Введение к работе
Актуальность дзоолемы. Одним из центральных событии в метаболизме клетки является сопряжение процессов генерирования энергии и биосинтеза ее компонентов, с особенности это касается микроорганизрдов, разнообразие и изменчивость местообитания которых определяет гибкость реакции их метаболизма на изменение потока энергии. Несмотря ка то, что проблеме энергетического сопряжения уделяется значительное внимание, в особенности в последние ~-3 десятилетия, конкретные механизмы, лежащие в его оскоае, всё ещё далеки от полного пошшания. Значитель-:пзл стимулом в исследовании данной проблемы послу::-аиш работы Митчела ( Mitchell,-9ЄІ), которые разработкой своей хемиосмотической гипотезы . сопря;:вния внес революционный вклад в новое понимание механизмов сопряжения дыхания и іюсфорнлпрозания. Наряду с энергетичз сдсим сопряге-нием на мембранах существует относительно самостоятельная система сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма в целом, определяющая эффективность использования генерированной различными путями энергии з реакциях биосинтеза.
і последнее время в научной литературе, глазным образом зарубежной, растет поток работ, посвященных изучению роли долиаминов в многочисленных биосинтетических процессах, местом их регуляторного воздействия является не единичная метаболическая реакция или путь, а совокупность процессов макромолекулярного синтеза, включая репликацию диК, транскрипцию, трансляцию, биосинтез Фосшолшшдов и другие процессы жизнеобеспечения клетки, причем как правило на уровне функционирования надмолекулярных структур \ Morris, Marton,IS8I; Sohu-Ъег,1У6&). Ъ то :ке время практически не уделяется внимания изучению взаимодействия полиамидов и ферментов их синтеза с энергогенерирую-щими системами клетки. Прямая зависимость скорости многочисленных биосинтетических процессов от уровня полиаминов делает актуальной задачу поиска факторов, регулирующих величину их внутриклеточных пулов. Предпринятое в настоящей .диссертационной работе изучение влияния энергетического состояния на уровень полиаминов в клетке и активность ключевых ферментов их синтеза послужило основанием для разработки концепции о роли системы синтеза полиаминов как механизма сопряжения энергетического и конструктивного метаболизма у Е.соїі.
Исследование взаимоотношений мезду энергетическим состоянием клетки, уровнем полиаминов и скоростью роста клеток имеет большое значение не только для понимания механизмов энергетического сопряге-ния у микроорганизмов, но и представляет значительный интерес для медицины с точки зрения изучения закономерностей роста опухолей и канцерогенеза. Прямая зависимость мезду уровнем полиаминов и ско-
ростью злокачественного роста (Берлинских, Залеток,19В7) делает актуальный изучение механизмов, регулирующих внутр:жлеточный пул по— лаашнов, С этой точки зрения микроорганизмы являются удобной моделью для обощешш и проверки изученных закономерностей на различных уровнях организации живого, включая эукариотическиь клетки человека.
деля я задачи исследование. Исходя из вышеизложенного, основное цельв настоящей работы является поиск и изучение признаков, характеризующих степень сопряЕанкя энергетического и конструктивного метаболизма, биохимических механизмов, легших в его основе, а такае путей адаптации микроорганизмов к условиям энергетического разобщения.
В соответствии с целями исследования конкретными его задачами является;
-
Разработка эффективных методов определения нуклеотидоз а полиаминов.
-
Ивучензе энергетического статуса клетки как признака, характери-зудаэго степень сопряжения энергеглческого- а инструктивного иетаоо— лязод.
-
Изучение регуляторних эффектов энергетического состояния клетки на активность системы синтеза поляаыинов.
-
Изучение роли взаимодействия аденилатно^- и полиаминсиятезирунцей систем в регуляции функционального состояния нуклеиновых кислот.
-
изучение роли системы синтеза полиамшюв г регуляции фосфатипид-ного обмена мембран и хункцпоннровании мембраносвязанных фермвнтов (Н+АТмза, дыхательная цепь).
-
Изучение роли полиаминсиктезирулцей системы в ионном транспорте
7. Изучение взаимодействия зкергогенерирушпх и г.однаїлннсинтезирую-
цзй систеїі клетки как механЕзма адаптации к стрессовые воздействиям.
