на а пикальной части ворсинки, представляют собой зрелые, не пролиферирующие клетки, которые дифференцированы для абсорбции и переваривания. Эти клетки синтезируют большое количество дисахаридаз, пептидаз и других ферментов, которые обеспечивают пищеварительные функции. Абсорбция энтероцитами осуществляется и посредством пассивной диффузии по электрохимическому или осмотическому градиенту, и путем активного транспорта. Хотя большая часть воды переносится по осмотическому градиенту, она может переноситься и транспортерами, например, натрий-глюкозным ко -транспортером 1. У клеток крипт отсутствуют явно выраженные микроворсинки и абсорбционная функция, они активно секретируют ионы Cl- в просвет кишечника. В норме в результате координированной работы клеток крипт и ворсинок обеспечивается постоянный двунаправленный поток воды и электролитов через эпителий. На вершине ворсинки баланс сдвинут в сторону абсорбции, в крипте – секреции.
Подавляющее большинство данных о патогенезе ротавирусной инфекции получено в исследованиях на модельных животных. Ротавирусы реплицируются в зрелых энтероцитах (Рисунок 2), располагающихся на вершине ворсинки, что говорит об экспрессии данными клетками факторов, необходимых для эффективных инфицирования и репликации [46]. Степень тяжести и локализация ротавирусной инфекции варьирует в зависимости от вида животного и в разных исследованиях. Однако следует отметить, что патологические изменения практически всегда ограничены тонким кишечником. В различных моделях ротавирусная инфекция характеризуется либо отсутствием видимых изменений, небольшими поражениями, такими как васкуляризация эпителия тонкого кишечника, или тяжелыми поражениями, такими как гиперплазия кле ток крипт и слипание ворсинок. Хотя, в общем, в сравнении с вызываемым другими кишечными патогенами, воспаление в процессе ротавирусной инфекции является умеренным.
Ротавирусная инфекция изменяет функционирование эпителия тонкого кишечника, результатом чего является диарея. Считается, что диарея возникает из-за нарушения всасывания, что вторично приводит к деструкции энтероцитов. В результате нарушения всасывания происходит перемещение непереваренных моно- и дисахаридов, жиров и белков в ободочную кишку. Непереваренный комок пищи является осмотически активным, эпителиальные клетки ободочной кишки не способны поглотить достаточное количество воды, что приводит к диарее [71].
Процесс, ведущий к диарее, начинается, когда ротавирус присоединяется к энтероцитам тонкого кишечника и инфицирует их. Присоединение опосредовано последовательным взаимодействием VP4 и VP7 ротавируса с серией рецепторов, часть из которых несет сиаловые кислоты. После проникновения в клетку вирус теряет наружный капсид, затем высвобождаются его генетические сегменты. Активируется вирион-ассоциированная транскриптаза, и начинается синтез вирусных макромолекул. Вирусные белки и РНК концентрируются в цитоплазме, называемой вироплазмой, где происходит репликация РНК и ее упаковка в капсид [143].
Отличительной чертой ротавирусной инфекции является существенное повышение цитозольного уровня ионов кальция (Ca2+) в р езультате увеличения высвобождения ионов Ca2+ из ЭПР и увеличения притока Ca2+ через плазматическую мембрану. Повышенный уровень кальция необходим для обеспечения процесса репликации ротавируса, включая активацию аутофагии, формирование реплицирующих комплексов ротавируса и сборку наружного капсидного белка VP7 [48, 162, 166]. Было показано [87], что ротавирус -опосредованное истощение пула ионов кальция в ЭПР активирует сенсорный белок ЭПР, называемый молекулой стромального взаимодействия 1 (STIM1) и STIM1, в свою очередь, индуцирует приток Ca2+ через контролируемый кальцием канал (SOCE), который в норме играет роль гомеостатического клеточного сенсора поддержания уровня кальция в ЭПР. Активности виропорина NSP4 достаточно для активации STIM1, но мутанты NSP4, которые не обладают способностью формировать ионный канал, не активируют STIM1 и не индуцируют приток Ca2+ через SOCE. Активность бел ка NSP4 ответственна за снижение уровня ионов кальция в ЭПР ротавирус-инфицированных клеток и является триггером для повышения уровня кальция в цитозоле, что имеет решающее значение для репликации ротавирусных частиц.
