Са2+-независимая регуляция активности киназы легких цепей миозина скелетной и гладкой мускулатуры коронаросуживающими пептидными факторами гипоталамуса Закарян, Таня Рафиковна

Введение к работе

Актуальность проблеми. Ger⁺ является фундаментальным регулятором различного рода внутриклеточных процессов. Одним из крупных достижений в области регуляции клеточного метаболизма явилось обнаружение мультяфункционального Са^-связывающего белка - кальмодулина {Cheuncj. W. У. 197О; с $. etctf. 1570).

К белкам, регулируемом кальмодулином при участии Са (таких белков становится все больше и на сегодняшний день их известно более 30), относятся некоторые фосфодиэстеразы, пикличес-ких нуклеотидов (;Mi kl /У. d at. 1972; Тео ? S. eb cU.. 1973), адєянлатциклаза ( Brostrotn. СО.Єі сії. 1975), мембранные Ca -АТР-азы. ( GopinatL Я.Н. et at. 1977), киназа фосфорилазы ( Co-hen. P. gtat. 1973) киназа легких цепей миозина из гладких {Ъ&о-rOs'/ska. R- 2І at. 1978) и скелетных {Уаді eiat. 1978/ мыши и др. Присоединение Са , приводящее к аллостерической активации кальмодулина ведет к тому, что ранее свободный кальмодулнн связывается в клетке с различными белками - мишенями и играет ключевую роль во многих ферментативных реакциях и системах мембранного транспорта, активируемых Са*''¹" ( v/шЩ J-H. ei CCt.lWiS; R-S. siО/і. 1981). 'Важнейшая функция кальмодулина в гладкой мускулатуре - это актявашш ішназн легких цепей миозина (ЮЩМ) - фермента, играющего ключевую роль в реализации мыяючно-гс сокращения в гладкой мускулатуре путем ковалентного фосфор;:-лированпя'легких цепей миозина () ( Реттц S.V. S'tac-islS; /)r6-TOWskcL R- si etc. 1978), Независимо от источника выделения .ЮЩМ проявляет активность при одновременном присутствии Са²⁺ и кальмодулина.

За последние годы в нашей лаборатории накоплен большой фактический материал, подтверждающий ранее предложенную академиком А.А.Галопном концепцию о существовании в мозгу Са -независимой пептидной системы регуляции активности Са , калшодулинзависи-мых ферментов, допускающую наличие в организме иных, дополнительных систем регуляции активности этих ферментов при физиологических условиях, когда концентрация ионов Са 10 М.

Недавно появились работы, указывающие на существование ряда факторов, вызывающих Са - независимую активацию ФДЭ сАМР

- 4'-и других чувствительных к кальмодулину систем. К ним относятся жирные кислоты, фосфолипиды, бактериомодулин и др. (Вгап-fordR-Jettti.imi; Wolff'R.J'еЫ-1Ю&\ Лудкин и др., 1984). К этой группе соединений относятся и выделенные нами из гипоталамуса крупного рогатого скота 5 коронаросуживающих пептидных факторов.

В настоящей работе представлены данные об очистке этих соединений из гипоталамуса и изучении'их Са²⁺-независимого регуляторного- воздействия на активность КЛЦМ скелетной и гладкой мус- , кулатуры.Полученные данные будут способствовать расширению наших представлений о Са^<;+-независимых путях регуляции клеточного метаболизма и с этой точки зрения имеют, фундаментальное значение.

Цель и задачи исследований. Учитывая тот факт, что кардиоак-тявные соединения гипоталамуса обладали регуляторним воздействием на активность ряда Са , кальмодулинзависимых ферментов (ФДЭ сАМР, 5 -нуклеотидаза), а также принимая во внимание физиологический эффект коронаросуживающих соединений,гипоталамуса, целью настоящей работы было изучение воздействия вышеуказанных соединений на активность киназы легких цепей миозина гладкой и скелетной мускулатуры. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Выделить в гомогенном состоянии из гипоталамуса крупно- го рогатого скота коронаросуживающие соединения и охарактеризовать их.

2. Получить гомогенные препараты киназы легких цепей миозина из скелетной и гладкой мускулатуры.

3. Изучить воздействие коронаросуживающих пептидных факторов гипоталамуса на активность киназы легких цепей миозина как в присутствии, так и в отсутствие ионов Са.

4. Изучить воздействие пептидных факторов гипоталамуса на процесс агрегации тромбоцитов и сокращение гладкой мускулатуры, так как эти пронесен также находятся в зависимости от Са -кальмодулинового комплекса.

5. Изучить воздействие коронаросуживающих соединений гипоталамуса на активность Са , кальмодулинчувствительной ФДЭ сАМР, учитывая то обстоятельство, что повышение уровня сАМР в гладкой мускулатуре приводит к ингибированию КЛЦМ.

