Содержание к диссертации
Введение
ГРАВА 1. Обзор литературы 26
1.1. Методы стимуляции регенерации разных тканей и органов при ишемических и дегенеративных заболеваниях в рамках регенеративной медицины 26
1.2. Генная терапия при нейродефицитах
1.2.1. Антисмысловые олигонуклеотиды 28
1.2.2. РНК-интерференция 29
1.2.3. Вирусная трансдукция 32
1.2.4. Плазмидные векторы 37
1.3. Ресурсы стволовых клеток для регенеративной медицины 40
1.3.1. Клеточная терапия при нейродегенеративных заболеваниях 41
1.3.2. Эмбриональные стволовые клетки 42
1.3.3. Мезенхимные стволовые клетки 44
1.3.4. Стволовые нервные клетки 48
1.3.5. Мононуклеарные клетки пуповинной крови (МКПК) 49
1.3.5.1. Трансплантация МКПК, их участие в повышении
жизнеспособности нервных клеток и стимулировании нейрорегенерации
1.3.5.2. Биологически активные молекулы, секретируемые МКПК
1.4. Применение генетически модифицированных стволовых клеток для
клеточной терапии 56
1.4.1.Подходы к генетической модификации клеток 57
1.4.2.Трансплантация стволовых клеток после их генетической модификации 60
1.4.3.Генетическая модификация МКПК для нейрорегенерации 63
1.5. Боковой амиотрофический склероз, терапия при помощи генетически модифицированных МКПК 64
1.6. Молекулы адгезии, представитель иммуноглобулинов — молекула адгезии L1CAM 67
1.7. Нейротрофические факторы — стимуляторы нейрорегенерации
1.7.1. Сосудистый эндотелиальный фактор роста 70
1.7.2. Глиальный нейротрофический фактор 72
1.7.3. Фактор роста фибробластов 2 74
1.8. Транскрипционные факторы 75
1.8.1. Sox2 77
1.8.2. Oct4 78
1.8.3. Функции комплекса Sox2/Oct4 79
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 82
2.1. Создание экспрессионных плазмидных векторов 82
2.1.1. Проведение полимеpазной цепной реакции (ПЦР) 82
2.1.2. Получение необходимых последовательной генов с ипользованием гидролиза ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами 84
2.1.3. Реакция дефосфорилирования нуклеиновых кислот 85
2.1.4. Проведение лигирования фрагментов плазмидных векторов 86
2.1.5. Разделение фрагментов ДНК при помощи электрофореза 87
2.1.6. Выделение рестрикционных фрагментов и продуктов ПЦР реакции из агарозного геля 87
2.1.7. Получение плазмидной ДНК 88
2.1.8. Секвенирование первичной нуклеотидной последовательности ДНК 89
2.2. Использование прокариотических клеток для получения плДНК 90
2.2.1. Приготовление и трансформация компетентных клеток E. coli 91
2.3. Использование эукариотических клеток для анализа рекомбинантных конструкций 92
2.3.1. Клетки НЕК293Т 92
2.3.2. МКПК человека – заготовка, культивирование 93
2.3.3. Трансфекция – метод переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки
2.3.2.1. Трансфекция НЕК293Т клеток с использованием синтетических катионных липидов 95
2.3.2.2. Генетическая модификация МКПК человека при помощи электропорации 95
2.3.4. Проведение анализа эффективности трансфекции 96
2.3.3.1. Флуоресцентная микроскопия 96
2.3.3.2. Пpoтoчная цитoфлуoметpия 96
2.4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков in vitro 96
2.4.1. Иммунoцитoхимические исследования 96
2.4.2. Вестерн блоттинг 98
2.5. Исследование экспрессии генов 99
2.5.1. Выделение РНК из клетoчных культуp НЕК293Т и МКПК, трансфицированных двухкассетными плазмидами 99
2.5.2. Pеакция oбpатнoй тpанскpипции 100
2.5.3. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени для количественной оценки экспрессии мРНК генов 101
2.6. Опыты in vivo 103
2.6.1. Трансгенные животные с фенотипом БАС 104
2.6.2. Трансплантация генетически модифицированных клеток трансгенным мышам G93A 105
2.7. Гистологические исследования 106
2.7.1. Обработка образцов ткани для иммуногистохимического анализа 106
2.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание 107
2.9. Программное обеспечение и статистическая обработка результатов 108
