РОЛЬ ЛЕГОГЛОБИНА, МЕТЛЕГ0ГЛ0БИНРЕДУХТАЗЫ И АСК0РБИНАТ0КСИДАЗЫ В КИСЛОРОДНОМ ОБМЕНЕ КЛУБЕНЬКА ЛЮПИНА Баширова, Нина Федоровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Известно, что легоглобин синтезируется в клубеньках бобовых растений в результате эффективного симбиоза бактерий рода RhUo&uun и высшего растения. Клубеньки, содержащие легоглобин, интенсивно фиксируют молекулярный азот. Эффективное функционирование аэотфлксирующей системы в клубеньках бобовых растений осуществляется при очень низких р0₂ в бактероидцоа зоне клубенька. В то же время известно,что АТФ, необходимая для осуществления процесса азотфиксацш, синтезируется в результате дыхания бактероидов. Очевидно, при аэрации клубенька одновременно с беспрепятственный поступлением азота к бактероидам поток кислорода должен регулироваться. Как известно, дыхание бактероидов осуществляется за счет кислорода, доставляемого дегоглобином. Легогло'бии способен присоединять кислород, только когда железо в группе хека находится в двухвалентном состоянии, аналогично гемоглобину и мио-глобину животных. Для эритроцитов человека доказано существование в них фермента метгемоглобпнредуктазы / Jttffi, 1974/, поддергивающей гемоглобин в физиологически активном состоянии; данные об аналогичной ферментной системе в клубеньках бобовых растений отсутствуют.

В клубеньках люпина нами были впервые обнаружены ферменты: метлегоглобинредуктаза /мет-1_6 -редуктаза/ и аскорбинатокезда-эа, участвующие в кислородном обмене клубенька. Аскорбинаток-сидаза, ш полагаем, может играть роль "барьера", препятствующего прохождению избытка кислорода к бактеропдной зоне клу -Сенька, осуществляя таким образом защиту нитрогеназы. Роль мет-Lb -редуктазы заключается, по нашему предположению, в поддержании легоглобина в физиологически активном восстановленном состоянии, в котором он обладает очень большим сродством к кислороду.

- Изучение как легоглобина, так и обнаруженных нами фермен
тов - мет- |.Ь -редуктазы ж аскорбпнатоксидазы, представляется
очень важным с точки зрения нахождения оптимальных условий для
аффективной работы гошбиотических азотфшесируюшдх систем бобо
вых растений!. -*—^-.т -

} ;."' *. : ::Х'-_; **<*.?. і

^{/. і tiJr2<&}

- 2-Цель и задачи исследования. Цель» настоящей работы являлось изучение легоглобина люпина и обнарукешшх наш ферментов мет-Цб -редуктазы и аскорбинатоксидазы. Bunt поставлены следующие задачи: изучение гетерогенности легоглобина люпина методом изоэлектрлческого форсирования; изучение рола отдельных макрокоыпонентов легоглобина в процессе аэотфиксацни суспензиями бактероидов; выделение и очистка мет—Ц>—редуктазы и исследование ее свойств; изучение активности мет-LS-редуктазы в процессе вегетации люпина, исследование влияния . мет- L6 -редуктазы на процесс азотфпксации суспензиями бактероидов в присутствии кпслородпереносящих гемопротеидов; выделение и частичная очистка аскорбинатоксидазы, изучение распределения активности аскорбинатоксидазы в тканях клубенька.

Научная новизна. Впервые обнаружено присутствие в клубеньках люпина ферментов: ^лет-16 -редуктазы и аскорбанатоксидазы. Разработан метод выделения мет- L6 -редуктазы из клубеньков люпина и изучены ее некоторые свойства. Предложен метод определения активности мет-Lb-редуктазы. Показана положительная корреляций мет-Lb -редуктазпой активности с содержащем легоглобина в клубеньках в процессе вегетации растений. Установлено, что азотфиксируодая активность бактероидов значительно ' стсядулируется кислородперенослцлмя гемопротеидаин в присут-., стали мет-L6-редуктазы. Вперше проведено изучение роли отдельных макрокомпонентов легоглобина люпина в процессе азот-фиксации суспензиями бактероидов и в присутствии мет- LS -редуктазы. Предложен метод частичной очистки аскорбинатоксидазы из клубеньков люпина. Показано, что аскорбинатоксидазная активность в основном локализована в коре клубенька. Активность аскорбинатоксидазы понижена при старении клубеньков л при не-вффективпом симбиозе.

