Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Гомеостаз глюкозы в организме 9
1.2. Глюкостатическая функция печени. 9
1.3. Глюконеогенез 10
1.4. Сигнальный каскад инсулина 13
1.5. FOXO1 18
1.6. Гомеобоксные белки TALE. 22
1.7. Транскрипционный фактор Prep1 24
2. Материалы и методы 29
2.1. Получение клеточной линии HepG2, несущей нокаут гена Prep1. 29
2.2. Мышиная линия несущая селективный нокаут Prep1 в гепатоцитах 30
2.3. Выделение первичной культуры гепатоцитов мыши 33
2.4. Измерение продукции глюкозы 35
2.5. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 37
2.6. Электрофорез по Лэммли 37
2.7. Вестерн блоттинг. 38
2.8. Иммунохимическое окрашивание нитроцеллюлозных мембран после Вестерн-блоттинга 38
2.9. Получение и иммуногистохимическое окрашивание срезов печени. 39
2.10. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов первичной культуры гепатоцитов 40
2.11. Анализ уровня экспрессии генов методом обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР в реальном времени 41
2.12. Статистический анализ результатов. 43
3. Результаты и их обсуждение 44
3.1. Получение и анализ клеточных линий HepG2, содержащих нокаут Prep1 44
3.2. Prep1 не влияет на инсулиновый сигнальный каскад в клетках печени 45
3.3. Prep1 снижает влияние инсулина на глюконеогенез в гепатоцитах 50
3.4. Prep1 вовлечен в регуляцию экспрессии генов белков глюконеогенеза в печени 53
3.5. Prep1 регулирует ядерную локализацию транскрипционного фактора FOXO1 56
3.6. Prep1 регулирует активность сигнального каскада Wnt/бета-катенина 61
4. Заключение. 65
5. Выводы 67
6. Список литературы 68
- Сигнальный каскад инсулина
- Транскрипционный фактор Prep1
- Prep1 не влияет на инсулиновый сигнальный каскад в клетках печени
- Prep1 регулирует ядерную локализацию транскрипционного фактора FOXO1
Введение к работе
Актуальность проблемы. В развитых и развивающихся странах сахарный диабет
второго типа (СД2Т) относится к основным социально-значимым заболеваниям (NCD
Risk Factor Collaboration, 2016). Одной из причин данного заболевания является
избыточная продукция глюкозы печенью (и, как следствие, гипергликемия), вызванная
нарушением инсулиновой чувствительности. В физиологических условиях прием пищи и
последующее повышение уровня сахара в плазме крови вызывают секрецию инсулина
поджелудочной железой (Rutter G.A. et al., 2015). Действие инсулина приводит к
усилению поглощения глюкозы тканями, а также к прекращению продукции глюкозы
печенью. Таким образом, в крови поддерживается стабильный уровень глюкозы (Saltiel
A.R., Kahn C.R., 2001). Развитие инсулинорезистентности ведет к потере печенью
способности адаптироваться под текущие потребности метаболизма глюкозы и, как
следствие, к неконтролируемой продукции глюкозы гепатоцитами. Механизмом,
лежащим в основе хронической избыточной продукции глюкозы, является
гиперэкспрессия основных ферментов глюконеогенеза – фосфоенолпируват-
карбоксикиназы (ФЕП-карбоксикиназа) и глюкозо-6-фосфатазы (Г-6-фосфатаза) (Gardner L.B. et al. 1993, Sun Y. et al., 2002).
За последнее время было найдено множество новых, ранее неизвестных белков-регуляторов инсулиновой чувствительности. К числу таких белков относится транскрипционный фактор Prep1. Этот белок принадлежит к семейству гомеобокс-содержащих транскрипционных факторов TALE, известных, в первую очередь, участием в контроле эмбрионального развития организма (Ferretti E. et al., 2006). Тем не менее, в последнее время появляются новые данные о том, что Prep1 может быть вовлечен в контроль инсулиновой чувствительности мышечной и жировой ткани (Пеньков Д.Н. и др., 2016, Ciccarelli M. et al., 2016). Эти данные позволяют рассматривать Prep1 как новый регулятор инсулинового сигнального каскада и потенциальную мишень для контроля инсулиновой чувствительности в организме. В то же время пока нет однозначных данных о вовлеченности Prep1 в контроль инсулиновой чувствительности в гепатоцитах. Кроме того, не установлен механизм этого влияния. Учитывая, что именно печень является основным органом, обеспечивающим поддержание гомеостаза глюкозы в организме, изучение роли и механизма участия Prep1 в контроле инсулиновой чувствительности гепатоцитов приобретает особую важность. В связи с этим целью данной работы является создание модели изучения функций транскрипционного фактора Prep1 в гепатоцитах, а
также установление молекулярного механизма участия Prep1 в регуляции инсулиновой чувствительности клеток.
