Введение к работе
Актуальность темы. Изучение особенностей генной экспрессии и соответствующего синтеза белков в разных видах тканей и органов человека, в частности органов моче-половой системы, является одной из интенсивно разрабатываемых областей биохимии. Большой интерес к белкам почки во многом обусловлен важностью функционирования этого органа для поддержания гомеостаза в организме, а также распространенностью и тяжестью почечной патологии. За последние десятилетия появились тысячи публикаций, которые были посвящены изучению белковых компонентов ткани почки. Например, активно изучалось распределение ряда ферментных систем в сегментах нефрона (Wrlgnt P. et al.,1990], калликреин-кининовой системы [Omata К. et al.,19821, процессов реабсорбции белка [Geibel J..1990; . 1, исследования гормональных рецепторов CKoeclln N. et al.»19893 и т.д. Много внимания уделялось и изучению изменений почечных белков при различных патологических процессах CLapln et al, 1989; Вельтищев Ю. В.. Игнатова Н. С., 1992].
Вместе с тем, в последние годы биохимические исследования белков приобрели некоторые новые черты. Вследствие развития представлений о связи между генами и кодируемыми ими белками, а также, благодаря развитию новых технологий изучения белков, возникло особое научное направление на стыке биохимии и биохимической генетики,, получившее название - "системный подход к изучению белковых продуктов генной экспрессии" (Anderson . Anderson, 1979; Шишкин С.С.,1985: Klose, 1989; .Cells et al, 1990]. Этот подход аккумулирует исследования, конечной целью которых является формирование каталога(ов) белков для всех типов клеток, тканей, органов и биологических жидкостей человека. Для достижения цели предполагается использовать широкий арсенал методов, центральное место среди которых отводится двумерному электрофорезу белков по О'Фаррел-лу (2ДЕ) [O'Farrell, 1975, 1977]. Обладая чрезвычайно высокой разрешающей способностью, 2ДЕ позволяет эффективно проводить разделение белковых смесей, состоящие из тысяч белков, и характеризовать их по независимым физико-химическим характеристикам - молекулярной массе (Mm) и изоэлектрической точке (pi).
Результаты 2ДЕ-анализа белков служат основой для составления соответствующих белковых каталогов, в которые стараются еклочить и всю биохимическую информацию, полученную при исследованиях белков традиционными методами (Klose. 1989; Cells et al. 1ЭЭЗ,15СЧ1.
Некоторые такие каталоги уже доступны для пользователей через компьютерные сети. (2-D PAGE databases [Cells et al. 19963 и SWISS - 2D PAGE databases [Hostrasser et al. 1996]). Обобщенная и бі тро расширяющаяся биохимическая информация о белках человека приобретает несомненную теоретическую и практическую значимость. Она становится основой изучения особенностей генной экспрессии в самых разнообразных обьектах. отражая специфику процессов диффе-ренцировки и развития. Кроме того, она ваша для изучения патогенеза заболеваний, создания эффективных методов их диагностики и . лечения. Сравнительный анализ белковых спектров нормальных и патологических образцов уже позволил обнаружить биохимические маркеры некоторых патологических состояний [ Miller, Harrison 1992; Hall. Matheson, 1994].
Пока лишь в очень немногих работах, посвященных изучению по-чечк х белков, использовалась стратегия системного подхода, что. вероятно, обусловлено морфологической сложностью строения почки (Smith et al. 1.980; Tracy et al. 1982; Ziai et al, 1984; Хасанбае-ва Г.Ш. и соавт.,19923. 2ДЕ-анализ суммарных белков почки человека практически не проводился, за исключением отдельных работ, . в которых оценивались способы получения морфо-функциональных структур,почки , были построены предварительные двумерные карты коркового вещества; клубочков и базальных мембран клубочков [Хасанбае-ва Г.Ш. и соавт,..1991: 1992]. Соответственно, исследования, направленные на получение более полной характеристики белкового состава почки и составляющих ее морфологических структур, имеют большой теоретический и практический интерес.
В данной работе построен новый вариант каталога и создан комплект двумерных карт, последовательно от суммарного гомогената белков почки человека к анатомическим отделам - корковому и мозговому- веществу почки, отдельным морфо-функциональным структурам (клубочки, проксимальные отделы канальцев и базалыше мембраны), а также' результаты идентификации некоторых белков, выявления белкового полиморфизма и признаков аутолитической деградации.
Цель и задачи исследования.Целью настоящей работы явилось изучение и выявление комплекса наиболее количественно представленных белков (белковых продуктов генной экспрессии), как в суммарной ткани почки, так и в отдельных морфо-функциональных структурах, а также сравнительное „ изучение генетически детерминированных осо-бзнностей строения ткани 'почек человека и линейных животных, признаков аутолитической деградации белков и изменений, обуслов-
ленных патологией.
Для достижения этих целей в работе решались следующие задачи:
-
На основе метода двумерного электрофореза по О'Фарреллу и ряда сопутствующих методов охарактеризовать физико-химические свойства комплекса наиболее представленных белков почки человека и ряда морфо-функциональных структур.