Практическая ценность. Изучение кислородного обмена клубеньков бобовых растений и роли в этом обмене легоглобина , мет— L6 -редуктазы и аскорбинатоксидазы способствует выяснению механизмов процесса восстановления молекулярного азота сим-бнотическими азотфиксирующшш системами. Расшифровка этого процесса, как известно, имеет огромное значение о тонки зре—

кия повышения содержания в.почве усваиваемых растениями азотистих соединений, а, следовательно, повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Материалы диссертации были долонены на V Ваковском коллоквиуме /Канев,1Э7б/, а такяе на сов-местных коллоквиумах лаборатории энзимологш Института биохимии им. А.Н.Баха и кафедры биохимии и зерповедения МТШШ.

Публикации. Опубликовано 4 работы, отражающие основное содержание диссертация, 2 находятся в печати.

Объем работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературц, описания методов исследования и использованных материалов, обсуждения полученных результатов, выводов и сгаска цитируемой литературы /170 ссылок/. В обзоре литературы рассматриваются данные, посвященные изучение легоглоби-на различных бобовых растений. Рассмотрен вопрос о физиологической роли легоглобина на основе современных исследований и приведены данные об особенностях функционирования азотфиксирующей системы в клубеньках бобовых растении.

Материалы и метода исследования

В работе объектом иедлелокпття являлись корневые клубеньки люпина желтого / Lupinus taleu-S L. /, сорт Быстрорастущий 4, селекции Новозыбковской опытной станцап. Семена лапина были инокулироваш перед посевом эффективным отакмом Rhuotium /359 а/. Клубеньки собирали на различных фазах вегетации растений в зависимости от условий эксперимента.

Для препаративного получения легоглобина / L6 / люпина и его компонентов наїли была разработана модификация метода выделения и очистки Lb люпина, предложенного ранее /Мелик -Саркисян с соавт.,1969/. При гомогенизации клубеньков использовала поливашілшірролидон для защиты Lb /Kochetat., 1967/ от контакта с полифенолами растительной клетки. Удаление сопутствующих Lb белков осуществляли хроматографией на биогеле Р-ЗО и последующей хроматографией на даэтиламиноэтил целлюлозе ДБ-52.

-4-. '

Выделение бактероидов проводили, как описано у Дайхин-штейн с соавт.,1974/.

Изучение 16 методом изоэлектряческого фокусирования проводили по Свенссону и Вестербергу /Stf«nsson, 1962; VesUtEei^,

Stfensson, 1966/ о использованием естественного градиента рН, стабилизированного сахарозой в термостатируемой при 4колонке объемом НО «л /LKB 8І0ІД Изоэлектрическую фокусировку /ИЭФ/ суммарного свежевыделенного препарата L6 а его основных фракций \Л-1 и L6-H проводили с использованием амфолинов диапазона рН 4 - 6 при конечной концентрата последних Т%. На колонку подавала напряжение 500 в, сила тока составляла 5 ма в течение первых десяти часов и I ма в конце опыта. Разделение длллось 48 часов. С целью получения более полного разделения компонентов L6 , различающихся на 0,024),03 ед..рН,ШФ проводили в более узком интервале рН. Для получения узкого градиента рН использовали двойной метод ИЗО. В первом опыте при создании градиента рН в колонку вводили анфолины рИ 4-6, конечная концентрация которых составляла 4#, По завершении опыта сфокусированные в узком интервале рН белки использовали для второго опыта, в котором градиент рН обеспечивался уже имеющимися в растворе белка амфолишши. В обоих опытах на ' колонку подавали напряжение 1000 в, причем анод был расположен в нижней части колонки* Сила тока составляла в первом опыте 13 - 14 и в конце 5 на, во втором опыте 2 и 0,6 ма , соответственно. Первый опыт продолжался 24, второй - 72 часа. По завершении ИЭФ фракции объемом 1,2 мл собирали со скорое — тью 18 мл/час. Эдюцию белков регистрировали по поглощению при 280 нм при помощи денситометра "1Ыссогс1 II" /LKB 8300^а/. Определение величины рН в полученных фракциях проводили с помогав» рН - метра "рН-340" при t в 4, Каждый опыт по ИЭв проводили по 3 - 4 раза. Спектры поглощения записывали на регистрирующем спектрофотометре марки Unlearn 5Р-700. Фракции белков предварительно диализовали против раствора I Ы