Цели и задачи работы. Целью данной работы было выяснить возможное участие транскрипционного фактора Prep1 в регуляции продукции глюкозы печенью. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Создать модель изучения функции Prep1 в клетках печени.
-
Установить влияние Prep1 на активность ключевых ферментов, ответственных за синтез глюкозы в печени.
-
Установить механизм участия Prep1 в регуляции чувствительности гепатоцитов к инсулину.
Научная новизна. В ходе выполнения работы была создана новая модельная линия животных, несущих тканеспецифичный нокаут белка Prep1 в клетках печени. Кроме того, были получены новые стабильные клеточные линии на основе клеток печени, несущие нокаут белка Prep1. Используя эти две экспериментальные модели, мы впервые показали влияние транскрипционного фактора Prep1 на обмен глюкозы в печени, а также установили возможный механизм этого действия. В частности, мы обнаружили, что Pep1 ослабляет действие инсулина на продукцию и высвобождение глюкозы гепатоцитами. При этом эффект Prep1 реализуется не через регуляцию инсулинового сигнального каскада, а через контроль локализации и внутриклеточной стабильности мастер-регулятора фактора глюконеогенеза Foxo1 и экспрессии ряда участников сигнального каскада Wnt, таких как Wnt3 и Wnt6.
Теоретическая и практическая значимость. В ходе выполнения работы был описан ранее неизвестный механизм регуляции глюконеогенеза в печени. Установленная роль транскрипционного фактора Prep1 в контроле инсулиновой чувствительности и обмена глюкозы в печени позволяет рассматривать его как потенциальную мишень для разработки новых подходов к терапии сахарного диабета 2 типа.
Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РНФ 14-35-00026 «Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств».
Методология и методы исследования. Путем скрещивания животных, несущих 1ох-Р участки в гене Prep1, и трансгенных животных, экспрессирующих рекомбиназу Сге под промотором сывороточного альбумина, получены животные, несущие селективный нокаут гена Prep1 в гепатоцитах. Для получения стабильных клеточных линий, несущих нокаут Prep1, были использованы ретровирусные векторы, содержащие конструкции, кодирующие shРНК, специфичные к мРНК гена Prep1. Для анализа продукции глюкозы гепатоцитами нами была использована двойная ферментная система, содержащая глюкозооксидазу и пероксидазу. Анализ уровня внутриклеточных мРНК проводился при помощи метода обратной транскрипции с последующим ПЦР в реальном времени. Для анализа внутриклеточного уровня белков нами были использованы методы иммуногистохимии, иммуноцитофлуоресценции и вестерн блоттинга.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Установлено, что Prep1 участвует в регуляции процесса глюконеогенеза в печени. Prep1 ослабляет эффект инсулина на продукцию глюкозы гепатоцитами. При этом Prep1 не влияет на активацию глюконеогенеза через сигнальный каскад цАМФ.
-
Prep1 не влияет на активность и передачу сигнала через сигнальный каскад инсулинового рецептора.
-
Prep1 контролирует внутриклеточную концентрацию и локализацию Foxol - мастер-регулятора глюконеогенеза. Влияние Prep1 на Foxo1 и последующая транскрипционная регуляция глюконеогенеза, возможно, осуществляются посредством сигнального каскада Wnt/p-катенина.
