Введение к работе
Актуальность проблемы: Развитие механизмов устойчивости к
клеточной гибели является основной движущей силой в прогрессии опухолевого
роста и представляет собой одну из ключевых проблем для современных
исследований канцерогенеза. Митотическая катастрофа (МК) – это
привлекательная мишень для преодоления резистентности опухолей в текущих
терапевтических подходах. Индукция МК относится к перспективным
направлениям в развитии противоопухолевой терапии по ряду причин. Во-
первых, опухолевые клетки более чувствительны к активации МК в связи с их
тетраплоидностью или анеуплоидностью, и, соответственно, к митотическим
аберрациям. Во-вторых, если в стандартных методиках противоопухолевой
терапии для элиминации раковых клеток используются высокие дозы
цитотоксических агентов, то для активации МК достаточно сублетальное
воздействие (Huertas D, 2012). МК является следствием нарушенного или
неудачного митоза, возникающего либо в процессе, либо сразу после него, что
сопровождается определёнными морфологическими изменениями. Они
включают в себя микронуклеацию (когда хромосомы или их фрагменты не распределяются равномерно между дочерними ядрами) и мультинуклеацию (появление двух или более ядер аналогичных либо гетерогенных размеров, вследствие неправильного разделения хромосом в процессе цитокинеза). Ранее нами установлено, что МК, вызванная повреждением ДНК, не является независимой формой клеточной гибели, а представляет собой стадию, предшествующую апоптозу/некрозу (Vakifahmetoglu H, 2008). К сожалению, на данный момент, молекулярные каскады, регулирующие баланс между МК и выбором последующих событий, остаются малоизученными.
Большой интерес как у исследователей, так и у клиницистов вызывают
митохондрии, двумембранные органеллы, играющие центральную роль не
только в энергетическом обеспечении клетки, но и в процессах клеточной
гибели. В патологии, митохондрии способны как стимулировать клеточную
гибель, так и участвовать в ее подавлении. Было показано, что во многих
случаях «точка невозврата» в клеточной гибели связана именно с
митохондриями (Gogvadze V, 2009), а подавление биоэнергетических функций данных органелл является одним из факторов, участвующих в ингибировании апоптоза (Gogvadze V, 2011). Повреждение митохондрий часто сопряжено с развитием различного рода заболеваний, включая и онкологические. Только в редких случаях, опухоли с мутантным митохондриальным геномом являются доброкачественными (Zong W, 2016). Изменение функций митохондрий напрямую связано с перестройкой клеточного метаболизма. Особенности метаболизма раковых клеток используются для мониторинга опухолей и обнаружения метастаз. Стоит только упомянуть, что не менее 70% опухолей человека характеризуются гиперэкспрессией генов, кодирующих ферменты гликолиза (Altenberg B, 2004). Создание противоопухолевых препаратов, воздействующих на митохондрии, митоканов (mitocans, производное от MITOchondria and CANcer), позволяет целенаправленно воздействовать на эти органеллы при терапии рака (Neuzil J, 2013). Таким образом, выявление роли митохондрий в регуляции МК может существенно способствовать повышению эффективности противоопухолевых препаратов и применяемых стратегий лечения.
Цель исследования:
Изучение роли митохондрий в регуляции МК.
Задачи исследования:
-
Проанализировать стимуляцию МК в ответ на действие агентов, повреждающих ДНК, в клеточных линиях колоректального рака.
-
Исследовать экспрессию основных регуляторов клеточного цикла (белков р53 и р21), активирующихся в ответ на повреждения ДНК после индукции МК и вовлеченных в регуляцию митохондриального пути апоптоза.
-
Оценить функциональное состояние митохондрий (интенсивность дыхания, мембранный потенциал, уровень активных форм кислорода (АФК), динамику)) после индукции МК.
-
Выявить роль антиоксидантов в регуляции МК.
-
Изучить сигнальные каскады, активирующиеся после индукции МК и
определить их взаимосвязь.
6. Исследовать роль митохондриальных белков семейства Bcl-2 (Bcl-xL и Mcl-1) в регуляции МК, апоптоза и аутофагии.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
-
МК развивается в ответ на сублетальные дозы ДНК-повреждающих агентов, доксорубицина и колцемида, в клеточных линиях различных этиологий.
-
Индукция МК вызывает функциональные изменения митохондрий.
-
Подавление программируемой клеточной гибели (апоптоза) в присутствии антиоксидантов приводит к накоплению клеток в состоянии МК в ответ на воздействие околопороговых доз ДНК-повреждающих агентов.
-
Индукция МК стимулирует развитие аутофагии и апоптоза. Преобладающий путь клеточной гибели зависит от уровня МК и белка-регулятора 14-3-3.
-
Анти-апоптотические белки семейства Bcl-2 (Bcl-xL и Mcl-1) влияют на степень МК, а также на взаимодействие процессов аутофагии и апоптоза.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В данной работе получены оригинальные данные, раскрывающие молекулярные механизмы взаимодействий путей гибели клеток. Впервые было установлено, что МК стимулирует развитие аутофагии и последующего апоптоза. Было показано, что преобладающий путь развития клеточной гибели зависит от степени активации МК. Была показана роль митохондрий при индукции МК. Выявлена роль анти-апоптотических белков семейства Bcl-2 (Bcl-xL и Mcl-1) в регуляции взаимодействий между МК, аутофагией и апоптозом. Была продемонстрирована независимость индукции МК от АФК. Было показано, что свойство МК - предшествовать различным типам гибели - не зависит от типа клеток, а митохондрии могут являться важными модуляторами в выборе конечного типа гибели клеток. Таким образом, полученные данные способны внести существенный вклад в выработку стратегий, направленных на преодоление резистентности опухолей.
Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность результатов, приведенных в диссертации, обеспечивается корректным использованием современных широко применяемых биохимических
и молекулярно-биологических методов исследования, а также большим объемом воспроизводимых результатов. Полученные данные были опубликованы в 2-х статьях в международных высокорейтинговых рецензируемых журналах и доложены на Международной молодежной конференции "Программируемая гибель клеток в биологии и медицине" (Москва, 2012); на 20-ой международной конференции ECDO (Рим, 2012); на 22-ой международной конференции ECDO (Крит, 2014); на VI Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике (пансионат «Звенигородский», Московская область, 2014) работа была удостоена Диплома 2ой степени. Апробация диссертации состоялась 9 июня 2017 года, протокол №1.
Личный вклад автора.
Данное исследование полностью выполнено автором, включая анализ литературных данных, разработку экспериментальной части, получение результатов и их обработку. Выводы сделаны на основе оригинальных данных автора.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 182 листах машинописного текста и
состоит из списков использованных сокращений и терминов, введения, обзора
литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения
результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы,
благодарностей. Диссертация иллюстрирована 28 рисунками и 5 таблицами. Библиография включает 323 названий.