Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Кальпаиновая система 12
1.1. История открытия кальпаинов 12
1.2. Доменная структура - и m-кальпаинов 13
1.3. Cа2+-индуцированный механизм активации кальпаинов 14
1.4. Субстраты кальпаинов 15
1.5. Регуляция активности кальпаинов 16
Глава 2. Структура и функциональные свойства гигантских мышечных белков тайтина/титина и небулина – субстратов кальпаиновых протеаз 18
2.1. Современные представления о структурно-функциональных свойствах тайтина/титина 18
2.2. Структура и функциональные свойства тайтина в разных зонах саркомера 21
2.3. Структурно-функциональные свойства небулина и его расположение в саркомере 25
Глава 3. Изменения в мышцах при развитии алкогольной миопатии 28
3.1. Острая и хроническая формы алкогольной миопатии 28
3.2. Влияние хронической алкогольной интоксикации на транскрипцию и трансляцию 30
3.3. Влияние хронической алкогольной интоксикации на активность mTOR сигнального пути синтеза белка 31
Резюме 33
Глава 4. Материалы и методы 34
4.1. Хроническая алкоголизация крыс 34
4.2. ДСН-гель-электрофорез и Вестерн-блот анализ кальпаина и кальпастатина 35
4.3. ДСН-гель-электрофорез тайтина и небулина и денситометрия 36
4.4. Определение уровня фосфорилирования тайтина 38
4.5. Подбор праймеров с использованием программы Vector NTI Advance 11 38
4.6. Выделение тотальной РНК 40
4.7. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени 40
4.8. Фракционирование ДНК методом электрофореза в 2% агарозном геле 41
4.9. Измерение активности кальпаинов набором
Calpain Activity Assay Kit (Abcam) 41
4.10. Статистическая обработка данных 41
Глава 5. Результаты и обсуждение 43
5.1. Изменения веса тела и веса поперечно-полосатых мышц хронически алкоголизированных крыс 43
5.2. Исследование содержания -кальпаина и его аутолизированных изоформ в поперечно-полосатых мышцах хронически алкоголизированных крыс 46
5.3. Изменения содержания тайтина и небулина, а также экспрессии генов этих белков в поперечно-полосатых мышцах хронически алкоголизированных крыс 50
5.4. Исследование содержания кальпастатина (ингибитора кальпаинов) в поперечно-полосатых мышцах хронически алкоголизированных крыс 60
5.5. Исследование общего уровня фосфорилирования тайтина и небулина в поперечно-полосатых мышцах хронически алкоголизированных крыс 63
5.6. Влияние хронической алкогольной интоксикации на экспрессию генов исследованных белков 66
Заключение 68
Выводы 70
Cписок литературы
- Cа2+-индуцированный механизм активации кальпаинов
- Структура и функциональные свойства тайтина в разных зонах саркомера
- Влияние хронической алкогольной интоксикации на активность mTOR сигнального пути синтеза белка
- Фракционирование ДНК методом электрофореза в 2% агарозном геле
Cа2+-индуцированный механизм активации кальпаинов
Термин «кальпаин» (кальций-зависимый фермент семейства папаина) был предложен в 1980 году (Murachi et al., 1980), хотя впервые этот фермент был выделен в 1964 году из мозга крыс (Guroff, 1964) и в 1968 году из скелетных мышц животных (Huston, Krebs, 1968). 1970-х годах ген этого белка получил название CANP (calcium-activated neutral protease) – ген кальций-активируемой нейтральной протеазы (Dayton et al., 1976a,b). В 1989 году было предложено использовать названия -кальпаин (кальпаин-1) и m-кальпаин (кальпаин-2) для указания того, какая концентрация ионов кальция (микромолярная для -кальпаина или милимолярная для m-кальпаина) необходима для активации этих протеаз in vitro (Cong et al., 1989).