Степень достоверности и апробация работы. Научные положения и выводы, сформулированные автором в диссертации, основаны на изучении достаточного объема экспериментального материала и применении современных методов для анализа полученных данных. Основные положения диссертации были опубликованы в рецензируемых российских и зарубежных научных журналах. Результаты диссертационной работы были представлены на III Национальном Конгрессе по Регенеративной Медицине. Результаты исследований были доложены и обсуждены на заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова; полученные результаты исследований включены в
отчеты факультета фундаментальной медицины по гранту РНФ 14-35-00026 «Сахарный диабет 2 типа и метаболический синдром: выяснение молекулярных механизмов, ключевых сигнальных путей и транскрипционных факторов с целью определения биомишеней для новых лекарственных средств».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ в российских и международных научных изданиях, из них: 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК и 3 публикации в сборниках материалов научных конференций.
Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в постановке и реализации задач, решаемых в рамках диссертационной работы. Результаты, изложенные в диссертации, получены лично автором. Диссертант является первым автором всех публикаций, подготовленных по теме диссертации.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 80 машинописных листах, содержит 28 рисунков и 3 таблицы.
Сигнальный каскад инсулина
На рис.2 представлена схема инсулинового сигнального каскада в клетках печени. Инсулин является пептидным гормоном, состоящим из 51 аминокислоты. В его структуре выделяют короткую А-цепь, состоящую из 21 аминокислоты и В-цепь, состоящую из 30 аминокислот, Две эти цепи соединяются дисульфидными связями [100]. Инсулин секретируется (3-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы в ответ на повышение уровня глюкозы в плазме крови [98]. Связываясь со своим рецептором на мембране клеток, инсулин запускает сигнальный каскад, ответственный за регуляцию клеточного метаболизма и пролиферации [80]. Основными физиологическими эффектами инсулина на клетки являются: усиление входа глюкозы в клетки в мышечной и жировой ткани за счет встраивания в плазматическую мембрану переносчика глюкозы GLUT4 [113], репрессия глюконеогенеза и высвобождения глюкозы в клетках печени [90], активация синтеза гликогена [108], жирных кислот [119] и белков [86].
Рецептор инсулина относится к группе рецепторных тирозиновых киназ, к подсемейству, включающему в себя также рецептор инсулиноподобного фактора роста и рецептор, связанный с инсулиновым рецептором [107]. Рецептор инсулина является крупным трансмембранным гликопротеином, состоящим из двух сс-субъединиц, массой 135 кДа и двух (3-субъединиц массой 95 кДа, связанных дисульфидными связями и формирующими гетеротетрамерсо стехиометрией а2(32 [117]. Обе субъединицы являются продуктами протеолитического расщепления прорецептора, синтезирующегося с гена, расположенного на 19 хромосоме [103]. Связывание инсулина с рецептором обеспечивается а-субъединицами, расположенными внеклеточно. Помимо участия в связывании инсулина, сс-субъединицы ингибируют каталитическую активность (3-субъединиц в отсутствие инсулина. Связывание гормона с а-субъединицами приводит к изменению конформации рецептора, что ведет к восстановлению киназной активности (3-субъединиц и их последующему трансфосфорилированию [54].
Белок субстрат инсулинового рецептора (IRS-1) был впервые описан в 1985 году как белок с кажущейся молекулярной массой в 185 кДа, фосфорилирующийся в ответ на активацию инсулинового рецептора [123]. Позднее было установлено, что молекулярная масса IRS-1 составляет 132 кДа, а изменение его подвижности опосредуется обильным фосфорилированием по остаткам серина [111]. IRS играет ключевую роль в передаче сигнала и регуляции инсулинового сигнального каскада. Известно, что нокаут IRS-1 ведет к пре- и постнатальному нарушению развития, инсулиновой резистентности в тканях и нарушению толерантности к глюкозе [115]. В норме функционирование белка IRS-1 определяется его фосфорилированием. Данный белок содержит множественные участки фосфорилирования (Рис.3) как по остаткам тирозина (16 участков), так и по остаткам серина/треонина (более 30, на схеме не представлены) [122]. Фосфорилирование по остаткам серина и тирозина играет различную роль в функционировании данного белка и инсулинового каскада в целом. Так, хорошо известно, что фосфорилирование IRS под действием инсулинового рецептора по остатку тирозина Y608, а также дополнительно по остаткам Y460 и Y939 обеспечивает связывание 85-кДа регуляторной субъединицы фосфоинозитид-3 киназы (PI3K), что приводит к последующей активации этой киназы и передаче сигнала от рецептора инсулина в клетку [7].