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1. Рабочая гиппотеза 110
3.2. Влияние белков нейрональной молекулы адгезии L1CAM и сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF165 на дифференцировку МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАС
1 3.2.1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов L1cam, vegf165 и egfp 113
3.2.2. Анализ экспрессии мРНК клонированных генов и биосинтеза рекомбинантных белков 120
3.2.2.1. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов vegf и L1cam 120
3.2.2.2. Анализ биосинтеза рекомбинантных белков 121
3.2.3. Генетически модифицированные МКПК, экспрессирующие EGFP, выживают, мигрируют и дифференцируются в эндотелиальные клетки и клетки микроглии в спинном мозге мышей G93A после ретроорбитальной трансплантации 123
3.2.4 Рекомбинантные белки L1CAM и VEGF165 поддерживают эндогенный потенциал МКПК дифференцироваться в эндотелиальные клетки 126
3.3. Рекомбинантные белки VEGF165 и FGF2 инициируют дифференцировку МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC, в астроциты 136
3.3.1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов vegf165 и fgf2 137
3.3.2. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов vegf165 и fgf2 139 3.3.3. Анализ биосинтеза рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 140
3.3.4. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF165-FGF2, после 14 суток трансплантации мышам G93A 142
3.4. Одновременная экспрессия рекомбинантных белков VEGF165 и GDNF поддерживает эндогенный потенциал МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC 145
3.4.1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов vegf165 и gdnf 146
3.4.2. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов vegf165 и gdnf 147
3.4.3. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-GDNF, после 14 суток трансплантации мышам G93A 148
3.5. Влияние одновременной экспрессии рекомбинантных белков GDNF и FGF2 на фенотип МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC 151
3.5.1. Создание плазмидной конструкции, кодирующей кДНК генов gdnf и fgf2 152
3.5.2. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-GDNF-FGF2, после 14 суток трансплантации мышам G93A 153
3.6. Влияние транскрипционных факторов Sox2 и Oct4 на дифференцировку МКПК после их трансплантации мышам G93A с фенотипом БАC 156
3.6.1. Создание плазмидной конструкции, кодирующей кДНК генов Sox2 и Oct4 157
3.6.2. Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов Sox2 и Oct4 158
3.6.3. Анализ биосинтеза рекомбинантных белков Sox2 и Oct4 159
3.6.4. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-Sox2-Oct4, после 14 суток трансплантации мышам G93A 160
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 166
выводы 176
- Антисмысловые олигонуклеотиды
- Получение необходимых последовательной генов с ипользованием гидролиза ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
- Выделение РНК из клетoчных культуp НЕК293Т и МКПК, трансфицированных двухкассетными плазмидами
- Одновременная экспрессия рекомбинантных белков VEGF165 и GDNF поддерживает эндогенный потенциал МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC
Антисмысловые олигонуклеотиды
Одним из наиболее перспективных методов, обеспечивающих доставку генетического материала с высоким уровнем эффективности экспрессии доставляемых генов в органах- и клетках-мишенях, представляют вирусные векторы (E. Hastie et al., 2015; M.A. Kotterman et al., 2014; C.E. Thomas, et al., 2003). Современные методы генной инженерии позволяют встраивать в геном вирусов экспрессионные конструкции, несущие последовательность одного или нескольких рекомбинантных генов. Основными составляющими подобных конструкций являются промотор, рекомбинантный ген и сигнал для полиаденилирования мРНК. В настоящее время используют экспрессионные векторы, разработанные на основе различных вирусов.