Рпу^дпя пог^гча к теоретическая значимость» На пути к достижению
цодсії поотоящсё рьботн разработаны оригинальные Еысокочувстотельиыа
.'„под;';: и;;;элзл.зшк: адзнЕлоип: куклоотпдеа (Ткгченко,1Э91) и полиоми-
\пг. (ТшгсЕО, ЧулзнсзДЕ'НЗе),, благодаря когсрим стело езеиїізцм ро-
:!;с;;::с еосг&гйошш:: задач. Z -аацью этих и другзс соЕрсілзшін;: кзто-
Гїг і:':срз;::: црзводогіі сараллслыше ксслздашпгя зіієргетичесіїсго есс-
ї-.у:.:ї: і^отп; і: azsv іс„»; ac.i zi сіглтзсо кол-" -usce как е клеточ
ка: г.:;;:3:-. їг,і: леї i~z-> с^р ссої^ сілігглі „ тлгд: іші; spc,0r->'
;::>с":ср:;бллз пегзх ' г с -лпл'^.' cr]_.oct п.Тателілио п jH -
іху';',"";;':; темперах,-*- 5 сс* - * с " ^ : ^-^ ^ поісоїдгіз супг: і:с-
о:::.,/,:—- — ілоп;.;.їс г " , г .с г л г гдг содорц:т;с,! ЛЇС
ъ клетке л активностью ключевого оврмекта биосинтеза полиакинов, ор~ нитиндекарбоксилазы (Одл). В опытах in vitro эта зависдшсть наода свое полное подтвергдение, когда чфязиологпческие"концентрации АТФ стимулировали активность ОДК на 200-300. На основании этих экспериментальных данных вперше с^юрмулярована гипотеза о роли системы синтеза голиамкнов как одной из точек соьряяения энергетического и конструктивного метаболизма (Ткачешсо, Чудинов,1989б), Впервые показана роль транспортних процессов полиаминов з обеспечении гомеостаза их внутриклеточной концентрации, обеспечивающей оптимальную скорость биосянтетнческих процессов в клетке. Впервые изучено вляяние стрессовых воздействий на процессы связкваюш полиакиноз с ДНК, которые сопровоздаются характерными изменениями её электронношкроскопичес-кой структуры, благоприятными для синтеза адаптивных белков (Ткачен-ко и соавт.,1992). Впервые показана роль транспорта полнамина пут-ресцина в адаптации клеток к шэлочному шоку и в модальных экспериментах доказана его роль в обеспечении гомзостаза внутриклеточного-калия при участии специфического кембранного переносчика путресцин / 2л*" (Ткаченко, Чудаков, 1990). Впервые изучена роль полиашнов в определении фоссрлжшдного состава жмбран в ответ на изкснение энергетического состояния в процессе перехода в анаэробиоз ( Иса-ohenJso et al,IS9I).
С теоретической точки зрения результаты настоящей рзботы еяосяї вклад в лучшее понимание процессов регуляции метаболизма не только шкробяой клетки, но и могут послуетгь еттулом для .сходных исследований более слоашх,- организкенккх уровней. В настоящее вре;,и извэс-тно, что эукарпотнческие клетки злокачественных опухолей П.КВТ ВНу?--риклеточные уровни полиакшгов, в десятки раз правнизЕГСГО такоЕые і нормальных тканях. Полученные нами данные ютля би стимулировать новые идеи не только в объясяэннз дашюго фзноюпа, но и в разработки* подходов к лечению онкологических заболеваний.
