Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание методов необратимой инактивации и регуляции экспрессии определенных генов является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Наиболее перспективным подходом к решению этой задачи является направленное воздействие на конкретные генетические программы с помощью олигонуклеотидов и их производных, способных избирательно взаимодействовать с характерными для этих программ нуклеотидными последовательностями, модулируя эффективность их функционирования. Перспективным представляется создание методов направленного воздействия на определенные участки генов, так как в этом случае, в отличие от методов, основанных на действии антисмысловых олигонуклеотидов, возможно необратимое изменение генетических программ и достижение долговременных эффектов. Прямым подходом к созданию препаратов, избирательно действующих на заданные нуклеотидные последовательности в составе определенных генов, является использование гомопуриновых и гомопиримидииовых олигонуклеотидов, способных образовывать комплексы с соответствующими участками двуцепочечной ДНК (дцДНК). Для направленной химической модификации дцДНК и, соответственно, для необратимой инактивации или модуляции экспрессии отдельных генов на уровне транскрипции могут быть использованы реакционноспособные производные гомопиримидииовых и гомопуриновых олигонуклеотидов. Одним из наиболее перспективных классов реакционноспособных производных олигонуклеотидов для модификации ДНК являются конъюгаты олигонуклеотидов с алкилирующими группировками. В связи с этим, актуальной задачей является конструирование производных олигонуклеотидов, способных с высокой степенью избирательности связываться с регуляторными либо кодирующими участками определенных генов и эффективно модифицировать их, вызывая подавление экспрессии нежелательных генов.
Цель работы. Целью настоящей работы являлось изучение специфичности и
эффективности алкилирования дцДНК реакционноспособными производными
пиримидиновых и пуриновых олигонуклеотидов, несущих алкилирующую группу на 5'-
и 3'- концевых фосфатах; изучение закономерностей образования комплексов
олигонуклеотидов с дцДНК в различных условиях; разработка методов повышения
специфичности и эффективности модификации дцДНК-мишени
реакционноспособными производными олигонуклеотидов.
Научная новизна работы. С помощью реакционноспособных производных пуриновых олигонуклеотидов впервые показано, что пуриновые олигонуклеотиды связываются с полипурин-полипиримидиновыми участками ДНК в ориентации антипараллельной по отношению к пуриновой цепи дуплекса. Показано, что бифункциональные реагенты, несущие реакционноспособные группы на 3'- и 5'-концах олигонуклеотида, могут эффективно алкилировать одновременно обе цепи ДНК, приводя к ковалентной сшивке двух цепей. Разработан метод количественной модификации дцДНК алкилирующими производными пиримидиновых олигонуклеотидов, заключающийся в последовательных обработках ДНК реагентом в возрастающих концентрациях, без удаления предыдущей порции гидролизованного реагента. Доказано, что при низких рН в присутствии ионов магния пиримидиновые
олигонуклеотиды образуют с дцДНК два типа тройных комплексов, причем алкилированис протекает с высокой эффективностью только в составе одного из них.
Практическая ценность работы. Исследованные в работе закономерности образования несовершенных триплсксов в различных условиях позволяют с высокой вероятностью выбирать участки генов для наиболее эффективного воздействия на их функционирование. Разработанный метод количественной модификации дцДНК-мишени позволяет существенно повысить эффективность воздействия на функционирование выбранного гена. Использование бифункциональных алкилирующих производных олигонуклеотидов для направленной модификации дцДНК позволяет вносить более глубокое повреждение в заданном участке гена -ковалентно связывать две цепи ДНК и ингибировать транскрипцию. Бифункциональные алкилирующие производные олигонуклеотидов могут быть использованы в качестве «химических рестриктаз» для геномного секвенирования.
Публикации и апробация работы. Результаты диссертации опубликованы в 4 печатных работах. Материалы работы докладывались на Международных симпозиумах "Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical appplication", Москва, 23-30 июня, 1991; "French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression", Новосибирск, 1-5 июля, 1995г.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, он включает 27 рисунков, 2 таблицы, список цитируемой литературы из 193 наименований. Работа состоит из 3 глав, введения и выводов.