К аденовирусным векторам относят группу безоболочечных вирионов, состоящих из двухцепочечного вирусного генома, защищённого внешней белковой оболочкой икосаэдрической формы (R.G. Crystal, 2014; J.A. St George, 2003), и способных инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Несмотря на значительное преимущество вирусного гена, заключающееся в его способности принимать до 8.000 пар нуклеотидов, он также имеет и существенный недостаток – высокую иммуногенность (D.M. Shayakhmetov, 2010; B. Thaci et al., 2011) и, таким образом, возможность осложнений после первоначального введения. Более того, применение повторного введения представляется в данном случае невозможным (B.G. Harvey et al., 1999; F.H. Schagen et al., 2004). В своем обзоре Perreau и Kremer подробно рассматривают проблемы, связанные с иммунологической памятью при применении аденовирусов в клинической генной терапии (M. Perreau et al., 2006). Особенностью применения аденовирусной системы является отсутствие способности к интеграции в геном хозяина, что позволяет достигнуть лишь временной экспрессии трансгенов (K. Jooss et al., 2003). Ивестен факт того, что аденовирусы неспособны инфицировать ЦНС. Несмотря на это, учёными было установлено, что аденовирусные векторы способны перемещаться ретроградным аксонным транспортом (N.M. Boulis et al., 1999; N.M. Boulis et al., 2002; E.A. Salegio et al., 2013). Аденовирусные векторы, несущие последовательности различных терапевтических нейротрофических факторов, были успешно пременены в экспериментах на животных с различными моделями заболеваний (B.J. Baumgartner et al., 1997; Y. Manabe et al., 2002; A. Miagkov et al., 2004). Так, было показано, что доставка нейротрофического фактора GDNF при помощи аденовирусного вектора в спинной мозг мышей после его травмы способствует улучшению восстановления локомоторных функий (Y.O. Mukhamedshina et al., 2016). Эффективность доставки нейротрофических факторов при помощи аденовирусных векторов на модели болезни Паркинсона, а также слепоты и глухоты у животных, подробно описана в обзорах Kelly и Khalin (M.J. Kelly, et al., 2015; I. Khalin et al., 2015). Спообность AAV к аксональному транспорту (T.H. Hutson et al., 2016) делает их особо привлекательными в качестве векторов для доставки терапевтических генов в центральной нервной системе (ЦНС).
Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (rAAV) представляет собой ещё один перспективный вирусный вектор, обладающий большим потеницалом в применении генной терапии для лечения нейродегенеративных заболеваний. rAAV представляет собой непатогенный парвовирус человека, нуждающийся для репликации в ко-инфекции хелперным вирусом (N. Muzyczka, and Berns, K. I., 2001). Эффективность rAAV была продемонстрирована в нервной системе, при этом rAAV инфицировал главным образом нейрональные клетки (C. Burger et al., 2005; T.J. McCown, 2005). Применение rAAV на модели ишемии мозга описано в обзоре Tsai (T.H. Tsai et al., 2006). Недавние исследования указывают на улучшение способности rAVV проникать через ГЭБ для нейронально-специфической генной терапии при помощи фокусированного ультразвука (S. Wang et al., 2015). В отличие от AAV дикого типа, способного к интеграции в хромосому хозяина, рекомбинантный rAAV присутствует в клетке хозяина в виде эписомы (S. Ponnazhagan et al., 1997; B.C. Schnepp et al., 2016). К недостаткам rAAV относится ограничение на размер вставки трансгенной конструкции, размер которой не должен превышать 5 т.п.н. (J.Y. Dong et al., 1996). Попытки преодолеть данное ограничение были предприняты в 2000 году при помощи «SAVE» мотодики (split AAV vectors) (L. Sun et al., 2000). Преимуществом применения rAAV является возможность достичь долговременной экспрессии трансгенов (M.G. Kaplitt et al., 1994). Обзоры Mandel и Ojala подробно рассматривают возможность терапевтического применения адено-ассоциированных векторов (R.J. Mandel et al., 2006; D.S. Ojala, et al., 2015). Применение rAAV для лечения нейродегенеративных заболеваний приобретает все большее значение. Недавние исследования указывают на эффективную доставку терапевтических генов в ЦНС при инъекции rAAV в спинномозговую жидкость у свиней (N.C. Sorrentino et al., 2016). В другом исследовании, на модели эпилепсии у крыс было показано снижение приступов после применения rAAV, несущего последовательность нейропептида Y (C. Dong et al., 2013).
Следующую группу представляют вирусные векторы, сконструированные на основе герпесвирусов (HSV). Они обладают высокой способностью к инфекции нейронов, что обусловлено наличием природного тропизма данной группы вирусов к нервной ткани (D.J. Fink et al., 1996). HSV были пременены для доставки терапевтических генов в ЦНС на моделях ишемии мозга у крыс (M.D. Linnik et al., 1995), болезни Альгеймера у мышей (C.S. Hong et al., 2006) и атаксии Фридрейха у мышей (Y. Katsu-Jimenez et al., 2016). Герпесвирусы также способны к эффективному антеро- и ретроградному аксонному транспорту (B. Chen et al., 2016; F. Green et al., 2016). Было показано, что модифицированные герпесвирусные векторы способны устанавливать эписомную репликацию в клетке реципиента и при этом нести значительные трансгенные вставки ( 50 т.п.н.) (S. de Silva et al., 2009; J.C. Glorioso et al., 2004). К основным недостаткам данной вирусной системы относят иммунный ответ организма на вирусные белки и кратковременную экспрессию трансгенов (W.J. Bowers et al., 2003; M.A. Brockman et al., 2002). Применение вирусных векторов на основе герпесвирусов рассмотрено в обзорах Latchman, Shen и Choudhury (S.R. Choudhury et al., 2016; D.S. Latchman, 2005; Y. Shen et al., 2006).