Научная новизна и практическая ценность. Нагл и впервые был предложен метод получения в гомогенном состоянии из гипоталамуса

- 5 -крупного рогатого скота 5 коронаросуживающих пептидных факторов (n$j_₅).

Впервые было показано, что эти соединения вызывают Са -независимую активацию киназы легких цепей миозина в присутствии' кальмодулина. На основании полученных экспериментальных данных высказано предположение о механизме действия пептидных факторов гипоталамуса на КЛЦМ: n$j_g оказывают регуляторное воздействие на активность КЛЦМ путем Са*⁺-независимого связывания с кальмо-дуляном и образования комплекса кальмодулин-ПФ, который, связываясь с каталитической субъединицей фермента, вызывает его активацию. П$2_5 являются, по-видимому (как и ионы Са ), аллостеря-ческими активаторами кальмодулина. Недавно была выяснена первичная структура этих соединений (Галоян А.А., Бархударян Н.А., Лотшпайх ., 1990). На основе выявленной структуры были получены синтетические пептиды и подтверждено их Са ⁺~независимое активирующее воздействие на КЛЦМ. Изучение физиологического эффекта синтетических пептидов (способность стимулировать сокращение изолированной аорты кролика в ^-деполяризующем растворе я процесс агрегации тромбоцитов, вызванный 5 мкМ АДР) показало, что он аналогичен эффекту нативных Ш_т_д.

Все вышесказанное позволяет начать работа по внедрению этих соединений в медицинскую практику в качестве лекарственных препаратов при кровотечениях, атонии кишечника и др«

Публикации и апробации. Основное содержание работы изложено в 8 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на УІ Всесоюзной конференции по биохимии мыши (Тбилиси, 1989) на 8 Общем собрании Европейских нейрохимических обществ (Лейпциг, 1990), на заседании ученого совета Института биохимии АН РА.

Объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, заключения и выводов. Работа изложена на 23 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков а 2 таблицы. Список цитированной литературы содержит 141 наименований.

Коронаросуяивающие соединения выделяли из уксуснокислого экстракта пептидной фракции гипоталамуса (Галоян А.А. и соавт.,

1963). Дальнейшую очистку проводили, используя гель-фильтрацию на сефадексе G-10'и ИОХ на Даузксе 50W х 8 по ранее описанной схеме (Галоян А.А. и соавт.,- 1987).

ВЭЖХ пептидов в обращенной фазе проводили: I) на колонке Licnrosori RP-8 (1,6 х 25 см, диаметр частиц 7 мкм; "Kcmver" ФРГ), с использованием ступенчатого градиента ацегонитрила в 0,1^-ной GF3COOH (время изменения градиента - 1,5 ч), скорость элюции 3 мл/мин; 2) на колонке Huzleosid. Gjg (0,46 х 25 см, диаметр частиц 7 мкм; 'Ма.е'пгтеу. -Ncwjtt, ФРГ), используя градиент концентрации ацетонитрила от 5 до 60$ в 0,1^-ной CFgCOOH (время изменения градиента - I ч), скорость элюпии - I мл/мин. Пептида детектировали при 220 нм. ,

N-концевые аминокислоты в пептидах определяли в виде их 1~диметиламино-5-сульфонильных (ДНС) производных по методу. Грея (1967). Хроматографию проводили на пластинках, размером 6 х 6 см с закрепленнымслоем силйкагеля марки КСК в следующих системах: I - ацетон-изопропанол-25#нн,он, (-9:7:0,5) и (9:7: 0,7) - первое направление; хяороформ-бензиловый спирт-этилаце-тат-уксуспая кислота (6:4:5:0,2) - второе направление. П - аце-тон-изопропанол-25/S ш^он,'(9:7:2) и (9:7:3) - первое направление; хлороформ-бензиловый спирт-метанол-уксусная кислота (5:4: 1:1) - второе направление.

Катепоин В (К.Ф, 3.4.22.1) выделяли по ранее описанному методу (Галоян А.А.,и соавт., 1984)„ Гидролиз пептидов катепсином В проводили в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 2 мМ дитиотрейтол и 2 мМ ЭДТА при 37 в течение 4 ч а соотношении фермент/субстрат 1:10.

Гидролиз трипсином и химотрипсином проводили в 0,1 М аммо-нийбикарбонатном буфере, рН 8,1 при 37 в течение 4 ч и фермент/ субстратном соотношении 1:10.

Количество белка определяли по методу Lowru и соавт. (1956).

ТСХ Ферментативных гидролизатов проводили на пластинках силйкагеля ("МетА", ФРГ) (9 х 12 см) в системе: н-бутанол-пири-дин-уксусная кислота-вода (15:10:3:12). Хроматограммы проявляли 0,2^-ным раствором нингидрина в ацетоне.