-
Построить двумерные карты и каталог белков почки человека. Используя полученные карты выявить наиболее представленные и специфичные белки отдельных морфологических структур (коркового и мозгового вещества, клубочков, канальцев, базальных мембран).
-
Идентифицировать ряд белков почки на двумерных электрофо-реграммах и изучить наличие полиморфных вариантов белков, как в ткани почки человека, так и у инбредных линий мышей.
-
Провести изучение и выявить белковые маркеры аутолитической деградации в ткани почки человека и инбредных линий мышей.
-
Проверить возможность использования полученных результатов для изучения изменений белкового состава почек человека'при патологии.
Научная новизна работы. Оптимизирован ряд методик получения отдельных морфологических структур почки человека и проведен 2ДЕ-анализ содержащихся в них белков. Построена новая версия обобщенного каталога почечных белков, включающего 175 белков, охарактеризованных по значениям Mm и pi. а также по ряду других параметров. Отличительными чертами построенного каталога являются использование унифицированной системы обозначений белков (что делает полученные материалы совместимым с построенным ранее .каталогом белков мышечной ткани человека [Kovalyov L. et al.. 1995]), а также существенное расширение белковых характеристик. В частности, определены белки, специфичные для отдельных морфо-Функцио-нальных структур почки, и осуществлена идентификация 9 почечных белков. При изучении вариабельности электрофоретических свойств полипептидных цепей почки человека и мыши обнаружено 9 полиморфных вариантов белков почки мыши, для которых выявились разные закономерности наследования у гибридов первого поколения.
Представлены новые данные о почечных белках, изменяющихся на ранних стадиях аутолиза, а также при различных патологических процессах в почках.
Теоретическая и практическая значимость работы. Охарактеризован комплекс из наиболее представленных почечных белков, который отражает особенности генной экспрессии в этом органе. Построенный
каталог почечных белков и двумерные карты позволяют вести целенаправленный поиск новых почечных белков, включая тканеспецифи-'ческие белки. Показано, что некоторые полипептидые фракции достаточно специфично локализуются в определенных морфо-функциональных структурах почки человека, и это открывает возможность их использования в качестве молекулярных маркеров при поражения отдельных почечных структур. Охарактеризованы ранние признаки протеолити-ческой деградации при аутолизе, как в ткани почки человека, так и в ткани почек лабораторных животных.
Полученные результаты могут быть использованы при изучении па
тогенеза различных болезней почки, что подтверждается проведенным
анализом изменений в белковом составе почек при развитии почечной
недостаточности разного генеза. '
Внедрение результатов работы. Практические рекомендации, разработанные на основании проведенного исследования применяются в практической работе кафедры биохимии Московской медицинской академии им, И.М.Сеченова, Москва; кафедры гистологии Северо-Осе-тинского государственного медицинского института. Владикавказ; Медико-генетическом научном центре РАМН, Институте биомедицинской химии РАМН; Москва; НИИ наследственных и врожденных заболеваний МЗ Белоруссии. Минск.
Основные положения, выносимые на зашиту.
-
Сформирован, двумерный электрофоретический каталог и карта основных наиболее представленных белков почки человека, включающий 145 полипетидных цепей. Все фракции охарактеризованы по координатам молекулярной массы и изоэлектрической точки. При изучении морфологических структур почки дополнительно выялено и.введено в каталог 30 полипептидов до суммарного количества 175.
-
Идентифицировано на двумерноД карте положение фракций альбумина, актина, белка связующего жирные кислоты, альфа цепь АТФ-синтазы. аконитазы, альфа В кристаллика, десмина и 13 других белков', гомологичных с белкеии мышечной ткани.
-
Изучена сдецифичн. ль белков морфологических структур почки человека и. і выявлен ряд полипептидов специфичных для коркового и мозгового вещества почки, проксимальных отдзлов канальцев, ба-зальной мембраны канальцев и клубочков. ,
-
Изучена вариабельность белков почка человека и выявлен ряд количественных различий. У инбредньх линий мышей обнаружен ряд полиморфных вариантов белков почек с разным типом наследования.
-
Обнаружены маркеры аутолитинеской деградации, как общие для
мыши и человека, так и специфичные для человека и для отдельных структур почки.
6. Выявлены белковые маркеры хронической почечной недостаточности человека разного генеза.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной встрече электрофоретического общества (США.1991), на 22 Международной встрече ФЕБО (Швеция,1993), на 1(3) съезде медицинских генетиков России (1994), на 16 Международном когрессе по биохимии и молекулярной биологии (Индия,1994), на совместном научном семинаре НИИ генетики человека МГНЦ РАМН и сектора биохимии белков НИЦ ММА (1996).
Публикации, По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и структура диссертация. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение, список литературы. Работа излозкена на 131 страницах машинописного текста и иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками. Список литературы содержит 203 источника, Еключая 170 работ зарубежных авторов.