Показано, что в формировании ионного канала принимает участие домен VRI белка NSP4. Ионный канал, который образует белок NSP4 является катионоселективным, он может проводить как одновалентные, так и двухвалентные катионы, включая Ca2+ и Ba2+ [148].
Внутриклеточное увеличение концентрации Са 2+ запускает множество клеточных процессов, вк лючая повреждение сети микротрубочек цитоскелета, снижение синтеза дисахаридаз и других ферментов на апикальной поверхности клеток, ингибирование Na+ - ко-транспортерной системы и некроз клеток [72]. NSP4 выбрасывается по Ca2+-зависимому пути секреции до лизиса клеток. Это приводит к нарушению всасывания, ингибированию Na+ - ко-транспортерной системы и снижению экспрессии пищеварительных ферментов на апикальной поверхности клеток.
В результате высвобождения белка NSP4 из инфицированных клеток осуществляется паракринный эффект на неинфицированные клетки. NSP4 прикрепляется к этим клеткам, взаимодействуя со специфическим рецептором, и запускает каскад инозитол-1,3,5-трифосфата, в результате чего запускается выброс Са2+ из эндоплазматического ретикулума, таким образом увеличивается его внутриклеточная концентрация. Одним из результатов действия NSP4 на энтероциты является нарушение плотных контактов между ними, что приводит к межклеточной проницаемости. При действии NSP4 на клетки крипт происходит увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, что ведет к активации секреции клетками крипт, опосредованной Cl- - транспортером, что также делает свой вклад в развитие диареи.
Показано, что неструктурный вирусный белок NSP4, секретируемый фрагмент NSP4 и некоторые NSP4 пептиды имеют токсиноподобное действие и инициируют диарею при введении лабораторным мышам [20, 195]. Энтеротоксическая активность NSP4 обеспечивает в озникновение диареи в отсутствие значительных повреждений эпителия кишечника, либо опосредовав изменения в инфицированных сайтах. Секретируемый NSP4 или другие эффекторные молекулы, выбрасываемые из инфицированных клеток, могут также стимулировать нервную систему кишечника (ENS – enteric nervous system). Не так давно было показано, что некоторые лекарственные препараты, которые блокируют активность ENS, ослабляют ротавирус-опосредованную секрецию в тонком кишечнике, что предполагает активную роль ENS в ротавирусной диарее [116, 117]. По некоторым оценкам, порядка 67% жидкости и электролитов, секретируемых при ротавирусной диарее в экспериментах с мышами, вызваны активацией ENS.
Установлено, что ротавирусы препятствуют синтезу интерферонов, а также продуктов генов, экспрессию которых и ндуцируют интерфероны, главным образом благодаря действию NSP1, единственного белкового продукта 5 сегмента вирусного генома [133]. NSP1 является наименее консервативным из 12 ротавирусных белков. Однако белки NSP1 ротавирусов группы А имеют аналогичную вторичную структуру и относительно консервативный N-концевой домен RING [18]. С -конец белка NSP1 является вариабельным (С-концевой субстрат-распознающий домен), благодаря данному участку происходит запуск протеасомальной деградации белков зараженной клетки, вовлеченных в сигналинг, результатом которого является синтез интреферонов и интерферон-индуцибельных белков [132]. Для запуска механизма протеасомального расщепления NSP1 ротавирусов человека в качестве мишени используют белок rCP (белок, содержащий -трансдуциновый повтор), который необходим для активации транскрипционного фактора NF-B.