WaCfB 0,01 М К-фосфатном буфере рН 6,3 для удаления саха- -розы в амфолинов /Ctuast, Vesleibetg» 1968/. Спектры поглощения исходных препаратов 1_6 снимали в растворе 0,01 И К-

фосфатного буфера рН 6,3.

Млоглобин из спттншх мипщ кашалота очндали методом /Mima. 2акІеІаЄ.,і964/. Производные L.6 ; LfcV^O/ - ферри-Lfe , высокоспиновая форма; ХЛґ/CW/ ~ цианферри- ц, , низкоспнно-вая форма; L60₂ ^{- окои}~1в ; производные компонентові^-U-I и LB-1I, а также MBVHViQ/ и М60₂ получали, как описано ранее /Шаронов о соавт.,1973/. Определение концентрации лего-глоблна и миоглобина проводили спектральным методом, используя коэффициент молярной экстинкции 9,25.10^^--1 при Л в 525 Ht.i. Нами было показано, что данная длина волны является изосбестической точкой спектров L&M^O/i \Л*/СЫ'/ и \Л2* так же, как и для спектров окон- и метгемоглобина /Qua-st, VestcTfiei} ,1968/,

Определение азот^иксигующей активности бактероидов проводили по скорости восстановления ацетилена в._: этилен / Hatdn ttaC.,1973/. Условия инкубации бактероидов были разработаны нами совместно с И.А,ИноэемцевоЙ. Наибольшее стимулирование азотфиксиругаей активности изолированных бактероидов наблюдалось при концентрации геыопротеида 0,5 ыМ, объеме проби І.мл, количестве бактероидов 50 мг. Газовая фаза содержала /в им Нд /: 02 - 15, ацетилена - 152 и аргона до 600, В опытах использовали гемопротепды: суммарный препарат L& из клубеньков люпина, его отдельные компоненты L&-I и 18-II, полученные методом ионообменной хроматографии на ДБ-52, Мб . При изучении влияния гемопротеидов на азотфиксируюцую активность бактероидов в присутствии мет-L6-редуктазы использовали препараты мет-1.6-редуктазы из растворимой фракции клубенька, очищенной хроматографией на биогеле Р-30.

Измерение поглощения кислорода бактешяламя проводили на полярографе L Р7 /ЧССР/ в ячейке с закрытым платиновым электродом /Шольц, Островский,1975/, В ячейку помещали 20 мг бактероидов в 2 мл 0,1 М К-фосфатного буфера рН 7,4. Концентрация сукданата в ячейке составляла 12 ыМ. Температура опыта 28.

Выделение мет- L6 -редуктазы проводили из растворимой фрак-ции клубенька и из белков, выделяемых бактероидами при инкубации. Локализацию фракции с мет-ЦБ -редухтазноЗ активностью' из "

растворимой фракции клубенька определяли методом дробного вы
саливания сульфатом аммония.'Мет-1&~редуктазная активность
была обнаружена во фракции 40-S0 % насыщения сульфатом аммо
ния. После центрифугирования J30 мин при 23000 а осадок бел -
ков о мет- Ub -редуктазной активностью растворяли в млншаль- .
ном количестве К-фосфатного буфера рН 7,4 и хроматографиро -
вали в колонке /60x2,3 см/ на биогеле Р-30, уравновешенном
0,01 М К-фосфатным буфером рН 7,4. При данных условиях хро
матографии мет- L6 -редуктазная активность обнаруживалась в I
фракции. Белки I фракции высаливали сульфатом аммония до 80 %
насыщения и обессоливали на колонке с биогелем Р-2 при элю-
ции 0,002 М К-фоофаткым буфером рП 7,0. Полученный раствор
хроматографироваля на ионообменнике ДЭАЗ-сефаееле. Принцип
работы колонок с Д>АЭ-оефаселем и их приготовления перед
хроматографией такой же, как и для ДЭАЭ-сефадексов. Колонку
размером 35x18 см уравновешивали 0,002 її К-фосфатным буфером
рН 7,0. Проводили ступенчатую элхидю К-фосфатным буфером
рН 7,0 возрастающей ионной силы: 0,03 М; 0,1 М; 0,2 М; 0,3 М.
Сбор фракций проводили на автоматическом коллекторе "Шнярак"
фиріш LKB. Скорость выкапывания составляла 42 їм/час. В про
цессе хроматографии проводили запись профиля элюции белков
при Л в 280 на на спектрофотометре *5рмог<і". Мет- Lb-редук-
тазную активность обнаруживали во фракции, актируемой 0,2 III
буфером. -. *

