Введение к работе
Актуальность проблем. Механизмы функционирования генома эу-кариот являются одним из основных направлений исследований в cos-ременной биохимии и молекулярной биологии. Стремительное развитие методов генной инженерии позволило накопить огромнуп информация о нуклеотидных последовательностях и структурах эукаряотическо:'! ДЧК, сглззнннх с функционированием генома. Однако, относительно ферментов, осуществляющих функционирование эукариотического генома, данные носят.фрагментарний характер. Одной из наимение изученных в функциональном отноиении групп эукариотических ДНК-ферментов являются ДНК-эндонуклеаэы (эндо-ДНКаэы), значительная часть которых локализована в клеточных ядрах. Показано участие некоторых из них в процессах репарации; обсуждается участие этих ферментов в процессах рекомбинации и репликации ДНК. Изменение активности и свойств эндо-ДНКаз наблюдаются в ходе онтогенеза, иммунного ответа, малигниэации, интерфазной гибели клеток, в частности, после радиационного поражения.
Среди эндо-ДНКаэ клеточных ядер можно выделить группу ферментов, обладающих сходными свойствами и, возможно, представляющими собой один и тот же фермент или его изоформи - так называемых Са/ Мо-зависииих эидонуклеаз. Впервые наличие в клеточных ядрах Са/Мо_-зависимой эндонухлеазной активности, осуществляющей м»жнуклеосом-нуп фрагментацию ДНК хроматина, было показано в 1973 году Hewieh и Burpojne . В дальнейшем присутствие в клеточных ядрах Са/М^-эа-висимой эндонухлеазноЯ активности было достоверно показано для самых различных тканей эукариот. Широкое распространение згогс фермента в природе, по всей вероятности, указизает на его сущестпениуэт рель в метаболизме ДНК и предполагает участие в наиболее вгтчх генетических процессах.
Jr 1629 1
Очевидне, исследование участия СаДіо-зависимой эндонуклеаэы в генетических и биологических процессах требует получения фермента в высокоочиценном виде, изучения его физико-химических свойств, механизма действия -л специфичности. Особый интерес представляет фермент из тканей человека, в частности лимфоидных тканей, что определяется как возможными медицинскими приложениями подобных разработок, так и возможным участием эндо-ДНКаз, в частности Са/Мс^-зависимых, з процессах рекомбинации ДНК, активно протекающих в лимфоидных тканях. В связи с этим в качестве объекта настоящего исследования использовались клеточные ядра лимфоцитов селезенки человека.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение высокоочищенных и стабильных препаратов Са/Мо-зависимой ондонуклеазы из клеточных* тдер лимфоцитов человека, изучение её свойств и специфичности взаимодействия с ДНК и хроматином. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
-
Разработка технологии получения высокоочищенных препаратов Са/Мо-зависимой эндонуклеаэы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.
-
Характеристика физико-химических свойств фермента.
-
Изучение механизма действия фермента и'его специфичности.
-
Характеристика возможностей использования Са/Мо-зависимой эндонуклеаэы в качестве зонда для исследования структуры' хроматина в норме и патологии.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработана оригинальная схема выделения Са/!' -ависимой эндонуклеаэы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека и получены препараты фермента, обладающие высокой степенью очистки (около 2000 раз) и стабильные при хранении более 2-х
лет без существенной потери активности. Детальная характеристика 2
свойств фермента показала, что фермент отличается от описанных в литературе препаратов Са/Мо-зависижх эндонуклеаз молекулярной массой, имеющей в 2 раза больший размер, способностью изменять механизм гидролиза ДНК в зависимости'от глубины гидролиза и условий реакции. Полученный фермент обладает способность» к специфическому расщепления суперспиральной ДііК рВЙ 322, причем специфика расцепления определяется топологическим состоянием ДНК. Используя Со/Мз-зависимуя эндонуклеаду в качестве зонда, виявлено увеличение степени к о мп акт из аци и хроматина лимфздтггоп периферической крози крупного рогатого скота при хроническом лимфолейкозе по сравнению с нормой. Показана йгдъшая чувствительность Са/Мр-зависимоЯ зкдону-клеазы к. ~.-:р"уктурной организация хроматина нормальных и опухолевих "fl-r&K пс сравнения с обычно применяемыми коммерческими препаратами микрококковой нуклеазы и ДНКаэы I. Разработан комплекс методов анализа эндонуклеслиза хроматина. Псказак неслучайная характер взаимодействия Са/Мо-зависимой зндонуклеазп с хроматином нормальних лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота; при хроническом лим|юлейкозе изменяется механизм взаимодействия Са/Мр-за-висимоЯ зндонуклеазп с хроматином лимонитов периферической крови. Полученные результаты могут бить использованы в комплексе мер ло ранней диагностике хронического лимфолейкоза у и.йботшвс и человека, а также в разработках мер задитц и коррекции от последствий радиационного погашения организма. Метод компьптерного анализа он-дснуклеолиза хроматина внедрен в институте медицинской рвдиологии
Алссба;".ія габоти состоялась 22 апреля 1383 г. на научней конференции КГ/' медицинской эмзимолегии AJti СССР и на заседании уеж-яабораторноЯ научно?, конференции ЕГНЦ IG СССР от ЗІ и».я 1*56 г.
Материала диссертации докладнЕ^лись на Эсвссг.лной r's.-ty'w.v/.Y.
2-№Э 5
по. математдаескоыу моделированию и применении ЭВМ в медицине (Москва, 1984), 5-м Всесоюзном симпозиуме ло медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1967), научной конференции молодых ученых НИ'/МЭ АМН СССР (1987 г.), 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1:88).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Количество страниц 160, рисунков 39, таблиц 6. Список цитируемой литературы включает 207 источников.