С другой стороны, фосфорилирование белка IRS-1 по остаткам серина/треонина приводит к ингибированию инсулинового сигнального каскада [44]. Например, остаток серина S612 ответственен за ингибирование инсулиновой сигнализации под действием протеинкиназы С [32], а остаток серина S307 определяет ингибирование инсулинового сигнального каскада киназами JNK [96] и IKK [36].
Поскольку фосфорилирование критически важно для функционирования IRS-1, важным классом регуляторных ферментов для него являются фосфопротеин фосфатазы. В современной литературе особое внимание уделяется таким фосфатазам, как тирозиновая фосфатаза PTP1B [31] и тирозиновая фосфатаза SHP-1 [29]. Известно, что обе эти фосфатазы являются негативными регуляторами инсулиновой сигнализации. Животные, нокаутные по генам этих фосфатаз, характеризуются более высокими уровнями фосфорилирования инсулинового рецептора и IRS-1 по остаткам тирозина, а также обладают повышенной инсулиновой чувствительностью.
Как было сказано выше, активированный IRS-1 способен взаимодействовать с регуляторной субъединицей фосфоинозитид-3 киназы. Фосфоинозитид-3 киназа представляет собой гетеродимер, состоящий из регуляторной субъединицы массой 85 кДа и каталитической субъединицы массой 100 кДа [20]. Этот фермент является критически важным для реализации клеточных эффектов инсулина. Показано, что ингибиторы фосфоинозитид-3 киназы подавляют большинство эффектов инсулина на метаболизм клеток [106]. Взаимодействие регуляторной субъединицы фосфоинозитид-3 киназы с остатками фосфотирозина в IRS-1 (в первую очередь с тирозином Y608 [94]) приводит к активации каталитического домена киназы и, как следствие, к увеличению внутриклеточной концентрации фосфатидилинозитол (3,4,5) трифосфата. Фосфатидилинозитол-трифосфат, в свою очередь, способен связываться с доменом плекстриновой гомологии (PH-домен) в сигнальных молекулах, регулируя их локализацию и активность [33]. В частности, таким образом происходит изменение локализации фосфоинозитид-зависимой киназы (PDK-1), опосредующее ее взаимодействие со своим субстратом протеинкиназой B[5].Активность данного сигнального каскада также может регулироваться посредством баланса синтеза и распада фосфатидилинозитол-трифосфата. Так, гиперэкспрессия фосфатазы SHIP2,расщепляющей фосфатидилинозитол трифосфат, приводит к повышению чувствительности тканей к инсулину и увеличению активности инсулинового сигнального каскада [25].
Протеинкиназа B (PKB) или Akt, была впервые описана в 1987 году, как трансформирующий агент v-akt в составе мышиного ретровируса вируса AKT8 [110]. В той же работе был описан человеческиq гомолог гена v-akt – Akt1, который обнаруживался в клетках желудочной аденокарциномы. Основной всплеск интереса к этой протеинкиназе произошел, когда в 1995 было описано, что она активируется в ответ на инсулин в нормальных клетках [58]. Сейчас уже хорошо установлено, что эта протеинкиназа определяет основные метаболические эффекты инсулина, такие как усиление захвата глюкозы [57], репрессия глюконеогенеза [76, 90], а также усиление синтеза гликогена [26, 27, 63], синтеза жирных кислот [120] и синтеза белка [116].
Akt представляет собой серин/треониновую протеинкиназу молекулярной массой 57 кДа. В ее структуре выделяют N-концевой домен плекстриновой гомологии (РН-домен), киназный домен, а также С-концевой гидрофобный мотив (Рис.4) [118].
При активации фосфоинозитид-3 киназы и увеличении концентрации фосфатидилинозитол-трифосфата происходит его взаимодействие с РН-доменом в составе Akt, что приводит к локализации протеинкиназы на плазматической мембране, а также к изменению ее конформации, что делает возможным взаимодействие с фосфоинозитид-зависимой протеинкиназой PDK-1
Транскрипционный фактор Prep1
Транскрипционный фактор Prep1 был открыт в 1997, как белок, содержащий гомеобокс-домен, ген которого у человека расположен на 21 хромосоме, гомологичный описанному ранее мышиному протоонкогену Meis1 [21]. Обнаруженный белок был схож с гомеобокс-содержащими белками семейства Knotted, имеющимися у растений. Отсюда происходит название гена данного фермента PKNOX1. Через год была описана функция Prep1, как партнера другого гомеобокс транскрипционного фактора Pbx1 (Pre-B-cell leukemia homeobox). Вместе, эти транскрипционные факторы формируют активный димер, способный регулировать экспрессию генов ряда сигнальных молекул и ростовых факторов [9].