Белок NSP1 ротавирусов человека и свиньи распознает rCP посредством аминокислотной последовательности DSGXS в С-концевом домене (Рисунок 3В). Эта последовательность имитирует мотив, присутствующий в ингибиторе транскрипционного фактора NF-B (IB) [132]. При связывании ингибитора с NF-B происходит предотвращение перемещения гетеродимера NF-B p65-p50 из цитоплазмы в ядро, где NF-B запускает синтез интерферонов и интерферон-индуцибельных белков (Рисунок 3A) [80]. Индукция сигнальных каскадов врожденного иммунного ответа вирусами и другими патогенами вызывает фосфорилирование ингибитора транскрипционного фактора NF-B киназным комплексом IKK. Распознавание фосфорилированного IB белком rCP, запускает убиквитинилирование IB и его протеасомальную деградацию, в результате чего происходит транслокация транскрипционного комплекса в ядро и запуск экспрессии генов [190]. Присоединяя rCP, белок NSP1 может изменять взаимодействие rCP с фосфорилированным IB, тем самым препятствуя деградации IB и активации NF-B.
В более раннем исследовании говорится о том, что диарея - результат нарушения всасывания, вызванного повреждением эпителия ворсинок [141]. При этом наблюдается повышенный уровень простагландина Е2 в инфицированном сайте, и стимуляция секреции простагландином Е2 [199].
Моделирование белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
Основываясь на данных эпидемиологических исследований, для дизайна иммуногена были выбраны ротавирусы группы А. Последовательности белков VP6 и VP8 б ыли получены из базы данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/. Были выбраны консервативные участки аминокислотных последовательностей белков, характерные для всех ротавирусов группы А. Далее эти участки анализировали на наличие в них Т и В клеточных эпитопов.
Для анализа использовали пакет программ Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0. В результате были выбраны участки, содержащие В клеточные эпитопы, представленные в таблице 8.
Анализ наличия Т клеточных эпитопов осуществлялся с помощью IEDB Analysis Resource. Были выбраны эпитопы, характеризующиеся процентилем менее 2,19. Согласно оценке с ипользованием программы IEDB Analysis Resource указанные последовательности имеют наибольшую аффинность при связывании. Результаты представлены в таблице 9.
Участки аминокислотных последовательностей, содержащих предсказанные эпитопы, были объеденены в кандидатную структуру иммуногена, после чего было осуществлено пространственное моделирование полученного гибридного белка.
Спланированные гибридные полипептиды являются сложными мультидоменными белками. Белок FliCVP6VP8 содержит 4 домена: FliC1, FliC2, VP6, VP8, белок VP6VP8 - 2 домена VP6 и VP8. Для моделирования мультидоменных белков были произведены следующие действия:
1. Определение границ доменов
2. Построение модели целого белка для определения ориентации доменов
3. Построение моделей для каждого домена (с использованием образцов 3D структур и ab initio)
4. Докинг моделей с использованием модели целого белка.
В спланированном гибридном полипептиде FliCVP6VP8 два домена имели образцы (FliC1, FliC2), а два нуждались в ab initio моделировании (VP6, VP8), кроме этого, в ab initio моделировании требовалось сформировать гибкие мостики между доменами.
Для получения наиболее приближенных к реальности результатов в автоматическом режиме использовали алгоритм Iasser, признанный лучшим на последних трех CASP (Critical Assessment of Protein Structure Prediction) – соревнованиях по моделированию белков. Данный анализ проводился в течение четырех дней . Однако даже с использованием данного мощного алгоритма получение адекватных данных для мультидоменного белка с необходимостью ab initio моделирования доменов и их границ не полностью достоверно (75%) [192] [196].
Для получения более точных данных разбили белок на используемые домены, провели их моделирование с использованием Iasser и далее провели их докинг.
Смоделированный гибридный белок VP6VP8 состоит из 175 а.о. (Рисунок 8).