К настоящему времени известно, что кальпаины – семейство широко распространенных нейтральных цитозольных не лизосомальных Са2+-зависимых протеаз (Suzuki, 1990). Эти ферменты обнаруживаются как в цитоплазматической, так и в мембранных клеточных фракциях, при этом их содержание и соотношение в тканях разных животных различается (Banik et al., 1998). К настоящему времени известна доменная организация кальпаинов, структура их активного центра, механизм связывания с ионами Са2+ (механизм активации), а также нуклеотидные последовательности генов, кодирующих эти протеазы. Из-за широкой тканевой локализации - и m-кальпаины получили название «повсеместные» («ubiquitous», «conventional», «typical») (Goll et al., 2003). Помимо «повсеместных» - и m-кальпаинов в различных тканях млекопитающих также экспрессируются в меньшем количестве другие изоформы этого белка: кальпаин 3a или p94 в скелетных мышцах, кальпаин 8a и кальпаин 8b в гладких мышцах (Sorimachi et al., 1989), кальпаин 9 и 10 в сердце (Campbell, Davies, 2012), кальпаин 6 в плаценте (Dear et al., 1997), кальпаин 11 в яичках (Dear, Boehm, 1999) и др. Показано, что мРНК кальпаина 7, кальпаина 10, кальпаина 13, кальпаина 15 (Suzuki et al., 2004) содержится во многих тканях живых организмов (Dear et al., 1997).
Анализ полностью или частично расшифрованных геномов организмов показал, что у бактерий, большинства простейших, грибов и растений присутствует один ген кальпаина, тогда как у всех позвоночных животных, а также у ряда паразитарных кинетопластид имеется несколько генов кальпаинов. Большинство ферментов, кодируемых этими генами, еще не выделены и не исследованы (Бондарева, Немова, 2008).
На данный момент известно шестнадцать компонентов кальпаиновой системы: 15 протеаз и 1 эндогенный ингибитор - кальпастатин (Goll et al., 2003, 2008). Основными по содержанию и наиболее распространенными изоформами кальпаинов являются -кальпаин (кальпаин-1) и m-кальпаин (кальпаин-2) (Suzuki, 1990). - и m-кальпаины позвоночных имеют гетеродимерную структуру и состоят из 2 субъединиц - малой (консервативной, 28 кДа, имеющей также название регуляторной), и большой (вариабельной, 80 кДа, имеющей также название каталитической). Каталитическая субъединица кальпаинов - продукт разных генов (в частности, у человека CAPN1 и CAPN2), тогда как регуляторная субъединица является продуктом одного гена (CPNS1) и едина для обеих изоформ (Aoki et al., 1986). Показано, что обе субъединицы - и m-кальпаинов имеют доменную структуру: каталитическая (80 кДа) субъединица состоит из четырех доменов (I-IV), регуляторная субъединица (28 кДа) - из двух доменов (V-VI) (Hata et al., 2001) (Рис. 1). Последовательность N-концевого домена I не имеет гомологов среди известных полипептидов. Каталитический домен II содержит Cys105 (субдомен IIа), который вместе с His262 и Asn286 (субдомен IIb) формируют каталитическую триаду (Hosfield et al., 1999; Strobl et al., 2000). Согласно данным кристаллографического анализа, домен II каталитической субъединицы состоит из двух субдоменов (Hosfield et al., 1999; Strobl et al., 2000). Последовательность домена III также не имеет гомологов среди известных полипептидов и функционально классифицируется как С2-подобный домен (Sorimachi et al., 1997; Hata et al., 2001). Домен III содержит 2 Ca2+-EF-hand-участка, тогда как С-концевая часть субъединицы (домен IV), содержит 4 EF-hand-Са2+-связывающих сайтов (Goll et al., 2003). Таким образом, вариабельная единица содержит 6 EF-hand-Са2+-связывающих мотивов. На малой субъединице находятся 5 EF-hand последовательностей. Домен III вариабельной субъединицы обеспечивает сопряжение каталитического домена II и Ca2+-связывающего домена IV, что приводит к Са2+-индуцированным конформационным изменениям (Tompa et al., 2001).
Структура и функциональные свойства тайтина в разных зонах саркомера
В таблицах 2–5 приведены данные четырех независимых экспериментов по хронической алкоголизации крыс. После 3-месячной хронической алкоголизации, проведенной по методу Lieber, DeCarli (1989) с использованием сбалансированного по питательным веществам жидкого корма, не было обнаружено достоверных изменений веса крыс и веса исследуемых поперечнополосатых мышц (Табл. 2). Однако обнаружена тенденция к снижению параметра «отношение веса мышцы к весу тела животного» для m. soleus и m. gastrocnemius крыс алкогольной группы (Табл. 2). Подобные изменения были зарегистрированы для m. soleus и сердечной мышцы крыс, хроническая алкоголизация которых проводилась в течение 3-х месяцев по методу Lang et al. (1999) с использованием агара, содержащего спирт (Табл. 3). При этом наблюдалось достоверное снижение веса алкоголизированных крыс (на 10%, P 0.05), а также веса m. soleus и сердечной мышцы (на 15–16%, P 0.05) (Табл. 3). Таким образом, полученные результаты указывают на тенденцию к развитию алкоголь-индуцированных атрофических изменений в вышеуказанных мышцах крыс, алкоголизированных в течение 3-х месяцев.
