Введение к работе
Актуальность проблемы. Перспективность исішльзования ли-эсом в качестве транспортных средств определяется еозмож-)стью включения в их внутренний объем водорастворимых,а в ли-вдную мембрану - водонерастворимых биологически активных ве-зств. и направленной доставка в клетки организма. При этом зижается токсическое действие с одновременным предохранением зкарственных веществ от быстрой инактивации во внутренней реде организма. В результате лшюсомы стали широко исгользо-зть в различных областях биологии и медицины - биофизикой для эдификации клеточных мембран; генной инженерией - для введе-ия внутрь клеток генетического материала; иммунологией - для спользования адыовантных свойств липосом в создании иммунно-огических и вакцинных препаратов; фармакологивй для обычного направленного транспорта лекарственных соединений в организ-е ГВ.Ф. Антонов и др.,1983, Г.С. Власов и др.,1982, Г.Грего-иадис,А.Аллисон,1983, в.н. тот. н. к. Six.ieeo. с. g.
night.ieei, G. Gregoriadis.lSSSJ. ПОСЛвДНИВ ДВЭ Направления
аиболее перспективны.
Для достижения этих целей разрабатываются препараты ли-юсом, способные длительно существовать во внутренней среде ірганизма в интактном состоянии, имещив. высокое сродство к ірганам и клеткам-мишеням, обладающие определенными иммуноген-ыми свойствами. Применение липосом в качестве носителей лз-:арственных веществ предполагает, что липидная мембрана Безнал, приготовленная кз природных липидов, является биодеградн-эуемой и не вызывает побочных эффектов. Однако попадание во шутраннюю среду организма липосомных фосфолипмдов вызывает эеакцию его систем, направленных на поддержание гомеостаза.
Успешное применение липосомных препаратов в лечении, про-іжлактике и диагностике заболеваний обязательно требует, выяснения деталей их поведения во внутренней среде организма. Реакция организма на введение липосом прежде всего направлена за поддержаниа постоянства внутренней среды организма. Характер скстегаїьіг реакции опрздзлягтся фкзкко-ги.:пч?сгск?.:к своаствагаї фосфолипиднои мембраны липосом, дозой к кратностью введения прзпарзтов, г, крэкг тете, ряд прітодньїг г. сгстгетх-чзеккх фэсфэлкпкдэз обладают Еырэкзшюс биологкческог. эптее-н:"'сть!і і Л.ЕЛ.'.аргилг.с;, Л.Д.Бергельсон, IS37 і. /л.і fry., і&е-ч-, g.
і. Gregorladis &t al. .16893. ЛзуЧвНИВ ГОМЄОСТаТИЧЄСКИХ реакций,
знание закономерностей ответа организма являются необходимым условием конструирования и применения липосомных препаратов.
Многократные введения медицинских препаратов лилосом еще более осложняют ситуацию и вызывают усиление реакций, направленных на поддержание гомеостаза. В таком случав исследования отдельных условий и реакции организма не способны дать полного ответа на вопрос взаимоотношения организма с дипосомами. Необходимы иные концепция и методология решения этой проблемы. Ведущей методологией такого плана проблем является методология системного подхода.
Установление закономерностей ответа организма на уровне систем на однократное и многократное введение липосомных препаратов является актуальной теоретической и практической проблемой. Исследование системных реакций организма необходимо как для понимания фундаментальных механизмов взаимодействия дипид-ных комплексов с органами и клетками, так и для-конструирования высокоэффективных липосомных препаратов с заданными свойствами.
Цзль и задачи исследования. Цзль работы - выявить и оценить реакцию систем организма на различных уровнях: молекуляр-. ном - регуляция активности клеточных ферментов при однократном и многократном введении липосомных препаратов; клеточном - изменение активности тромбоцитов в присутствии липосом различного липидного состава; установить закономерности ответа иммунной системы организма в целом на однократное и многократное введение липосом различного фосфодипидного состава липосом, несущих антигены и иммуномодуляторы.
Для решения этих вопросов были поставлены следующие задачи:
I.Исследовать интегральный иммунный ответ (защиту от инфекции) при иммунизации бактериальными антигенами, включенными в диггосомы..