10 20 30 40 50 60
MDVLFSLSKT LKDARDKIVE GTLYSNVSDL IQQFNQMIIT MNGNDFQTGG IGNLPIRNWN
70 80 90 100 110 120
FDFGLLGTTL LNLDANYVET ARTTIDYFID FVDNVCMDEM ARESQRNGIA GGGSGGGSTI
130 140 150 160 170 NNDNSNVSSD AEFYLIPQSQ TAMCTQYINN GLPPIQNTRN IVPVNITSRQ IKDIR
Анализ аминокислотной последовательности данного белка с помощью программы ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показал, что гибридный белок стабилен и имеет молекулярную массу 19,4 кДа, pI 4,41.
С использованием алгоритма Iasser были получены варианты пространственной структуры белка VP6VP8. Наиболее вероятная модель представлена на рисунке 9 [158, 191, 192, 196].
Анализ аминокислотной последовательности данного белка с помощью программы ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показал, что гибридный белок стабилен и имеет молекулярную массу 48,6 кДа, pI 4,6.
C помощью программы Sequence Manipulation Suite: Protein GRAVY был рассчитан индекс GRAVY для рекомбинантного белка VP6VP8, который составил -0,279 и -0,344 для рекомбинантного белка FliCVP6VP8.
С использованием алгоритма Iasser были получены модели пространственной структуры белка FliCVP6VP8. Наиболее вероятная м одель представлена на рисунке 11 [158, 191, 192, 196].
Для предотвращения развития побочных аутоиммунных реакций при вакцинации, проводили оценку гомологии аминокислотных последовательностей разработанных иммуногенов с белками человека. Анализ проводили с использованием программы Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), результаты представлены на рисунке 12.
Как видно из представленных данных, гомологии аминокислотных последовательностей разработанных иммуногенов не обнаружено ни с одним из белков протеома человека.
Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo
Для изучения протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 в экспериментах in vivo, предварительно была разработана лабораторная модель ротавирусной инфекции на мышах линии Balb/c.
Исследования были выполнены на 60 6-8 недельных мышах линии Balb/c. Животных заражали перорально вирусом EDI в различных разведениях, которые готовили из исходного материала. Каждым разведением вируса заражали 10 особей. После заражения за животными устанавливали динамическое наблюдение в течение 14 суток, ежедневно отмечая количество заболевших и павших животных. Полученные данные представлены в таблице 17.
Из представленных в таблице 14 данных видно, что разведение суспензии вируса EDI равное 10-4 является максимальным, при з аражении которым происходит 100% гибель животных. Для выяснения активности вируса в данном разведении, его суспензию вносили на культуру клеток линии BHK-21 и в дальнейшем определяли количество бляшкообразующих единиц (БОЕ). В ходе исследований установлено, что активность вируса в данном разведении составила 1 х 104 БОЕ.
Поскольку при оценке эффективности вакцинных препаратов, как правило, используют дозу возбудителя, в 100 раз превышающую 1 ЛД50, то по результатам проведенных исследований рабочая доза вируса составила 1 х 106 БОЕ.
Результаты оценки выделения ротавирусного антигена инфицированными животными представлены в таблице 18.
Исследование протективных свойств разработанного рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при в нутримышечном введении с адъювантом и без него лабораторным животным оценивали в том числе и по формированию ротавирусспецифичных антител IgG и IgA. Уровень антител оценивали в сыворотках крови и смывах кишечника. Результаты представлены в таблицах 19а и 19б.
Таким образом, защита от ротавирусной инфекции при внутримышечной иммунизации рекомбинантным белком FliCVP6VP8, а также коммерческой вакциной сопровождалась формированием специфических антител IgG и IgA на слизистой оболочке кишечника и сыворотке крови опытных животных.
Иммуногенные свойства гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
Иммуноглобулины входят в гамма-глобулиновую фракцию белков крови, они являются гликопротеинами, которые играют важную роль в работе иммунной системы организма. Выделяют 5 классов антител (IgA, IgG, IgM, IgE, IgD), которые отличаются пространственной структурой и биологическими функциями. Выработка антител зрелыми В -лимфоцитами (плазматическими кл етками) происходит в ответ на воздействие антигенов бактерий, вирусов, грибов , паразитов и других органических веществ, которые воспринимаются организмом как чужеродные. При первичном распознавании чужеродных агентов иммунной системой организма, происходит стимуляция выработки В -лимфоцитами специфических антител, которые связывают и нейтрализуют антигены. В результате формирования иммунологической памяти, при повторном поступлении в организм антигена, ответ на него формируется в короткие сроки и сопровождается выработкой высокого титра иммуноглобулинов, что препятствует развитию заболевания.