Prep1 представляет собой транскрипционный фактор массой 47, 5 кДа, содержащий в своем составе два консервативных мотива Meis-A и Meis-B (Табл. 1), расположенных в N-концевой части белка. Рис.8
Для осуществления своих транскрипционных функций Prep1 формирует функциональный гетеродимер с другими белками TALE. Основным партнером Prep1 является транскрипционный фактор Pbx1 относящийся к классу PBC белков [9]. В этом взаимодействии ключевую роль играет N-концевой участок Prep1. В частности, показано, что мотивы MEIS-A и MEIS-B необходимы для формирования комплекса Pbx/Prep [10, 56]. Существует гипотеза, что MEIS-A и MEIS-B в Prep1 взаимодействуют с PBCA и PBCB в Pbx1, однако точных данных по структурному анализу взаимодействий белков на данный момент нет [66]. Формирование комплекса Pbx/Prep приводит к усилению связывания транскрипционных факторов с ДНК, кроме того, увеличивается селективность связывания с ДНК – таким образом, Prep1 регулирует активность фактора Pbx1, определяя участки посадки комплекса Pbx/Prep на ДНК. Фактор Pbx1, в свою очередь обеспечивает ядерную локализацию фактора Prep1, не обладающего своим сигналом ядерной локализации.
В настоящий момент установлено, что транскрипционный фактор Prep1 критически необходим для эмбрионального развития организмов. Эмбрионы, несущие нокаут по гену Prep1, погибают на 6,5 день эмбрионального развития, не вступив в гаструляцию. Кроме того, у этих эмбрионов регистрируется обильная апоптотическая гибель клеток эпибласта [34]. В случае наличия гипоморфной мутации в геноме мышей, приводящей к продукции только 2% мРНК Prep1, развивается фенотип с меньшей летальностью, однако даже в этом случае наблюдается гибель 75% эмбрионов к 17,5 дню эмбрионального развития [35]. Гипоморфная мутация по Prep1 сопровождается дефектами развития сосудов, нарушением развития органов зрения [35], а также нарушением функционирования гемопоэтических стволовых клеток [95] Более того, животные, избежавшие эмбриональной гибели, после рождения демонстрировали ряд патологий, основной из которых является повышенная вероятность формирования опухолей. Эти исследования в конце концов привели к установлению функции Prep1 как онкосупрессора [65] и белка ответственного за защиту ДНК от повреждений [47].
В последнее время появляются данные, что Prep1 может играть важную роль в дифференцированных клетках. В частности, в 2008 году Oriente и соавторы показали, что скелетные мышцы, полученные из мышей, несущих гипоморфную мутацию по Prep1 обладают повышенной чувствительностью к инсулину, а также обладают заметно увеличенным уровнем экспрессии инсулин-зависимого переносчика глюкозы GLUT4. Сами животные при этом оказались устойчивы к индукции гипергликемии под действием стрептозоцина (селективный токсин для (3-клеток поджелудочной железы). Даже значительное снижение уровня циркулирующего инсулина не приводило у гипоморфных по Prep1 мышей к развитию гипергликемии, в то время как она развивалась у животных дикого типа [82]. Позднее было также продемонстрировано, что Prep1 вовлечен в регуляцию ответа на гипергликемические условия. В клетках, помещенных в условия гипергликемии происходит привлечение в область гена Prep1 гистон-ацилтрансферазы p300 и гистон-метилтрансферазы SET7, изменение модификаций гистонов и увеличение экспресии Prep1. Это приводит к снижению инсулиновой чувствительности клеток, уменьшению экспрессии GLUT4 и замедлению входа глюкозы в клетки [23]. Данный эффект может играть важную роль в защите клетки от избыточного поступления глюкозы и последующего гликозилирования внутриклеточных белков.