После 6-месячного моделирования алкогольной миопатии с использованием агаровых блоков, содержащих спирт (Табл. 4), а также 20%-ого раствора этанола (Табл. 5), зарегистрировано достоверное снижение веса крыс (на 20%, 0.01 и 22%, 0.01, соответственно), веса сердца (на 22.5%, 0.01 и 26%, 0.01, соответственно) и веса m. soleus (на 30%, 0.01 и 43%, 0.01, соответственно). При этом обнаружено достоверное снижение на 15% ( 0.05) и на 24% ( 0.01), соответственно, параметра «отношение веса m. soleus к весу тела животного» (Табл. 4, 5). Полученные результаты свидетельствуют о развитии алкоголь-индуцированной атрофии m. soleus крыс и согласуются с данными о развитии атрофических изменений в скелетных мышцах этих животных при моделировании алкогольной миопатии (Reilly et al., 2000; Otis, Guidot, 2009).
Таблица 2. Отношение массы сердечной мышцы, m. soleus и m. gastrocnemius к массе тела у контрольных и хронически алкоголизированных крыс. Хроническая алкоголизация животных проводилась в течение 3-х месяцев по методу Lieber, DeCarli, 1989 с использованием сбалансированного по питательным веществам жидкого корма
Группа Масса тела животного, г Масса миокарда, г Массаm. soleus,г Масса m. gastro-cnemius, г Отношение массы миокарда к массе тела животного, мг/г Отношениемассыm. soleus кмассе телаживотного,мг/г Отношение массы m. gastrocnemius к массе тела животного, мг/г “Контроль”, n = 4 428.4 ± 30.0 1.17 ± 0.12 0.16 ± 0.03 2.26 ± 0.25 2.73 ± 0.12 0.37 ± 0.03 5.30 ± 0.45 “Алкоголь”, n = 4 427.7 ± 36.3 1.18 ±0.16 0.14 ± 0.01 2.14 ± 0.17 2.76 ± 0.20 0.33 ± 0.03 5.00 ± 0.35 Таблица 3. Отношение массы сердечной мышцы и m. soleus к массе тела у контрольных и хронически алкоголизированных крыс. Хроническая алкоголизация животных проводилась в течение 3-х месяцев по методу Lang et al., 1999 с использованием агара, содержащего 30% аутолизированных спирта Группа Масса тела животного, г Масса миокарда, г Массаm. soleus, г Отношение массымиокарда к массе тела животного, мг/г Отношениемассыm. soleus к массетелаживотного, мг/г “Контроль”, n = 5 445.3 ± 21.5 1.23 ± 0.14 0.18 ±0.12 2.76 ± 0.10 0.40 ± 0.05 “Алкоголь”, n =5 401.4 ±9.5 1.05 ± 0.06 0.15 ± 0.07 2.62 ± 0.08 0.37 ± 0.03 P 0.05 Таблица 4. Отношение массы сердечной мышцы и m. soleus к массе тела у контрольных и хронически алкоголизированных крыс. Хроническая алкоголизация животных проводилась в течение 6-ти месяцев по методу Lang et al., 1999 с использованием агара, содержащего 30% спирта Группа Масса тела животного, г Массамиокарда,г Масса m.soleus, г Отношение массы миокарда к массе тела животного, мг/г Отношение массы m. soleus к массе тела животного, мг/г “Контроль”, n = 5 594.0 ± 31.0 1.42 ± 0.06 0.20 ± 0.02 2.39 ± 0.07 0.34 ± 0.03 “Алкоголь”, n = 5 476 ± 27.0 1.10 ± 0.07 0.14 ± 0.01 2.31 ± 0.16 0.29 ± 0.01 P 0.01; P 0.05 Таблица 5. Отношение массы сердечной мышцы и m. soleus к массе тела у контрольных и хронически алкоголизированных крыс. Хроническая алкоголизация животных проводилась в течение 6-ти месяцев по методу Lang et al., 1999 с применением 20%-го спирта в питьевой воде Группа Масса тела животного, г Массамиокарда,г Масса m.soleus, г Отношение массы миокарда к массе тела животного мг/г Отношение массы m. soleus к массе тела животного мг/г “Контроль” n = 5 556.0 ± 37.0 1.36 ± 0.07 0.21 ± 0.02 2.45 ± 0.10 0.38 ± 0.02 “Алкоголь” n = 5 433.0 ± 77.0 1.01 ±0.02 0.12 ± 0.02 2.32 ± 0.09 0.29 ± 0.04 P 0.01 Примечание: данные в таблицах представлены как M ± SD, где M - среднее значение, SD стандартное отклонение.