Первой линией ответа гуморальной системой организма является выработка специфичных антител IgM, их синтез начинается сразу после проникновения инфекции в организм. Антитела IgM определяются уже через 5 дней после инфицирования и достигают пика в промежутке от одной до четырех недель, затем снижаются до диагностически незначительных уровней в течение нескольких месяцев даже в отсутствии лечения.
Иммуноглобулин G (IgG) является наиболее распространенным типом иммуноглобулинов в крови как людей, так и мышей, являющихся широко используемыми животными в доклинических исследованиях. Как неотъемлемой частью адаптивного звена иммунного ответа, антитела IgG играют важную роль для элиминации бактериальных и вирусных инфекций, но они также участвуют в патогенезе аутоиммунных нарушений таких как системная красная волчанка и ревматоидный артрит [138]. Длительный период полужизни в сыворотке крови и широкий спектр эффекторных функций делают антитела класса IgG перспективными молекулами для разработки лекарственных средств для терапии различных видов заболеваний. В то время как антитела IgG были впервые использованы в качестве нейтрализующих агентов при лечении инфекционных заболеваний, в последнее время они стали центральными компонентами таргетной терапии благодаря своей высокой специфичности и способности проникать в ткани [159].
Специфичные IgG вырабатываются в ответ на воздействие определенного антигена и начинают синтезироваться при первичном контакте с ним, но позже, чем антитела класса IgМ. Зате м количество IgG постепенно увеличивается в течение нескольких недель после начала инфекции, затем снижается до уровня, который в норме в течение долгого периода сохраняется в крови. Повторное воздействие антигена вызывает быструю выработку высокого титра специфичных антител IgG, что препятствует развитию инфекции. Данное свойство иммунного ответа взято за основу при проведении вакцинации с использованием антигенов различных патогенов.
У человека в рамках класса антител IgG выделяют четыре субизотипа, названные в порядке уменьшения их количества IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Субизотипы иммуноглобулина IgG были обнаружены в 60х годах прошлого века при исследованиях с использованием специфичной кроличьей антисыворотки к белкам миеломы человека [164].
Путь, с помощью которого антиген попал в организм, а также его химическое строение определяют тип формирующегося иммунного ответа и, в том числе, спектр продуцируемых субизотипов IgG. Кроме прямой активации В-клеток самим антигеном, свой вклад в дифференциацию В -лимфоцитов вносят такие реакции, как распознование ПАМП Толл-лайк рецепторами, цитокины, продуцируемые другими лимфоцитами и антиген презентирующими клетками [150]. Например, белковые антигены обычно запускают активацию Т-клеток через МНС II класса, экспрессируемых на В -клетках. В этом случае , как правило, наблюдается формирование субизотипов IgG1 и IgG3, в некоторых случаях - IgG4 и IgЕ [26].
Гуморальный ответ на растворимые белковые антигены в первую очередь выражается формировании специфичных антител IgG1 и в значительно меньшей концентрации антител субизотипов IgG3 и IgG4 [60]. Синтез иммуноглобулинов субизотипа IgG2 активируется в ответ на бактериальные полисахариды [170]. Антитела субизотипа IgG3 обладают мощным провоспалительным действием, которое регулирует уровень формирующегося воспалительного ответа [126]. Аллергены, как правило, помимо антител класса IgE стимулируют формирование антител IgG1 и IgG4. Кроме того, иммуноглобулины субизотипа IgG4 формируются в процессе повторного или длительного экспонирования антигена в условиях отсутствия инфекционного процесса, и в таком случае они могут стать доминирующим субизотипом. Примером могут служить люди, долгое время занимающиеся разведением пчел, а также лица, склонные к аллергическим реакциям, получающие иммунную терапию [8][9][10]. Также показано, что индукцию выработки высокого титра IgG4 могут вызывать гельминты и филармозные паразиты [11] [142], при этом, формирование IgG4 связано с бессимптомной инфекцией [105].