2.Выяснить роль физико-химических свойств мембраны липосом, а также способа иммобилизации антигена па интегральную иммунную реакцию организма.
3. Оценить иммунные ответ организма на ввздениа липосомадь-ных препаратов веществ, обладающих антигенными и иммуностимулирующими свойствами.
дельных органов з поглощении ;і уталпзации лзшяцных везикул.
5.уізу"ііп"ь ізакц^о ..:е..-;срг.:ссзнзалзых :зе.у.єнтсз печени, а такие системы гормональной регуляции ферментов глюконеогенеза печени на введение липосом различного липидаого состава.
6.Выявить реакцию систем регуляции активности ферментов гаченії на тсоютесіссе зеє генне липсссм тззличеогэ состава.
7.2ыяв:ггь реакция системы свертывания :срози на зеєдєяиє липосом различного липидаого состава и установить закономерности взаимодействия везикул с тромбоцитами.
8. Определить влияние липидаого состава липосом и наличия в них белкового антигена на реакцию яидкоа части и форменных элементов :-:рови при однократном и повторном зведений препаратов.
Научная новизна. Впервые сформулирован подход к проблеме взаимодействия организма с липосомами как совокупность системных реакция. В рамках этого подхода проведены экспериментальные исследования по оценке реакции иммунной системы, системы коагуляции и регуляции активности ферментов, в результате которых получены новые экспериментальные данные об общих закономерностях ответа организма на введение липосом.
Получены оригинальные данные о закономерностях реакции организма на введение холестерина в состава липосомной мембраны. Роль холестерина в составе липосом двояка, с одной стороны он стабилизирует мембрану везикул и способствует их взаимодействию с клетками, с другой стороны наличие холестерина нивелирует эффект индивидуальных биологически активных фосфоли-пидов липосомной мембраны.
Впервые обнаружено влияние липосом различного липидаого состава на активность мембраносвязанных ферментов, а также на гормональную индукцию ферментов печени. Показано стимулирующее действие липосом, содержащих фосфатидилсерин, на активность тирозинаминотрансферазы. Введение стероидных гормонов на фоне липосом приводит к изменению з уровне индукции ферментов глюконвогвнеза - тирозинаминотрансферазы, серии- и треониндегид-ратаз.
Разработан оригинальный подход к оценке гсмесстатическоя функции организма путем сравнительного исследования гормональ-
ной индукции ферментов на фоне однократного и фонического введения дипосом. Обнаруженные различия позволяют сделать новый вьшод об адаптации организма к многократному введению липосом, уровень которой зависит от фосфолипидного состава везикул.
Установлены ранее неизвестные закономерности распределения антигенсодержащих липосом в иммунном организме. Повторное введение таких препаратов характеризуется иным уровнем поглощения липосом основными паренхиматозными органами. Снижается доля везикул, захваченных печенью, и возрастает накопление в селезенке и особенно в легких. На характер распределения влияет природа антигена.
Сформулированный нами системный подход позволил оценить вклад фосфолипиднои мембраны липосом, способа фиксации и вида антигенов в интегральную иммунную реакцию организма. Полученные оригинальные результаты свидетельствуют о высоком протек-тивном эффекте липосомного препарата, содержащего бактериальные антигены и иммуностимуляторы, при заражении животных чу-моа.
Впервые выявлены основные закономерности влияния липосом на функциональную активность тромбоцитов. Установлено, что реакция тромбоцитов на присутствие липосом определяется главным образом их фосфолипидным составом. Выраженным действием на гемостаз обладают фосфатидилсерин и фосфатидилинозит - основные биологически активные липиды мембраны тромбоцитов.
Подученные новые экспериментальные данные позволили сформулировать новую гипотезу об активации системной гомеостати-ческой реакции организма в результате многократного введения липосом, значительно модулирующая ожидаемый эффект препарата.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
I. Многократное введение липосом приводит к иммунной перестройке организма, появлению антител к антигенным молекулам в составе везикул. Это вызывает более интенсивное разрушение липосом в крови и повышенный захват иммунокомпетентными клетками. Роль антифосфолипидных антител в повреждении везикул незначительна, основной ответ иммунной системы направлен на антигены нефосфолипидной природы, включенные в состав липосом.
