Введение к работе
Актуальпость проблемы. Микрокалориметрия является одним из мощных физико-химических методов, широко применяемым для решения различных биохимических проблем. Это единственный прямой метод определения тепловых эффектов биохимических реакций. Внедрение, в биохимические исследования нового выеокочувствитслыюго микроаалориметрмческого оборудования, способного работать в титрациотгом, проточном, амггульном и других экспериментальных режимах определяет актуальность разработки методических аспектов применения современной микрокалориметрии в биохимии.
Все биохимические реакции могут быть разделены с точки зрения
использования микрокалориметрии на два класса. Первый класс - это реакции,
которые в условиях эксперимента могут быть доведены практически до полного
завершеній т.е. константа равновесия изучаемой реакции такова что допускает
яракпгтески полное превратите исходных веществ в продукты реакции. Под
словами "практически полное превращение" мы в данном случае понимаем то, что
точность микрокалориметрического метода недостаточна для подтверждения
неполноты протекания реакции (например, если погрешность
микрокалориметрического метода 1%, мы не можем достоверно сказать составляет ли глубина конверсии 99% или 99,9%). При мшсрокалориметрическом изучении первого класса реакций на основании результатов эксперимента может быть получен только один термодинамический параметр - энтальпия.
Ко втором классу реакций обычно относят процессы, которые в условиях эксперимента не могут быть доведены до полного завершеній по термодинамическим причинам, т.е. это заведомо обратимые реакции. Если в первом случае (первый класс) один единственный эксперимент дает представление об энтальпии процесса, то во втором - только совокупность экспериментальных точек, полученная методом микрокалориметрического титрования позволяет рассчитать термодинамические параметры исследуемого процесса. Во втором случае мы сталкиваемся с необходимостью специальной математической обработки результатов и выбором модели, которая должна адекватно описывать рассматриваемый процесс.
Следует отметить, что указанное выше делеіше реакций на два класса весьма условно и всегда относится к дашіьім конкретным условиям проведения
2.
эксперимента. При других физико-хишгееских условиях, "необратимая" реакции может стать "обратимой" и наоборот.
Методологические аспекты использовашш микрокалорішетрик для изучения необратимых реакций рассмотрены нами на примере различных типов энзимологических реакций. При исследовании многих энзимологических процессов представляется возможным подобрать физико-химические условия при которых степень конверсии исходных субстратов в конечные продукты будет превышать 99%. Поскольку, как уже отмечено выше, точность в определении энтальгош реакции после введения всех необходимых поправок редко превышает 1%, реакции, имеющие степень конверсии более 99% можно рассматривать как необратимые.
Исследование различных типов энзимологических реакций позволило нам не только разработать методологические аспекты микрокалориметрического эксперимента в случае необратимых биохимических реакций, но и определить ряд ключевых термодинамических величин (например энтальпию реакции окисления-восстановления НАД), с помощью которых молено рассчитывать значения термодинамических параметров неизученных реакций на основе литературных данных.
Методологические аспекты использования микрокалориметрии прк исследовании обратимых реакций рассмотрены нами на примере реакций связывание органических лигандов с водорастворимыми макроциклическими молекулами. Е качестве макроциклов, связывающихся преимущественно с алифатическим фрагментами оргшшческих молекул, нами выбраны а- ,р- и у-Циклодакстрины состоящих из 6, 7 и 8 глюкозидиых остатков соответственно, (рис. 1). В качеств! макроциклов, образующих прочные связи преимуществегаю с ароматическим кольцами, входящими в состав молекул лигандов, наші исследовань водорастворимый порфирин (рис. 2) и водорастворимый макроцикл, способный і интеркалированию (рис. 3).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлас разработка методологии применения современной микрокалориметрии в изучени обратимых и необратимых биохимических реакций, а также экспериментально определеівіе ключевых термодинамических величин и выявление взаимосвязи межд термодинамическими величинами и структурой веществ, участвующих в различны типах биохимических процессов.
ш %
ъ#
Рис. 1. Структурные формулы а- р- и 7-щшю декстринов.
Рис. 2. Структурная формула водорастворимого порфирина.
х
1-ЄН* X = Y = H
М,чАЛ^ YNH
Рис. 3. Структурная формула макроцикла способного к интсркалнрованию.