Мет-LS —редуктазу. выделяемую бактероидами_г получали при инкубащш'двадды опаїтих бактеро;ідов при комнатной температуре при встряхивании на качалке в течение 15 часов в 0,01 М ' К-фосфатиом буфере рН 7,4. Буфер содержал 50 »М сукцинат Wa, s I mMMj²*, 0,3 М сахарозу при отношении бактеро;ідов к буферу 1:1. Бактероиды отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 23000 g . Центрифугат служил источником редуктазы. Фракцию белков, содержащую редукгазу, выделяли из центрифугата высаливанием сульфатом аммония при pll 6,8 в пределах насыщения от 40 до 80 %. После обессоливания на колонке с биоге -лем Р-2, уравновешенным 0,002*Ы К-фосфатным буфером рН 7,0 , проводили хроматографию на ионообменнике ДОАЭ-сефаселе в та-

_ 7 -

ких хе условиях, как и при выделении мет-|_В -редуктазы из растворимой фракции клубенька. Мет-Lo-редуктазная актив -ность также была обнаружена во фракции, влюируемой 0,2 М буфером.

Изучение активности мет— L6 -редуктазы проводили спек — трофотометраческим методом. В качестве субстратов мет-Lfi-редуктазы били использованы L&* Mbt H6^V» окисленный пито -хром сД0₂. ^^б активности редуктазы судили по скорости восстановления соответствующего субстрата. Регистрацию спектров поглощения восстанавливаемых гемопротеидов проводили через определенные промежутки времени или ле автоматически записывали скорость восстановления гемопротшдов при соответствующей длине волны. Все опыты по восстановлению гемопротеидов мет- L6 -редуктаэой проводили при комнатной температуре. При изучении восстановления 0,1 мМ растворов гемопротендов неочищенными препаратами мет-1Б -редуктазы использовали в качестве доноров электронов как НАШ, так и НАДСН при конечной концентрации 1,8.10-%. Опиты по восстановлению проводили в аэробных условиях в X «л оптических кюветах или в таких же кюветах о герметичными пробками в отсутствии газовой фазы. Реакцию начинали добавлением НАДІЇ или НАДЗН. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Зресог<А". В длительных опытах в качестве антисептика применяли тимол. При определении активности мет- L6 -редуктазы аз растворимой фракции клубенька в процессе ее очистки субстратом служил цатохром с, как наиболее быстро ею восстанавливаемый. В I см оптическую кювету помещали опытную смесь объемом 2 мл, которая содержала: 0,05 мМ цатохром с , 2,5.10""% метиленовую синь и соответствующее количество мет-16-редуктазц. Реакцию инициировали добавлением НАДІ при конечной концентрации 3,6.10 М. Контрольная кювета содержала все компоненты, кром НАДІ. После перемешивания автоматически записывали скорость восстановления плтохрома с мет-¹ U6 -редуктаэой по изменению оптической плотности при Л, »550 нм. За единицу активности мет-Lfi-редуктазы принимали изменение оптической плотности в 0,01 в I мин. Удельную активность выражали в единицах активности на

I иг белка.