Получение необходимых последовательной генов с ипользованием гидролиза ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
В работе по созданию рекомбинантных конструкций и их очистке в количествах, необходимых для последующих экспериментов, использовались бактериальные штаммы E.coli (Escherichia coli) XL1-Blue и JM109. С целью доставки векторов в прокариотические клетки использовался метод кальциевой трансформации (J. Sambrook, et al., 2001).
Для культивирования бактериальных штаммов готовили слабосоленую среду Лурия-Бертани (LS-LB, pH 7,0) и среду LS-LB-агар (Таблица 12). Питательные среды стерилизовали в автоклаве (Hiclave HV-85, Hirayma, Япония) в жидкостном или агарном режиме при следующих условиях: 121 С в течение 15 мин 1,2 атм. (1,02 kg/cm2). Таблица 12. Состав питательных сред LS-LB и LS-LB-агар для культивирования E.coli. Реагент LS-LB, реагенты, г/л LS-LB-агар, реагенты, в г/л дрожжевой экстракт 5 5 пептон 10 10 NaCl 5 5 агар – 15
С целью получения компетентных клеток, одиночные колонии E. coli с чашки Петри переносили в пробирки с 10 мл среды LS-LB и проводили культивирование клеток при 37 C в шейкер-инкубаторе в течение 16-20 часов. После инкубации часть культуры переносили в колбу со средой LS-LB (30 мл) и далее культивировали в шейкер-инкубаторе при 37 C. При плотности клеток OD600 = 0,5, колбу с клетками для охлаждения переносили на лёд на 10-15 мин, затем центрифугировали в течение 10 мин при 4 C, 4.100 g и убирали надосадочную жидкость. Ресуспендирование клеток проводили с использованием охлаждённого раствора MgCl2/CaCl2 (в концентрациях 10 мM и 5 мM, соответственно) и повторяли цикл центрифугирования. После этого вновь ресуспендировали клеточную биомассу в 2 мл раствора CaCl2 (0,1 М), компетентные клетки в объёме 200 мкл переносили в холодные пробирки (1,5 мл) и добавляли 0,5-2 мкл плазмиды (лигационная смесь). После инкубации на льду в течение 30 мин клетки подвергали тепловому шоку в течение 90 сек при 42 C и охлаждали на льду в течение 1-2 мин. Далее в клеточную суспензию добавляли среду LS-LB (800 мкл) и инкубировали в шейкер-термостате при 37 C в течение 1 часа. После инкубации E. coli высевали на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей антибиотик. Антибиотики выбирали в зависимости от резистентностности вектора: ампициллин (в конечной концентрации 100 мг/мл, Биосинтез), зеоцин (в конечной концентрации 25 мг/мл, Invitrogen) или канамицин (в конечной концентрации 50 мг/мл, Sigma). Высеянные на чашках E. coli инкубировали в термостате при 37 C в течение 12-16 часов (J. Sambrook, et al., 2001).
Для исследования эффективности экспрессии белков, кодируемых созданными рекомбинантными конструкциями, их биологической активности in vitro, использовали первичную и трансформированную культуру клеток человека. Клетки трансфицировали химическим и физическим методами, после чего была проведена оценка эффективности трансфекции при помощи проточной цитометрии и микроскопического анализа (T.S. Hawley, et al., 2004; J.W. Pollard et al., 1997).
Клетки НЕК293Т человека являются производной культурой клеток НЕК293 (Human Embryonic Kidney Cell-line 293), которая была получена в результате трансформации эмбриональных клеток почки человека при помощи аденовируса. Клетки НЕК293 были в дальнейшем трансфицированы геном SV40 (Т-антиген обезьяньего вируса) (F.L. Graham et al., 1977). В настоящем исследовании клетки НЕК293Т были использованы для тестирования эффективности экспрессии созданных двухкассетных плазмид перед их использованием для трансфекции МКПК человека. Клетки НЕК293Т культивировали в модифицированной Дульбекко среде (DMEM, Invitrogen), содержащей 2 мМ L-глутамина (Sigma), 10% сыворотки крови плодов коровы (FBS, Sigma) и антибиотики пенициллин и стрептомицин в конечной концентрации 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл, соответственно (Sigma).