В нашей лаборатории, под руководством Д. Пенькова также изучалась роль Prep1 в контроле энергетического гомеостаза клеток и инсулиновой чувствительности. Нами было обнаружено, что репрессия фактора Prep1 сильно увеличивает эффективность инсулин-зависимой адипоцитарной дифференцировки мезенхимных стволовых клеток [2], а также повышает экспрессию переносчика глюкозы GLUT4.
В то же время, данные по влиянию Prep1 на печеночную чувствительность к инсулину крайне скудны. Ранее, в модели гипоморфной мутации Prep1 было показано, что Prep1 влияет инсулиновую чувствительность и гомеостаз глюкозы в гепатоцитах [83]. Однако, модель гипоморфной мутации является не совсем удачной для изучения метаболизма печени. Дело в том, что эмбрионы несущие гипоморфную мутацию демонстрируют значительные нарушения в формировании печени [35]. Это означает, что наблюдаемые эффекты могут быть опосредованы не только влиянием Prep1 на инсулиновую чувствительность гепатоцитов, но и нарушением развития печени в процессе эмбриогенеза. В нашей работе мы создали модель селективного нокаута Prep1 исключительно в дифференцированных гепатоцитах, с целью оценить вовлечен ли Prep1 в контроль обмена глюкозы и инсулиновой чувствительности в печени и установить механизм данного контроля.
Prep1 не влияет на инсулиновый сигнальный каскад в клетках печени
Полученные клетки были использованы для оценки участия фактора Prep1 в контроле инсулинового сигнального каскада. Ключевым событием в активации инсулинового рецептора является его димеризация и кросс-фосфорилирование по остаткам тирозина [99]. В связи с этим, в культивируемых клетках линии HepG2 мы изучили влияние нокаута Prep1 на активацию инсулинового рецептора. Для этого мы оценивали уровень фосфорилирования инсулинового рецептора по остаткам тирозина в начальный момент времени, а также через 5, 15 и 30 минут после добавления к клеткам инсулина в концентрации 100 нМ (Рис.14). Нами не было обнаружено различий в активации инсулинового рецептора в клетках с нормальным и с пониженным уровнем Prep1. В обоих случаях действие инсулина вызывало значительное (в 2-3 раза) увеличение фосфорилирования инсулинового рецептора по остаткам Tyr1150/1151, расположенным в регуляторной петле протеинкиназного домена рецептора и ответственным за активацию рецептора [124].
Следующей точкой регуляции в инсулиновом сигнальном каскаде в гепатоцитах является субстрат инсулинового рецептора – IRS-1.Этот белок является субстратом для фосфорилирования инсулиновым рецептором и мишенью для различных регуляторных сигналов, модулирующих инсулиновый сигнальный каскад. [115]. В ходе работы мы оценивали степень фосфорилирования IRS-1 по нескольким аминокислотным остаткам. Так, мы оценивали фосфорилирование остатка Tyr-608, которое отражает фосфорилирование IRS-1 под действием инсулинового рецептора, что приводит к связыванию регуляторного домена фосфотидил-инозитол-3-киназы, обеспечивающей прохождение сигнала на эффекторную киназу Akt.
Клетки инкубировали без добавления инсулина или в присутствии 100 нМ инсулина в течение 5, 15 и 30 мин. После этого оценивали уровень фосфорилирования инсулинового рецептора по остаткам тирозина (Tyr1150/1151). График представляет собой обобщение анализа трех независимых экспериментов.
Кроме активирующего тирозинового фосфорилирования, IRS-1 подвергается фосфорилированию по остаткам серина, приводящему к ингибированию инсулиновой сигнализации [44]. В наших экспериментах мы оценивали фосфорилирование остатков Ser-307 и Ser-612, фосфорилируемых стресс-киназами JNK и IKK (Ser–307) или протеинкиназой С (Ser-612). Известно, что оба этих регуляторных остатка играют важную роль в развитии инсулиновой резистентности [32, 96]. В наших экспериментах мы обнаружили, что Prep1 не влияет как на активирующее, так и на ингибирующее фосфорилирование IRS-1.