Для опытов по изучению активности мет-Lb -релуктлзы в процессе вегетации растений использовали неочзщенше препараты редуктазы, полученные при инкубации бактероидов, выделенных на различных стадіях развитая растений. Иссользовалл фракцию белков, высаливаемую от 40 до 80 % насыщения сульфатом аммония. ОбессоленшШ на колонке с биогелем Р-2 препарат мет-Lfc -редуктазы добавляли в I см оптическую кювету к раствору окисленного миоглобина. Реакцію начищали добавлением НАШ и сразу же измеряли величину оптической плотности данного раствора при Д. = 582 им /А полоса поглощения Мв0₂/. Повторное измерение оптической плотности проводялії через I час. Об актив -ности мет- L6 -редуктазы судили по величине изменения оптической плотности за I час, вызываемого тем количеством мет-16 -редуктазы,которое выделяется I г сухого веса бактероидов.

Изучение влияния рН па активность мет- L6 -редуктазы про— водили в оптических кюветах. Использовали 0,1 М К-фосфатныЙ буфер следуюцах значений рН: 5,59; 5,91; 6,47; 6,98; 7,38; 8,04; 8,68; 9,45, Активность мет-IS -редуктазы определяли по восстановлению И6⁺» концентрація которого в пробе составляла 0,1 ыЫ; концентрация метяленовой сини - 2,5,10^-. В' каждую пробу добавляли по 0,05 мг очищенного препарата мет- .

L6 -редуктазы ,* полученного путем хроматографіш на даАЭ-се-фаселе. Реакцию начинали добавлсіием НАДІ при конечной концентрации 3,6.10^- и после перемешивания записывали ско -росгь восстановления Мб* при Д = 562 ни. При расчетах для построена кривой максимальную скорость восстановления при оптимальном значении рН- принимали за 100$. Измерения рН буферных растворов проводили стеклянным электродом на -рН-метре "рН-340". Все опыты вели при комнатной температуре

20.

Изучение специфичности мет- Lft -редуктазы по отноаению к > кофакторам и субстратам проводили с очищенным на ВЭАЭ-сефасе— ле препаратом ыет-иь-редуктазц, Записывали скорость восстановления гемопротеидов при Я = 574 им для L60„, при X = 562нм для Мб0₂, при А о, 577 нм для Нб0₂, при Д » 550 да для восста-

V

новленного цнтохрома с . В качестве кофакторов использовали НАДІ при конечной концентрации 3,6,10 И.

Определение аскорбинатоксидазиой активности'в тканях клубенька и корнях люпина проводили полярографическим методом. Гомогенати получали растираіпієгл в ступке с 0,ї М К-фосфатішм буфером рН 7,4 при соотношении 1:6. Красную бактероидную зону клубенька тщательно очлаали от перемеікащнхся с ней бес -цветных участков. Кору клубенька срезали скальпелем в виде тонких пленок. Корни использовал» целиком. Для получения фракции.растворимых белков гомогенати центрифугировали 15 мин при 23000 о, . Наделение и частичную очистку препарата аскорбинатоксидазы проводили из растворимой фракции клубенька по следующим этапам; I — внсаливание сульфатом аммония растворишх белков клубенька в пределах насыщения 55-80 % При рН 7,2; II - фракционироваше в колонке с биогелем Р-30, как указано в пункте 2 "Методов исследования? Аскорбинаток-сидазная активность обнаруживалась в I фракции. Об аскорби-натоксидазной активности фракций растворимых белков клубенька, тканей клубенька или корней люпина судили по скорости поглощения кислорода из инкубационной среди при окислении аскорбината. Объем инкубационной смеси составлял 2 мл 0,1 Ы К-фосфатного буфера рН 6,4. В проби вводили 0,1 - 0,3 иг балка растворимой фракции или 35-38 иг гомогената или 20 мг бактероидов. Реакцию начинали добавлением аскорбината, концентрация которого составляла 6 мМ, Опити вели при "t = 28. Измерение поглощения кислорода проводили акперометрическкм методом Діольц,Островский, 1975/ на полярографе LP7 /ЧОСР/ в ячейке с закритим платиновым электродом. Скорость окисления сукндната /при концентрации 22 ыи/ определяла в тех асе условиях.

Для определения оптимума рН аскорбинатоксидазы клубеньков использовали 0,1 М ацетатний буфер рН 4,4 - о,7 и 0,1 К К-фосфатный буфер рН 7,5 - 7,9. Величана рИ регистрировали стеклянным электродом. В опыте использовали препарат аскор-банатоксидазы после его очистки на биогеле Р-30.

Белок определяли по Лоура / LouJru 1 at., 1951/.

- ю -