Введение к работе
Актуальность проблемы.Одной из наиболее-актуальных проблем современней энзимология является изучение особенностей строения а функционирования олигомерннх ферментов, состоящих из идентичных субъединиц. В настоящее время известно немало таких ферментов, и для большинства из них показано наличие кооперативных взаимодействий между активными центрам олигомера, что, очевидно, служит одним из основных объяснений физиологического сшсла существования таких ферментов. Как правило, подобные ферменты действуют в точках пересечения различных метаболических путей и наиболее подвержены регуляторним воздействиям.
Всеми этими свойствами обладает и объект нашего исследования-а-кетоглутаратдегидрогеназа, первый, декарбоксилируицтЛ компонент полиферментного Щ-комплекса,*/катализируюцего одну из ключевых" реакций метаболизма.
Реакция окислительного декарбоксилирования КГ представляет собой единственный путь его Оиодеградации и локализована в месте пересечения метаболических путей: КГ - общий интермедиат обмена белков и углеводов. Кроме того, декарооксилирование КГ - единственная. реакция цикла Кребса, приводящая к образованию макроэргической связи на субстратном уровне.
«/Принятые сокращения: ДТКБ - 5,5'-дитио-бис (2- нитробензойная)кислота; ДТТ - дитиотреитол; ДТЭ - дитиоэритритол; ДЭП - диэтилпирокарбонат;. КГ -а-кетоглутарат; КГД -чх-кетоглутаратдегидрогеназа; КГД-комплекс а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс; Лиги? (Лип(ЗН)г) -. липое-вая кислота (восстановленная); НАД* (ВДН) - никотинамидаденинди-нуклеотид (восстановленный).
Исследование ВД-комшіекса представляет интерес и с той точке зрения, что он является классическим примером надмолекулярной организации ферментов. Изучение принципов строения и функционирования полкферментных комплексов остается важнейшей задачей современной этимологии. Вместе с тем, выяснение структурной и функциональной организации полиферментного комплекса невозможно без всестороннего изучения его компонентов. Для понимания механизмов действия КГД-кошлекса особое значение имеет детальное исследование его первого компонента, осуществляющего пусковую, необратимую и лимитирующую стадию общей реакции и являющегося мишенью большинства регуляторних воздействий.
Известно, что КГД из грудной мышцы голубя является дилером, состоящим из идентичных субъединиц. Оставалось, однако, неясным, необходима ли олигомерна'я структура для функционирования фзрментг или отдельная субъединица обладает способностью к катализу. В тої, случае, если изолированный мономер активен, олигомерной структуре, очевидно, должна принадлежать иная функция: она может играть важную роль в регуляции фермента, основанной на взаимодействии активных центров соседних субъедашиц.
Ранее была выявлена негиперболическая зависимость скорости КГД-реакции от концентрации субстрата /Гомазкова, Красовская, 1979/ и кофермента /Гомазкова и др., I981/.указывающая на мексубъ единичные взаимодействия в димере фермента. Методом химической мо дификации КГД ДЗП было показано, что наряду с этой формой фврмен та, субъединицы которой кооперативно взаимодействуют в катализе (форма I),существует форма КГД (форма II), активные центры которс функционируют независимо /Буник, Гомазкова, 1985/. Это давало вог мощность предполагать существование в клетке регуляторных механік мов, переключающих работу активных центров фермента с согласоваї ного типа функционирования на независимый.
Цель работы. Целью настоящего исследования явилось решение двух основшх задач. Во-первых, выяснение вопроса о том, обладает ли активностью субъединица КГД, или для функционирования этого фермента необходима олигомэрная структура. Во-вторых, выявление факторов, определяющих согласованное действие субъединиц в димере Форш КГД, обладающей кооперативными свойствами (Форш I). Для этого необходимо было провести сравнительный анализ двух форм фермента, последовать структурные и функциональные различия этих форм и возможности их взаижнгревращения.
Наущая новизна работы. С помощью иммобилизации КГД на BrCN-сефарозе была впервые получена активная мономерная форма фермента. Показано, что удельная активность субъединицы формы КГД, обладающей кооперативными свойствами (формы г), вдвое превышает активность димера. Уменьшение активности фермента при ассоциации субъединиц в олигомер дает возможность предполагать, что в димере возникает кооперативность активных центров в процессе катализа. Таким образом, установлено, что олигомэрная структура КГД не является необходимой предпосылкой для катализа, а существенна для регуляции фермента.
Исследованы физико-химические и кинетические свойства формы фермента, не выявляющей кооператшюсти по данным инактивации ДЭН. Показано, что эта форма представляет собой димер, субъединицы которого не отличаются по молекулярной массе от субъединиц формы I, но межсубъединичные контакты ослаблены. Выявлено отсутствие в форме и кинетической кооперативности по связыванию субстрата и коферменте . Существенным структурным отличием КГД-и от формы і является пониженное содержание в ней SH-групп. Установлено, что при восстановлении двух SH-rpyrm формы II (наиболее, быстро реагирующей и недоступной ДТНБ в наивном .белке) происходит появление кинетических свойств, характерных для КГД-І. Исследовано восстановление
SH-групп КГД-ІІ природними ноно-- и даюлами. Обнаружена высокая эффективность восстановления фермента, дкгидролипоевой кислотой -интермедаатом полной реакции КГД-комплекса, что позволило сделать предположение о специфичности ее действия. Показано, что при обработав НАДН КГД-комплекса происходит превращение КГД в форме Я в форму І в составе комплекса. Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность и кооперативные свойства КГД могут регулироваться окислительно-восстановительным состоянием клетки. При повышении уровня восстановительных эквивалентов, приводящем к восстановлению липоевой кислоты в.составе комплекса, она, в свою очередь, монет восстанавливать Щ-коыпонент, превращая его в форму, обладающую более низкой каталитической эффективностью вследствие согласованного, поочередного функционирования ее активных центров в процессе катализа. Выявление участия в этом процессе тиол-дасульфидного обмена приближает нас к пониманию структурных пред-посылок молекулярных механизмов,, которые лежат в основе переключения независимого функционирования активных центров фермента на реализующуюся через мексубъединичные взаимодействия каталитическуі кроперативность.
Практическое значение работы. Разработан метод иммобшшзацаї КГД, что открывает перспективы применения иммобилизованного ферме пта в различных областях биотехнологии. Получены новые сведения регуляции активности КГД, кофакторами которой являются широко ис пользуемые в фармакологии тиашшгшрофосфат (кокарбоксилаза) и ли поевая кислота, что мокет иметь значение для медицины.
Апробация работы. Материала исследования доложены на Всесоог ной конференции го применению ферритов в биохимических анализе (Вильнюс, 1984); на 8-м и 10-м объединенных симпозиумах биохишчес ких обществ СССР и ГДР (Рига,1985; Ташкент,1883); на 5-й п 5-й Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Тбилиси,1385, 1989); і
5-м Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии ' (Кобулети, 1985); на 5-м Всесоюзном биохимическом съезде (Киев,І986); на Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Москва,1986); на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва,1989); в отделе биохимии кивотной клетки Межфа-культетской ПШЛ им.А.Н.Белозерского и на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ (Москва,Г990)..
Публикации. По материала5/! диссертации опубликовано 13 работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (в котором рассматриваются сведения о КГД-компоненте полиферментного КГД-комплекса, методы изучения и биологическая роль четвертичной структуры ферментов, построенных из идентичных субъединиц, а также исследования, посвященные роли обратимой'моли-* фикации SH-груіш ферментов клеточными тиолами в регуляции метабо,-лнзма), описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (235 ссылок). Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 9 таблиц и 32 рисунка.