Основным эффектором инсулинового сигнального каскада, ответственным за передачу сигнала к транскрипционным факторам [76] и метаболическим ферментам [26] является протеинкиназа Б (Akt). Известно, что для активации данной протеинкиназы необходимо ее фосфорилирование по остатку Ser-473 либо по остатку Thr-308, или же двойное фосфорилирование [128]. Степень фосфорилирования этой протеинкиназы во многом определяет активность всего инсулинового сигнального каскада. В связи с этим нами был оценен уровень фосфорилирования киназы Akt в клетках линии HepG2 с нормальным и сниженным уровнем Prep1 в различные моменты после добавления к ним инсулина в концентрации 100 нМ. Мы обнаружили, что инсулин-зависимое фосфорилирование Akt при подавлении в клетках уровня Prep1 не изменяется.
Обнаружив, что нокаут Prep1 практически не влияет на динамику фосфорилирования и активации основных участников инсулинового сигнального каскада, мы предположили, что, Prep1 регулирует не процессы активации сигналинга, а, напротив, механизмы инактивации и десенситизации инсулинового сигнального каскада. Кроме того, ранее на модели животных, гипоморфных по гену фактора Prep1, была описана возможность транскрипционной регуляции фактором Prep1 экспрессии тирозиновой фосфатазы SHP-1 [83]. Эта фосфатаза способна напрямую дефосфорилировать по остаткам тирозина инсулиновый рецептор и его субстрат, приводя к снижению активности инсулинового сигналинга [29]. Кроме того, на той же модели гипоморфных животных была продемонстрирована возможная транскрипционная регуляция фактором Prep1 инозитол-5-фосфатазы SHIP2 [84] - фермента, ответственного за разрушение продукта фосфотидил-инозитол-3-киназы [25]. Оба этих фермента вовлечены в инактивацию инсулинового сигнального каскада и изменения в их экспрессии могли бы объяснить феномен повышения инсулиновой чувствительности в клетках со сниженным содержанием Prep1.
Тем не менее, в нашей модельной системе мы не обнаружили заметного влияния нокаута Prep1 на уровень данных ферментов. Суммируя полученные нами данные, можно заключить, что повышение инсулиновой чувствительности клеток печени со сниженным уровнем Prep1 не обусловлено его влиянием на процессы активации или ингибирования основных участников сигнального каскада инсулина.
Prep1 регулирует ядерную локализацию транскрипционного фактора FOXO1
Транскрипционный фактор FOXO1 является одним из основных регуляторных, элементов, обеспечивающим поддержание баланса между процессами запасания и высвобождения глюкозы гепатоцитиами [1]. Известно, что уровень внутриклеточного FOXO1 играет ключевую роль в контроле инсулиновой чувствительности клеток [79]. В связи с этим мы решили проверить как влияет нокаут Prep1 на уровень внутриклеточного FOXO1 в гепатоцитах. Используя метод Вестерн блоттинга, мы обнаружили, что общий внутриклеточный уровень транскрипционного фактора FOXO1 снижен более чем в два раза в Prep1liverKO гепатоцитах по сравнению с клетками дикого типа Рис 22.
Наша первая гипотеза состояла в непосредственной регуляции экспрессию гена FOXO1 фактором Prep1. С целью проверить этого предположения мы воспользовались методом ПЦР в реальном времени, совмещенном с обратной транскрипцией. Однако мы не обнаружили заметных отличий в уровне мРНК для транскрипционного фактора FOXO1 между гепатоцитами дикого типа и Prep1liverKO гепатоцитами (Рис. 23).
Другим механизмом, обеспечивающим контроль внутриклеточного фактора FOXO1, является изменение его внутриклеточной локализации. В периоды голодания FOXO1 локализован в ядре, где он связывается с регуляторными последовательностями в генах белков фосфоенолпируват-карбоксикиназы и глюкозо-6-фосфатазы и обеспечивает их экспрессию, тем самым стимулируя глюконеогенез [129]. При воздействии инсулина происходит быстрое фосфорилирование FOXO1 под действием протеинкиназы Б по остаткам серина и треонина (Thr24, Ser 253, Ser316), которое приводит к связыванию этого транскрипционного фактора с адаптерным белком 14-3-3, экспорту его из ядра и деградации [72, 130]. В наших экспериментах мы оценивали ядерную локализацию фактора FOXO1, а также динамику его инсулин-зависимого экспорта из ядра в гепатоцитах с нормальным и со сниженным уровнем Prep1. Для этого мы оценивали количество транскрипционного фактора FOXO1 во фракции ядерных белков, выделяемых из гепатоцитов, через 5 и 15 минут после добавления к клеткам инсулина в концентрации 100 нМ (временные точки и концентрацию инсулина использовали аналогичные описанным J. Nakae et.al [76] ) (Рис. 24).
