Введение к работе
;_;;; j
~~А ктуальность работы. Изучение циклическо
го 3 ,5 -аденозинмонофосфата (цАШ), а такие выяснение его роли
в биологии клетки предопределило развитие принципиально новых
путей исследования нейрогормональной регуляции клеточных систеы
организма» Циклический А!й является медиатором действия многих
гормонов в животных клетках, но его присутствие в кишечной па
лочке, впервые продемонстрированное Сазерлендом и Макман в 1965
году, вызвало недоумение у экспериментаторов, так как бактерии
лишены гормонального контроля,
Выясьено, что это небольшое соединение с молекулярной массой 347,2 дальтон играет немаловажную роль в решении одной из самых актуальных проблем биологии - проблемы контроля активации
гена.
Наличие цАМФ установлено почти у всех изученных микроорганизмов. Его присутствие необходимо для прокариотов, так как выполняемые функции сложны и многообразны. В настоящее время известно более 60 белков, катаболитчувствитальных к цАМЬ, Циклический нуклеотид влияет на различные функции бактериальной клетки, включая синтез структурных компонентов клеточных стенок и мембран, синтез нуклеиновых кислот, углеводный обмен, различные этапы клеточного деления, проницаемость мембран, репрессии био-синтетичзских энзимов и регуляторних белков, репликацию рада плазмид и лизогенизации бактериофагов.
Регуляции циклическим нуклеотидом как у эукариотов, так и прокариотов подвержены такие важные процессы как транскрипция, трансляция, дифференцировка клеток, транспорт ионов и молекул (HauscMa P. et.al., 1972, Воейков В., 1984).
Система цА включает циклический аденозинмонофосфат, ферменты его метаболизма - аденилатциклазу, катализирующую синтез
цАЫ$ из АТФ, фосфодиэстераэу, деградирующую циклонуклеотид до 5 -МІФ, а такде цАМФ-связывапций белок и протеинкинаэы»
Механизмы регуляторних процессов с участием цАШ у яивотни выяснены достаточно подробно, разработана трициклическая модель активации аденилатциклазы гормонами. Однако, в силу меньшей изученности понимание действия циклонуклеотида у прокариотов недостаточно. Вовлечённые механизмы и некоторые физиологические последствия изменения уровня цАШ не определены даже у хорово изученной кишечной палочки, хотя информация о роли циклического нуклеотида в жизнедеятельности этой бактерии на сегодняшний дан значительна ( Josepfi Е. el.al., 1982, Шел.] К., 1985).
Что касается возможной связи системы цЖФ и вирулентности бактерий, то этот вопрос стал анализироваться только в последние шесть лет после обнаружения в составе токсина возбудителя сибирской язвы аденилатциклазы, способствующей развитии отёка у больных (Leppla S», 1982). Сада ко относятся данные, касажцие ся выявления внеклеточной аденилатциклазы коклюшной бактерии, к торая подавляла ответ фагоцитов макроорганизма при развитии инфекции (Соп^еч Д., Eaion J., 1982).
Для того, чтобы понять, каким образом цАМФ участвует в рог, ляции внутриклеточного метаболизма, нужно прежде всего иметь представление о структуре а функции слоено организованной системы его действия.
Отсутствие в доступной литературе каких-либо данных о пали чин системы цАМФ у возбудителя чумы и очевидная важность её изу чения для понимания физиологических процессов, существенных для жизнедеятельности микроба, а также решения вопросов, связанных его патогенностыо, определило необходимость и актуальность проведения детального исследования системы циклического нуклеотида у yeis'mia pcslis.
Исходя из сказанного выше была определена цель настоящей работы - показать наличие системы цАИ$ у возбудителя чугш и изучить по некоторым физико-химическим параметрам компоненты системы, оценить их возможную биологическую роль в реакциях взаимодействия возбудителя її клеток организма хозяина.
Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие з*а д а ч и :
1« Определить наличие цАМі у микроба чумы и найти его количественную зависимость от условий выращивания клеток, фазы развития культуры.
-
Выяснить возможность его выделения клеткой, во внешнюю среду.
-
Определить наличие аденилатциклазной активности у бактерий чумы, выделить и исследовать некоторые свойства фермента.
-
Охарактеризовать чумной микроб на наличие фосфодиэстеразной активности, выделить фермент и изучить его по некоторым фиэико- химическим параметрам.
-
Определить наличие цА}Д-связыванцеи способности у чумного микроба, выделить этот связывающий циклонуклеотид белок и охарактеризовать его некоторые физико-химические свойства.
-
Попытаться выяснить возможность биологической активности аденилатциклазы возбудителя чумы.
Научная новизна. Впервые у чумного микроба обн дружен циклический аденоэинмонофосфат, ферменты его метаболизме (:^: -нилатцкклаза, фосфодизстераза) и цАН$-связывающий балок.
Разработан простой метод получения аденилатциклазы в чкс?о^ виде. Фермент выделен, очищен до гомогенного состояния и охарактеризован по ряду физико-химических параметров. Обнаружены три формы аденилатциклазы (мембраносвязаниая, растворимая цитопле-пка -тическая и внеклеточная), не отличающиеся друг от друга по изученным физико-химическим и иммунологическим свойствам, Получена в
гомогенном состоянии и охарактеризована по некоторым свойствам фосфодиэстераза возбудителя чумы, а также цикло-АШ>-связывающий белок. Выявлено, что содержание цАЫФ в клетке модулируется температурой культивирования: его количество при 37 превышает уровень нуклеотида, синтезируемого клеткой при 28; соответственно при 37 увеличиваются активности аденилатциклазы и цАМФ-свяэывающего белка, снижается фосфодиэстеразная активность, что свидетельствует в пользу участия цАМФ в формировании вирулентного фенотипа клетки. На модели фагоцитов экспериментальных животных показана возможная биологическая роль внеклеточной аденилатциклазы микроба чумы в патогенетическом процессе, согласно которой её можно отнести к факторам, существенным для экспрессии вирулентности.
Практическая ценность. Получено положительное решение на заявку на предполагаемое изобретение "Способ очистки термостабильной внеклеточной аденилатциклазы чумного микроба", в которой приведена схема выделения и очистки внеклеточной терао-стабильной аденилатциклазы возбудителя чумы. Впервые предлагается гомогенный препарат аденилатциклазы для изучения физико-химических свойств, рминокислотной последовательности и структуры белка, а также для выяснения биологических функций фермента, включая его вклад в развитие патогенеза при чуме. По итогам выполненной работы составлены методические рекомендации "Обнаружение и количественное определение циклического 3 ,5 -аденоэинмонофосфата у возбудителя чумы." Метод позволяет тестировать наличие циклического Ш$ у различных штаммов возбудителя чумы, что будет способствовать более углублённому изучению регулирующего влияния нуклеотида на физиологии чумного микроба.
Апробация работы. Материалы работы дояокени на ІУ Всесоюзном симпозиуме ІЮ циклическим нуклеотидам (Минск, 1982), і:? Всесоюзной научной конференции по актуальным вопросам колекуляр-
кой биологии, гєнетикіі и иммунологии возбудителей особо опасных инфекций в г. Рсстове-мз-Дону d 1984 году, на У Всесоюзном симпозиуме, поевпщеннозі циклическим пуклеотидам'и системе регуляции фер-кентатигних реакций (Рязань, 1985), на научной конференции-конкурсе молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского проти-почуккого института з 1985 году.
П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура диссертации. Диссертация изложена из 169 страницах нсетнописи, иллюстрирована 17 таблицами и 36 рисунками її фотографиями. Цитировано 45 отечественных и 261 инострсн-ных автора.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела ^Собственные исследования", заключения, выводов и указателя литература.