Практическое значекттэ работы. Разработка оригинальных высокочувствительных катодов опредзлония адеклловнх нуклеотпдов СІкачопко, 1991) я полиа:,Еиов (Ткаченко, Чудиков,1969аУ как одет пз этапов изо* тояксЭ раооти открывает гярокнэ возшеюсти sx использования з различных обл^-тях озолоти я !*едяшты. Высокая информативность ^^т показателе is глі: аодор.тлшіз адеінідатоз н полаашшоз з клеттп :; ї:к~ логачасіскх гадететях органдзка даат зозкогтюсть по величине этта: параметров судить о состсяіізї энергатичэсшго п конструктивного г-етз-болгзка. Это отпркшот зозглзшоста для рздисИ дпэгеосест заболеваний, когда нзругапля пзтсйодазг^ з организма е*до из прггэлн х рзззя-"-}
леток,І987), что уровень полиаминов з дрозд д моче человека возрастает ухв на этапе контакта клеток с канцерогенами и достигает зксо-ких значенні: на ражих этапах развития онкологических заосдеззкик. Разработанный нами метод определения полиамидов обладает рядом преимуществ перед ранее известными. Нараду с высоко:: чувствительностью он обладает высокой производительностью и сравнительной простото!:, что дает возможность за коротки:: срок обследовать большое кодичестзо людей, -<етод использован нами для кассового обследования населения по раннему обнару-г.бнш онкологических заболезаки.: в ряде медицинских учреждений г. Перми и получил хороше отзывы, .-.а основании этих наблюдений нами составлена программа по расайреним сети диспансеризации населения с целью ранней диагностики онкологических заболевании, которая представлена для рассмотрения в комиссии <ї»нда прикладных исследовании г.Перми, другой запатентованный наїли метод олределеккд адениловых куклеотндоз нашел применение для ранней диагностики заболевании сердечно-сосудисто:: системы, легких и крови, которыд такие использован з медицинских учреждениях г.Перми, выявленные в настоящей работе закономерности о соотношении энергетического и конструктивного .метаболизма з условиях переходных состоянии, з частности аэробно-анаэробных дереходоз, использованы нами з рамках хоздоговорной работы для разработки биотехнологии очистки сточных вод .,гка-ликоксд атомно:: злектростанции от неорганического .^ос^ора. ..ракти-часкал значимость настоящей работы реализована так..-:е о использовании ее результатов а чтении лекций для студентов биологического факультета Пермского госуниверситета.
Апробация работы. Результаты работы сыли доложены и представлены на всесоюзных конференциях:"Теория и практика управляемого культизи-рования ми:^роорганизмоз'Ч-лез,ї'зЬІ) /'Управляемое культивирование иинрооргашіз:.юз'Ч"УіЦішо,і»со),'Структурно-Функциональная организация клеток микроорганизмов'\2удіно,1Ьо7), V-иосинтез вторичных кетаболи-
ТОВ'ЧлуЦЖІО.ІУо'/ ) ,"іКЄрГЄЇ1ГЧЄСКИЄ аспекты КЛеТОЧНОЯ ФИЗИОЛОГИИ"Ыу-
циио.ІУЬс),'Лимитирование и ингнбирование роста микрэоргакизмэЕ'Ч...,-щино,хЭь»),"Регуляция .-ликробкого метаболизма'Ч"Удино,іі>оі(),"„олеку-лярные механизмы и регуляция энергетического обмена"(Пущино,х-иь), "лонкый транспорт и регуляция пункции к."етки''иенинград,і»ї<'С); на международных конференциях: "14 международный конгресс по биохимии" Uipara,IS>ob),'X Объединенный симпозиум биохимических обществ ч/СС?-Гд?, ..чеханизмы регуляции клеточнод актив;-іости'Чїашкент,ІЬе-.-),"..іеа-дународная конференция по хромзтогра^іш'Чп.Новгород,ІЬьг), "«іикро-биология охраны биосферы з регионах У^ала и северного лрикаспия" (Оренбург,хзу1),".леждународ.кии симпозиум по проблемам токсикологии
-о—
и прикладної: экологии"(.йосква-Пермь,1551); ка 71 съезде ВМО (Рига, IS80), на /II съезде 3,.10 (Алма-Ата, 1985). Результаты работы были доложены ка Московском отделении ВБО Ыосква,1989).
Пуоликацпп. По материалам диссертации опубликовано 45 работ.
Объем работы, .'.'.атериалы диссертации изложены в монографической v-орме на 2ЬЬ стр. маї^ілопиского текста, включая 13 таблиц и 77 рисунков. Список литературы содержит 255 библиографических источников 35 на русском и 220 на иностранных языках.