Из представленных данных видно, что нокаут Prep1 приводит к значительному (более чем в два раза) снижению уровня ядерного FOXO1, а также ускоряет процесс экспорта этого транскрипционного фактора из ядра. Мы обнаружили, что под воздействием 100 нМ инсулина происходит полное удаление FOXO1 из ядра Prep1liverKO гепатоцитов, в то время как в контрольных клетках сохраняется приблизительно половина от исходного содержания FOXO1. Чтобы подтвердить изменение ядерной локализации FOXO1 мы использовали метод иммунофлуоресцентного окрашивания. В качестве экспериментальных точек использовались клетки без добавления инсулина и клетки, инкубированные с инсулином в концентрации 100 нМ в течение 15 минут.
Мы обнаружили, что для клеток, несущих нокаут гена Prep1, характерно сниженное содержание ядерного FOXO1, кроме того, воздействие на них инсулином приводит к практически полному исчезновению окрашивания на внутриклеточный FOXO1, что может говорить о его деградации.
Таким образом, можно сделать вывод, что повышенная чувствительность к инсулину гепатоцитов, нокаутных по гену Prep1, может быть следствием изменения ядерной локализации и снижения стабильности фактора FOXO1. Известно, что этот транскрипционный фактор играет важную роль в регуляции инсулиновой сигнализации в клетках. Существуют данные, что гепатоциты, полученные из мышей-гетерозигот по нокауту гена FOXO1 (FOXO+/-) обладают повышенной чувствительностью к инсулину [75]. Описанные гетерозиготы FOXO1+/-характеризуются сниженным примерно на 50% уровнем внутриклеточного FOXO1, при этом в отсутствие инсулина гепатоциты, выделенные из этих животных, по уровню экспрессии основных генов глюконеогенеза – фосфоенолпируват-карбоксикиназы и глюкозо-6-фосфатазы -не отличаются от клеток, полученных из мышей дикого типа. Кроме того, уровень продукции глюкозы у этих животных при голодании не отличается от такового у мышей дикого типа. В то же время повышение уровня инсулина приводит к более значительному влиянию этого гормона на клетки. Эти данные согласуются с полученными нами результатами и являются дополнительным подтверждением того, что повышение инсулиновой чувствительности гепатоцитов при нокауте Prep1 опосредуется именно снижением количества внутриклеточного фактора FOXO1.
Однако остается невыясненным, каким образом Prep1 способен регулировать ядерную локализацию фактора FOXO1. Ранее было установлено, что одной из транскрипционных целей фактора Prep1 являются белки семейства Wnt [60].Эти белки являются активаторами сигнального каскада Wnt/бета-катенина. Связываясь со своими клеточными рецепторами, белки Wnt запускают сигнальный каскад, приводящий к стабилизации и ядерной локализации белка бета-катенина. В ядре бета-катенин связывается с рядом транскрипционных факторов, регулируя Wnt-зависимую экспрессию генов.
Известно, что под контролем данного сигнального каскада находятся гены, ответственные за дифференцировку тканей, и что Wnt играет ключевую роль в развитии некоторых форм рака [68, 88]. Однако в последнее время появляются данные, что этот сигнальный каскад может быть вовлечен в регуляцию инсулиновой чувствительности. Например, полиморфизм гена белка Wnt 5b ассоциирован с риском развития сахарного диабета второго типа [55]. Более того, недавно было установлено, что бета-катенин в клетках способен непосредственно регулировать ядерную локализацию FOXO1 [64]. Исходя из этого, мы предположили, что в клетках, несущих нокаут Prep1, может происходить изменение уровня бета-катенина и, как следствие, снижение ядерной стабильности транскрипционного фактора FOXO1.