Достоверных изменений в параметре «отношение веса сердца к весу тела животного» не было обнаружено у алкоголизированных в течение 6-ти месяцев крыс (Табл. 4, 5). Тем не менее, у животных обеих групп наблюдалась тенденция к снижению относительного веса сердечной мышцы, что может указывать на развитие атрофических изменений и в миокарде. 5.2. Исследование содержания -кальпаина и его аутолизированных изоформ в поперечно-полосатых мышцах хронически алкоголизированных крыс С целью выяснения возможной роли -кальпаина (м.м. 80 кДа) в развитии атрофии в мышцах хронически алкоголизированных крыс, методом Вестерн блот анализа были проведены исследования содержания этого белка и его аутолизированных изоформ. Известно, что активация -кальпаина сопровождается его аутолизом, приводящим к увеличению содержания аутолизированных изоформ (м.м. 78 и 76 кДа), обладающих протеолитической активностью (Baki et al., 1996; Murphy et al., 2006a,b). Показано, что увеличение активности кальпаинов, в частности, -кальпаина в скелетных мышцах млекопитающих в условиях гравитационной разгрузки (Enns et al., 2007) приводит к развитию атрофии, сопровождающейся повышенным протеолизом тайтина и небулина (Шенкман и др., 2004; Udaka et al., 2008; Vikhlyantsev, Podlubnaya, 2012; Окунева и др., 2012; Ulanova et al., 2015). Эти изменения, в свою очередь, приводят к нарушению высокоупорядоченной саркомерной структуры и ухудшению сократительной способности атрофированных мышц (Шенкман и др., 2004; Udaka et al., 2008; Vikhlyantsev, Podlubnaya, 2012). Вполне вероятно, что атрофические изменения, обнаруженные нами в мышцах хронически алкоголизированных крыс (Табл. 2–5), также являются следствием повышенной активности кальпаинов, в частности -кальпаина.
На рисунке 8 представлены данные Вестерн-блот анализа содержания -кальпаина и его изоформ в исследуемых поперечнополосатых мышцах крыс. Результаты Вестерн-блот анализа показали наличие одной аутолизированной изоформы (м.м. 78 кДа) -кальпаина в поперечнополосатых мышцах крыс (Рис. 8а, б). Следует обратить внимание на один интересный факт: у более молодых крыс (алкоголизированных в течение 3-х месяцев) аутолизированная изоформа -кальпаина наблюдалась только в m. gastrocnemius (Рис. 8а), тогда как у более зрелых крыс (алкоголизированных в течение 6-ти месяцев) наличие этой изоформы наблюдалось во всех исследуемых скелетных мышцах (Рис. 8б). Аутолиз -кальпаина в сердечной мышце крыс нами не обнаружен (Рис. 8а, б).
Влияние хронической алкогольной интоксикации на активность mTOR сигнального пути синтеза белка
Неожиданные результаты были получены при исследовании изменений содержания тайтина и небулина в икроножной мышце крыс, алкоголизированных в течение 6-ти месяцев. Несмотря на повышенный аутолиз -кальпаина (Рис. 8б), а также достоверное снижение мРНК тайтина (на 34%, P 0.01) и небулина (на 45%, P 0.01) (Рис. 12в), в этой мышце не зарегистрировано ожидаемого значительного снижения содержания гигантских белков саркомерного цититоскелета (Рис. 11б, Табл. № 1 в Приложении). В частности, в m. gastrocnemius алкоголизированных крыс не зарегистрировано снижения содержания Т1, хотя наблюдалось достоверное увеличение (на 45%, P 0.01) содержания протеолитических Т2-фрагментов тайтина, что, вс же, указывает на повышенный протеолиз этого белка. Не зарегистрировано достоверных изменений и в содержании небулина в m. gastrocnemius крыс после 6-месячного моделирования алкогольной миопатии. Однако в большинстве случаев в этой мышце наблюдалось снижение (на 12%, n = 3, P 0.01) содержания небулина (Рис. 11б), что сопровождалось появлением на геле дублетной полосы этого белка. Таким образом, можно утверждать, что в m. gastrocnemius крыс, алкоголизированных в течение 6-ти месяцев, наблюдается повышенный протеолиз гигантских мышечных белков, однако в свете данных об увеличении в 3.5 раза (P 0.01) содержания аутолизированной изоформы -кальпаина (Рис. 8б), снижение содержания тайтина и небулина в этой мышце выглядит незначительным. По всей вероятности, снижение на 16% (P 0.01) общего содержания -кальпаина (Рис. 9) внесло вклад в уменьшение протеолитической деградации тайтина и небулина в m. gastrocnemius. Тем не менее, повышенный протеолиз небулина, играющего важную роль в регуляции длины тонких нитей, поддержании их структуры, а также участвующего в регуляции актин-миозинового взаимодействия (Root, Wang, 1994), несомненно, будет иметь негативные последствия для сократительной способности мышцы. С этим выводом согласуются результаты исследований, выявивших снижение сократительной способности m. gastrocnemius у крыс, алкоголизированных в течение 4-х недель (Melnychuk et al., 2015).