ч.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: разработать методологические аспекты применения современной микрокалориметрии в биохимии при изучении необратимых реакций;
разработать принципы построения системы термодинамических шраметров ферментативных реакций в соответствіш со схемой класификацди и номенклатуры ферментов Международного биохимического союза (МБС);
экспериментально определить ключевые термодинамические величины для ферментативных реакций с участием кофакторов (например, НАД) и средние термодинамические параметры для ферментативных реакции, протекающих без участия кофакторов (например, для гидролитических реакций);
разработать методологические аспекты применения современной микрокалориметрии в биохимии при изучении обратимых реакций;
экспериментально определить термодинамические параметры реакций комллексообразования различных по своей структуре органических лигандов с а- , р-и у-циклодскстршЕши, связывающихся преимущественно с алифатическими фрагментами органических молекул, а также макроциклов, образующих прочные связи преимущественно с ароматическими кольцами, входящими в состав молекул лигандов,.
Научная повнішії. Основными результатами диссертационной работы явились:
1. Создание системы термодинамических параметров ферментативных реакций и экспериментальное определение ключевых термодинамических величин для ферментативных реакций с участием кофакторов (специально следует отметить выполненное нами определение энтальпии реакции окисления-восстановления НАД) и средних термодинамігческих величин для ферментативных реакций, протекающих без участия кофакторов (нами были определены средние энтальпии реакций гидролиза амидных, пептидных, глюкозидных и других связей в различных биохимических соединениях; предложенная нами система средни? термодинамических величин практически охватывает все процессы гидролиза, такю компонентов живой материи как белки, нуклеиновые кислоты, жиры і полисахариды). Многие термодинамические параметры определены нами впервые
5.
2. Впервые были определены термодинамические параметры комплексообразования водорастворимого порфнрина (см. рис. 2) и водорастворимого макроціткла, способного к шггеркалированию (см. рис. 3), с широким кругом ароматических органических лигандов. Значительно расшігрен круг органических лигандов, исследованных микрокалориметрическим методом, при протекании, их реакций с циклодекстринами. Выполненные наші систематические термодинамические исследования охватывают следующие классы органических молекул-лигавдов: а) производные циклогсксанола и другие алифатические циклические спирты, б) алифатические первичные и вторичные егдгрты, а также алифатические кислоты и амины, в) различные производные фенэтиламина, эфедрина и некоторые другие структурно сходные ароматические соединения, содержащие бензольное кольцо, г) ароматические соединения, содержащие пуриновые, пиримидиновые и имидазольные кольца и д) стереоизомеры различных органических соединений.
Теоретическая и практическая значимость работы. Систематически подход к выбору объектов исследовании позволил нам выявить ряд закономерностей, характеризующих связь между термодинамическими параметрами реакций комплексообразования, с одной стороны, и особенностями структуры молекул-лигандов, с другой. На основе выявленных закономерностей представляется возможным с высокой надежностью оценивать термодинамические параметры связывания конкретного макроцикла с неисследованными лигандами, используя имеющийся экспериментальный материал.
Температурные зависимости термодинамических параметров реакций связывания гомологически близких лигандов с циклодекстринами предоставили нам возможность оценить влияние вкладов различных фрагментов данной молекулы лиганда в суммарные термодинамические параметры и рассмотреть некоторые аналогии между термодинамикой реакций с участием макроциклов и биополимеров.
Отметим также, что полученный нами экспериментальный материал был использован для построения графиков энтальпийно-эитронийной компенсацій! (как в случае ферментативных реакций, так и для реакций комплексообразования).
6.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на семи международных конференциях по калориметрии и хшдіческой термодинамике в Роннебай (Швеция, 1976), Мерзебурге (Германия, 1980), Праге (Чехия, 1982), Санта-Фе (США, 1993), Гейверсбурге (США, 1994), Чикаго (США, 1995), Бефесде (США, 1996), а также на многих всесоюзных конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 статей и одна монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи основных глав, в которых излагается наш собствекньгй: экспериментальный материал, проводится его обсуждение и сравнение с литературными данными, и выводов. Работа наложена на 230 страницах текста и содержит, кроме того, 87 рисунков, а также 49 таблиц. Списки литературы приведены отдельно в каждой из семи глав.