Заготовку крови пуповины человека проводили после получения информированного согласия у рожениц, находящихся в здоровом состоянии, срок гистации у которых составлял 37-40 недель (родильные дома, г. Казань). Проводился тщательный дородовой скрининг на наличие противопоказаний к донорству клеток ПК (присутствие вирусов гепатита B и C и иммунодефицита человека). Забор ПК осуществлялся специально обученным персоналом роддома по инструкции Банка стволовых клеток КГМУ. После рождения ребёнка, кровь сразу собирали из отсечённой пуповины в пластиковые ординарные контейнеры ЦДФА-1 (CPDA-1 250 GG, Terumo, Baxter, США), которые представляют собой стандартную систему для взятия донорской крови. В течение последующих 12 часов после забора ПК доставляли в изотермическом контейнере в Банк стволовых клеток. Промежуток времени между сбором крови и выделением МКПК составлял не более 16-18 часов. Мононуклеарную фракцию выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла (I.J. Fuss et al., 2009). Ядросодержащие клетки крови выделяли в соответствии с ранее опубликованной методикой (T.S. Hawley, et al., 2004). В пробирке объёмом 50 мл на 25 мл раствора фиколла (плотность 1,077 г/мл, ПанЭко) аккуратно наносили равный объём ПК, смешанной с антикоагулянтом (колебания соотношения кровь/антикоагулянт в пределах 1:1-3:1) с помощью автоматического дозатора. После центрифугирования при 720 g в течение 20 мин получали четкое разделение крови на четыре фракции: эритроциты, фиколл, лейкоциты и плазму. Лейкоцитарная фракция была отобрана в отдельную пробирку, ресуспендирована в растворе DPBS в соотношении 1:2 и отцентрифугирована при 305 g в течение 15 мин. Клеточный осадок был ресуспендирован в 10 мл раствора DPBS, после чего повторно отцентрифугирован при 305 g в течение 15 мин. С целью удаления эритроцитов, клетки были ресуспендированы с использованием гипотонического лизирующего буфера (pH 7,3), содержащего NH4Cl (0,168 M), KHCO3 (0,1 M), EDTA (1,27 мМ). Заключительный этап включал в себя отмывку клеток раствором DPBS. Культивирование МКПК после выделения проводили в среде RPMI-1640 (Sigma), содержащей 10% FBS (Sigma) и антибиотики пенициллин и стрептомицин (конечная концентрация 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл, соответственно, Sigma), в инкубаторе (37 С, влажная атмосфера, 5% СО2). Клетки своевременно пассировали и меняли питательные среды в соответствии со стандартными протоколами (J.W. Pollard, et al., 1997) (Pollard & Walker, 1997). Эксперименты с культурами клеток проводили в стерильных условиях (ламинарный шкаф Herasafe Termo, Германия, второй уровень защиты) при соблюдении общепринятых правил работы с эукариотическими клетками.
Выделение РНК из клетoчных культуp НЕК293Т и МКПК, трансфицированных двухкассетными плазмидами
Для оценки экспрессии рекомбинантных белков, первоначально исследовали клетки НЕК293Т, трансфицированные рекомбинантными плазмидами, несущими клонированный ген egfp (pBud-VEGF165-EGFP, pBud-EGFP), в ходе флуоресцентной микроскопии через 48 часов после химической трансфекции. Как показано на Рис. 11, наличие экспрессии репортёрного белка EGFP свидетельствует в пользу эффективной генетической модификации клеток НЕК293Т (при визуальном анализе приблизительно 80-90% клеток экспрессировали EGFP). В данных культурах экспрессия EGFP наблюдалась также после 10 дней с момента трансфекции клеток, что говорит о стабильности генетических конструкций.
Рис. 11. Флуоресцентный анализ клеток НЕК293Т через 48 часов после трансфекции плазмидными конструкциями, экспрессирующими репортёрный ген egfp. A-A , pBud-VEGF165-EGFP, B-B , pBud-EGFP, С-С , Nonransfected (контроль, нетрансфицированные клетки). A, В, С, фазово-контрастная микроскопия, A , В , С , флуоресцентная микроскопия. Увеличение 40.