У мыши существует четыре различных субизотипа IgG, а именно: IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 [59]. Они выполняют различные функции в организме, так, например, IgG1 регулирует фиксацию компонентов комплемента. Переключение реакции антител с IgM к одному из других субизотипов зависит от различных цитокинов. Гамма-интерферон, продуцируемый T-хелперами-1 индуцирует формирование антител IgG2a и IgG3; интерлейкин-4 (ИЛ-4), вырабатываемый Т-хелперами-2 селективно стимулирует формирование IgG1 и IgE. Проведение аналогии между подклассами IgG мыши и человека основано на сходстве строения и биологической активности. IgG2a и IgG2b мыши и IgG1 и IgG3 человека разделяют способность фиксировать комплемент и связывать белковые антигены. Антитела IgG1 мыши и IgG4 человека считаются похожими из-за их свойства связывания с тучными клетками. Мышиный IgG3 и человеческого IgG2 распознают преимущественно углеводные эпитопы [125] [85].
Исследование иммуногенных свойств гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8, проведенное на самках мышей линии Balb/c, показало, что данные белки стимулируют выработку высокого титра специфических антител, причем для его формирования достаточно двух внутримышечных введений белка FliCVP6VP8 и трех введения белка VP6VP8.
Такие результаты были ожидаемы, поскольку компонент гибридного рекомбинантного белка FliCVP6VP8 FliC состоит из участков флагеллина – FliC1 и FliC2, которые использовались в данной работе в качестве адъюванта. Исследования разных групп ученых показали, что флагеллин обладает мощными адъвантными свойствами как в составе слитых белков , так и при совместном введении с белками. Основой адъювантного действия флагеллина является наличие TLR5 на различных типах клеток врожденного и приобретенного иммунитета. Большинство адъювантов, включая агонисты TLR, опосредуют их активность, ч астично, путем активации врожденного звена иммунной системы, включая активацию, созревание и привлечение дендритных клеток к Т-лимфоцитам в лимфатических узлах. Кроме того флагеллин стимулирует индукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов. Было также показано, что наличие компонентов флагеллина в составе вакцин способствует индукции цитокинов и хемокинов, которые стимулируют привлечение Т- и В-лимфоцитов в лимфатические узлы и презентацию целевого антигена [76].
Действительно, гибридный рекомбинантный белок FliCVP6VP8 стимулировал образование более высокого титра антител у испытуемых животных, по сравнению с белком VP6VP8 после второго введения препаратов, содержащих данные белки (титр антител был, соответственно, равен 1:102400 и 1:25600). Полученный нами результат согласуется с литературными данными и еще раз подтверждает мощные адъювантные свойства рекомбинантного флагеллина при введении его в составе иммуногена.
Анализ спектра субизотипов специфических антител IgG, формирующихся в ответ на двукратное внутримышечное введение рекомбинантного белка FliCVP6VP8 в отдельности или совместно с рекомбинантным белком CRM197, говорит о том, наблюдается иммунный ответ, характерный для белковых антигенов. Доминирующими являются антитела субизотипа IgG2a, ответственные за связывание белковых антигенов, и не выявляются антитела субизотипа IgG3, связывающие преимущественно углеводные антигены. Невысокий титр специфичных IgG1 говорит о потенциально низкой активации тучных клеток в ответ на введение иммуногенов и их вероятной низкой аллергизующей активности. Кроме того отличительной чертой ф ормирующегося иммунного ответа является низкий уровень специфических антител IgG2b, которые в случае иммунизации животных рекомбинантным белком FliCVP6VP8 в отдельности не отличаются от контроля.