2.Судьба антигенсодержащих липосом при повторном введении в иммунизированный организм имеет значительные отличия, связанные
с раакшви органов и систем.Наряду с печенью больдие количества пез:кул ч этом случае поглощается сзлезенкоа л легкими. Накоплена лппоссмного материала легісии при повторном введении специфично и макет быть использовано для целенаправленноа доставки лечебных средств.
3.Одновременное включение в липосомы нескольких протектив-ных антигенов и иммуностимулятора значительно усиливают реакцию иммунной системы и способствует эффективной защите от развития инфекции.
4.Присутствующие в крови липосомы способны вступать во взаимодействие с тромбоцитами и изменять их способность к агрегации под дэаствием индукторов. Выраженность и направленность таких эффектов зависит от фосфолипидяого состава и определяется концентрацией липосом.
5.Высокий уровень захвата липосом печенью приводит к попаданию в клетки большого количества фосфолипидов, изменяющих свойства клеточной мембраны и расположенных в них ферментов. Модификация фосфолипидного состава мембран вызывает изменения в гормональной регуляции ферментов печени особенно заметные при однократном введении. При хроническом поступлении липосом их влияние снижается за счет адаптации организма.
Теоретическое и практическое значение работы. Диссертация представляет собой экспериментальное исследование системных реакций- организма на однократное и многократное введение липосом различного состава. Полученные результаты дают возможность понять закономерности изменений, происходящих в организме при попадании липосом, роль отдельных компонентов везикул, дозы и кратности введения.
Разработаны теоретические основы для исследований системных реакция организма при многократном введении липосомных препаратов.
Обосновано предположение о влиянии фосфолипидов липосом на метаболический гомеостаз печени, в результате которого значительно изменяется активность ряда ферментов и их гормональная регуляция. Это позволяет оптимизировать конструирование и применение липосом в качестве транспортных средств, а также в виде самостоятельных биологически активных препаратов, способствующих стабилизации и улучшению обменных процессов в печени.
j ^Іш.^":іг.'л ..c^-^^2uiui:i .штвгра.іііісл :ыдун2ол реакции организма на введение лигосомвых препаратов ба:пэриальныз: ттро-тгігглзліп: ант:ігзаоз указызахгг аа возможность создания эффективного препарата для профилактики инфекционных заболевания.
Теоретические результаты работы, а также методические подходы нашли применение в научных исследованиях и разработках новых иммунодиагностяческих препаратов для обнаружения бактериальных токсинов и антигенов.
По материалам исследования получены авторские свидетельства n 1O037Q1. 23 ноября 1982т "Способ включения еєеєств в ли-посомы" и NI0355I8, 15.04.83т "Способ разделения биополимеров". Разработаны и изданы в соавторстве с В.И. Ефреиенко, Я.5І. Денисовым, В.Я. Куриловым, Н.Г. Плехановой и К.А. Ротовым Методические рекомендации "При готовление липосом, содержащих биологически активные вещества", утвержденные МЗ СССР.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуж-дались на її Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Киев, 1983); Третьем Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Пушино, 1984); і-а Всесоюзной, дтнференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический конт-
съезде (Киев, 1988); Всесоюзной научно-практическоа конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекция" (№aBp^naib_!_^986Ji^c8CBH3H0M_HMno3HyMe-n&- биохимии липидов (Алма-Ата, 1987); Всесоюзноа конференции "Биохимия - медицине" (Ленинград, 1988); Международном симпозиуме "Механизмы регуляции клеточноа активности" (Ташкент, 1989); Всесоюзноа конференции "Современные направления в создании медицинских диагностикумов" (Москва, 1990); на заседаниях Волгоградского отделения Всесоюзного биохимического общества (1981 -1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 на-учных работ, из них 10 в центральных журналах-, II во всесоюзных научных материалах-, 4 в сборниках научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 303 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав обзора литературы, 6 глав собственных исследования, заключения, выводов-, содержит 39 рисунков и 12 таблиц. Библиография представлена 74 отечественными и 311 зарубежными работами.