Для анализа экспрессии EGFP был проведен вестерн блоттинг эксперимент с использованием АТ против GFP в лизатах клеток HEK293T, трансфицированных двухкассетными плазмидами pBud-EGFP и pBud-VEGF165-EGFP. Была выявлена экспрессия EGFP (27 кДа) в лизатах обеих клеточных культур (Рис. 12). Данные биохимического анализа, таким образом, коррелируют с результатами иммунофлуоресцентного анализа экспрессии репортерного гена egfp в трансфицированных клетках HEK293T (Рис. 11). Результаты эксперимента подтвердили плазмидную трансфекцию клеток с последующим синтезом белковых продуктов генов vegf165 и egfp.
Вестерн блоттинг анализ экспрессии белков в клеточных лизатах HEK293Т, трансфицированных 1 – pBud-EGFP, 2 – pBud-VEGF165-EGFP, 3 – контроль, нетрансфицированные клетки, с помощью АТ к зеленому флуоресцирующему белку (GFP) через 48 часов после трансфекции. Основная полоска – белок GFP с молекулярной массой 27 кДа.
Генетическая модификация МКПК человека плазмидными конструкциями была проведена методом электропорации, как описано в главе «Материалы и методы». Эффективность трансфекции оценивалась экспрессией репотёрного гена еgfp спустя 24 часа с помощью проточной цитометрии. Анализ оценки количества трансфицированных клеток при помощи проточной цитометрии показал, что процент EGFP-позитивных клеток составил от 25 до 30%, при этом выживаемость клеток составила 60-70% (Рис. 13).
Генетически модифицированные МКПК, экспрессирующие EGFP, выживают, мигрируют и дифференцируются в эндотелиальные клетки и клетки микроглии в спинном мозге мышей G93A после ретроорбитальной трансплантации
Для оценки способности генетически модифицированных МКПК мигрировать в область спинного мозга после их ретроорбитальной трансплантации и экспрессировать рекомбинантные белки, срезы спинного мозга 1-ой экспериментальной группы животных (трансплантация МКПК, трансфицированных плазмидой pBud-EGFP) исследовали на активность плазмидного вектора по экспрессии EGFP в трансплантированных клетках. C помощью конфокальной лазерной микроскопии были выявлены EGFP-позитивные клетки, как в белом, так и сером веществе, через 14 суток после трансплантации МКПК (Рис. 14). Полученные данные свидетельствуют об эффективности экспрессии рекомбинантного белка в мононуклеарных клетках на данном сроке исследования.
После идентификации трансплантированных МКПК в спинном мозге G93A мышей был проведён иммунофлуоресцентный анализ с АТ против HNA и маркёров клеток ЦНС, указанных в таблице 15. Положительные результаты были получены с маркёром эндотелиальных клеток CD34 (HNA+CD34+-клетки, Рис. 15) и маркёром микроглии Iba1 (HNA+Iba1+-клетки, Рис. 16). Генетически модифицированные HNA+Iba1+-клетки по своим морфологическим признакам напоминали клетки микроглии. Они имели небольшое тело овальной формы с многочисленными короткими отростками (Рис. 16). вектором pBud-EGFP (группа №1), в спинном мозге трансгенной мыши G93A. А-D — иммунофлуоресцентный анализ с АТ против ядерного АГ человека (HNA) и маркёра эндотелиальных клеток (CD34). A — ядерный АГ человека (красный); B — ядра, идентифицированные при использовании раствора бис-бензимида (синий); С — маркёр эндотелиальных клеток CD34 (зеленый); D — объединение панелей A-C — демонстрирует HNA+CD34+-клетку. Измерительная линейка: A, 25 мкм.
Полученные результаты в экспериментах по трансплантации генетически модифицированных МКПК у 1-ой экспериментальной группы (плазмидный вектор pBud-EGFP) мышей G93A свидетельствуют о том, что трансплантированные генетически модифицированные МКПК могут, с одной стороны, служить источником рекомбинантных ростовых и трофических факторов, с другой, они способны дифференцироваться в паренхиматозные клетки ЦНС. Так, EGFP-трансфицированные клетки, экспрессирующие репортёрный ген, могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки (CD34-позитивные) или клетки микроглии (Iba1-позитивные). Другими словами, МКПК реализуют свой эндогенный потенциал, т.е. моноциты дифференцируются в макрофаги, а прогениторные эндотелиальные клетки в эндотелий.