Эксперименты на изолированной аорте кролика проводили по
методу Канамори'и соавт. (1981). "пі "

Агрегацию тромбоцитов исследовали на агрогометре гаи*оп.₎

- 7 -(СШЛ) с использованием в качестве агреганта 5 мкМ АДР. Исследования проводили на крови здоровых доноров. Богатую тромбоцитами плазму получали центрифугированием крови при 2000 а, в течение 10 мин по методу Born- я соавт. 1962).

Получение препарата КЛИМ из скелетной и гладкой м-ускулату-Ш' Лля получения гомогенного препарата КЛЦМ из гладкой мускулатуры желудка кур (или скелетной мышш кролика) использовали методы ycLza-wa._и соавт. (1976), Dalrowsко. _п соавт. (1977) с некоторыми модификациями. 100 г желудков кур гомогенизировали з 4-х объемах 40 мМ трис-НСІ буфера, рН 7,5, содержащего 60 мМ KCI, 25 м?,1 м_еС1₂, I мМ ДТТ, 5 кМ ЭГТЛ, 0,2^-ный тритон Х-100, 10 М PMSF 10 U диизопропплфторфосфата и пепстатпн в концентрации І мг/л. Гомогенат центрифугировали при 15000 ХФ в течение 30 мин. Супернатант подвергали осадденню сульфатом аммония (42-60$). Полученный осадок растворяли в 30 мл (25 мг/ мл) 15 мМ трис-HCI буфера, рН 7,5 дуализировали против того же буфера и наносили на колонку с сефакрилом 5-300 (5 х 87 см), уравновешенную 15 мМ трис-НСІ буфером, рН 7,5, содержащим 0,5 М НиСі, I М ЭГТА, I мМ ДТТ, Ю^-3 М PMSF. Элюшю проводили тем не буфером со скоростью 200 мл/ч. Собранные о колонки фракции, содержащие ЮЩМ, объединяли и подвергали ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефацелем (2 х 20 см), уравновешенной 20 мМ трис-НСІ буфером, рН 7,8, содержащим I мМ'ЭГТА, I мМ ДТТ, Ю^-3 М PMSF, На колонку наносили 250 мл раствора КЛЦМ (1,5 мг/ мл). Элюшго проводили тем же буфером с линейным градиентом Naci ~ 0,02-0,6 М. Скорость злший 60 мл/ч.

На последнем этапе очистки использовали аффинную хроматографию на кальмодулин-сефароза 4В. 50 мл а раствора КЛЦМ (0,7 мг/мл) наносили на колонку с кальмодулш-сефарозой (I см х 8,5 см), уравновешенную 40 мМ трис-НСІ буфером, рН 7,2, содержащим 50 мМ МаСІ, 0,2 мМ СаСІ₂, 3 мМ Ms«₂. І мМ ДТТ (буфер А). Для элшии неспецифически сорбированных белков колонку промывали тем яе буфером, содержащим 0,2 М HaCl. Элюпию проводили буфером А, в котором Са²"¹" был заменен 2 мМ ЭГТА. Скорость алюции 50 мл/ч.

ФосФорилирование легких цепей (М) миозина скелетной и гладкой мускулатуры желудков кур с М_г 20 кД проводили в течение 25 минут при 25С в инкубационной среде, содержащей 70 мкг очищенного миозина, 20 мМ фосфатного буфера, рН 8,0, 12,5 мМ

MgCl₂, 0,1 MM CaCI₂, 10.мМ ATP, 1,5 мМ КЛЩ1 и 4,5 м?Д калыло-дулина. Включение фосфата в ЛЦ₂ миозина регистрировали с помощью электрофореза в 10#-ном ПААГ в присутствии 8 М мочевины по методу firruS. и соавт. 1970). Относительное содержание фосфо-рилированных ЛТ^ в миозине определяли при анализе денситограш гелей электрофореза, окрашенных Кумасси R-250.

Выделение ФДЭ сАМР из гипоталамуса быка проводили по методу Бобрускина и соавт. (1985).

Активность ФДЭ сАМР определяли по методу То>прг>рп._іАрріг-тд/г.(І97І), основанному на измерении концентрации )]-аденозине в среде, образующегося з результате двухстадийной реакция гидролиза [%] сАМР' и | н] 5'—AMP с участием ФДЭ и 5'-нуклеоти-дазы змеиного яда соответственно . Для определения влияния Ш на активность ФДЭ сАМР в инкубационную среду, объемом 100 ыкл, содержащую 25 мМ трис-НСІ буфер (рН 7,0), I r.iM i>'gCI_?, 3 мкМ сАМР, [ Hj сАМР (0,1 мкКи) и достаточное количество фермента, добавляли от І нМ до I мкМ пептидного фактора.