Одновременная экспрессия рекомбинантных белков VEGF165 и GDNF поддерживает эндогенный потенциал МКПК, трансплантированных трансгенным мышам G93A с фенотипом БАC
Функциональное значение VEGF165 для выживания и дифференцировки нейральных клеток было описано в главе 3.2. GDNF, в свою очередь, способен поддерживать выживание нейронов после их дифференцировки и стимулировать рост аксонов посредством активации специфических рецепторов (S. Behrstock, et al., 2006; L.F. Lin, et al., 1993; M.W. Moore et al., 1996). Важно отметить, что стимуляция GDNF рецепторов поддерживает выживание мотонейронов в экспериментах in vitro и in vivo (M.W. Moore, et al., 1996; W.P. Rakowicz et al., 2002), включая выживание мотонейронов у постнатальных мышей с моделью аксональной травмы (R.W. Oppenheim et al., 1995) и моделью БАС (R.R. Islamov, et al., 2015; D. Krakora et al., 2013). Более того, синергический эффект VEGF и GDNF на продолжительность жизни и состояния крыс с моделью БАС был отмечен при трансплантации МСК, генетически модифицированных при помощи лентивирусных конструкций (D. Krakora, et al., 2013). Принимая во внимание вышеуказанные исследования, для усиления внутреннего потенциала МКПК (экспериментальная группа №6), мы создали вектор, содержащий последовательности нейротрофических факторов VEGF165 и GDNF, генетически модифицировали МКПК методом электропорации и провели анализ влияния синергического эффекта VEGF165 и GDNF на дифференцировку трансплантированных МКПК в спинном мозге трансгенных мышей G93A с фенотипом БАC.
Создание двойного экспрессионного вектора pBud-VEGF165-GDNF было аналогично стратегии, описанной в предыдущих главах. На основе нуклеотидных последовательностей (база данных GeneBank), мы разработали специфические праймеры для ПЦР-амплификации полной открытой рамки считывания гена gdnf (Таблица 3). 5 - и 3 -праймеры содержали адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции KpnI и XhoI, с помощью которых ген был клонирован в экспрессионный плазмидный вектор pcDNA3.1(+) (Invitrogen, США). Матрицей для ПЦР-амплификации гена послужила плазмида pLVPT-GDNFTR-KRAB (J. Szulc et al., 2006). Ко экспрессирующий вектор был собран на основе pBudCE4.1 (Invitrogen, США) субклонированием гена gdnf под контролем промотора CMV по сайтам рестрикции HindIII и XbaI и изоформы vegf165 под контролем промотора EF-1 по сайтам рестрикции KpnI и XhoI (Рис. 29). Конечное подтверждение получения экспрессионной плазмиды pBud-VEGF165-GDNF осуществляли с помощью ДНК-секвенирования с применением стандартных вектор-специфических праймеров.
После электропорации вектора pBud-VEGF165-GDNF в МКПК был проведен количественный анализ экспрессии мРНК клонированного гена vegf165 (Рис. 30). Проведенный анализ показал существеное увеличение уровня мРНК исследуемого гена vegf в трансфицированных клетках по сравнению с уровнем соответствующих мРНК в трансфицированных egfp клетках. Данные анализа свидетельствуют об эффективной экспрессии рекомбинантного гена в МКПК in vitro.
Экспрессия мРНК гена vegf в МКПК человека, трансфицированных плазмидой pBud-VEGF165-GDNF. Относительный уровень экспрессии мРНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени со специфичными праймерами и пробами TaqMan. Уровень экспрессии мРНК в нетрансфицированных клетках (NTC — non transfected cells) был принят за 100%. Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных плазмидным вектором pBud-VEGF-GDNF, после 14 суток трансплантации мышам G93A
Иммунофенотипирование генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих VEGF165 и GDNF, с применением маркёра эндотелиальных клеток обнаружило CD34-позитивные клетки в спинном мозге трансплантированных мышей (Рис. 31). Однако, такие маркёры, как нейрональная форма -III тубулина, микроглии (Iba1), олигодендроцитов (OSP) и астроцитов (S-100) не были идентифицированы в HNA-позитивных клетках (Рис. 32).