Достоверных изменений в содержании Т1 и небулина в m. longissimus dorsi крыс, алкоголизированных в течение 6-ти месяцев, не обнаружено (Рис. 11в, Табл. № 2 в Приложении), несмотря на повышенный аутолиз -кальпаина (Рис. 8б) и уменьшение экспрессии генов этих белков (32%, P 0.01 и 40%, P 0.01, соответственно) (Рис. 12в). В сердечной мышце этой группы алкоголизированных крыс также не наблюдалось снижения содержания тайтина (Рис. 11г, Табл. № 4 в Приложении) при недостоверном увеличении (на 44%) экспрессии гена этого белка (Рис. 12в). Однако в сердечной мышце крыс, алкоголизированных с использованием 20%-го раствора спирта, было обнаружено уменьшение в 69 раз (P 0.01) содержания мРНК N2BA-изоформы тайтина (данные не показаны). При этом в ряде случаев на электрофореграммах сердечной мышцы этих животных наблюдалось снижение (в 1.7 раза) содержания Т1 (Рис. 14). Вс это указывает на то, что длительная алкогольная интоксикация может приводить к повышенной протеолитической деградации тайтина, снижению генной экспрессии этого белка и, возможно, другим негативным изменениям и в сердечной мышце крыс. Однако для проверки этого предположения необходимы дополнительные исследования.
Подводя краткий итог результатам, представленным в этой главе, следует отметить, что повышенный протеолиз -кальпаина, обнаруженный в скелетных мышцах крыс, алкоголизированных в течение 6-ти месяцев, сопровождался снижением содержания интактного Т1 и небулина в мышцах задних конечностей, хотя эти изменения были менее значительными, чем ожидалось. Наиболее странным, на наш взгляд, выглядит несоответствие между нормальным содержанием этих белков и повышенным аутолизом -кальпаина в m. longissimus dorsi алкоголизированных крыс, а учитывая данные о сниженной экспрессии генов тайтина и небулина в m. longissimus dorsi алкоголизированных крыс, это несоответствие выглядит еще более странным. Одно из возможных объяснений этих результатов может быть связано с изменением содержания в мышцах ингибитора кальпаинов – кальпастатина. Вполне вероятно, что повышенное содержание этого белка в мышцах алкоголизированных крыс приводило к снижению активности кальпаинов, в частности, -кальпаина. Результаты по проверке этого предположения представлены в следующем разделе.
Фракционирование ДНК методом электрофореза в 2% агарозном геле
Известна способность тайтина и небулина к фосфорилированию in vivo (Somerville, Wang, 1988). К настоящему времени показано, что тайтин фосфорилируют следующие протеинкиназы: PKА (Krger, Linke, 2006; Ktter et al., 2013), PKG (Ktter et al., 2013), PKC (Hidalgo et al., 2009), ERK1/2-киназа (Gautel et al., 1996), а также Ca2+/кальмодулин-завиcимая киназа (Hidalgo et al., 2013). Киназы, фосфорилирующие небулин, неизвестны. Показано, что в зависимости от уровня фосфорилирования белкового субстрата изменяется его чувствительность к протеолизу кальпаинами. В частности, показано, что PKA опоcpедованное фоcфоpилиpование тpопонина-I cнижает его чувcтвительноcть к дегpадации -кальпаином, тогда как фоcфоpилиpование тpопонина-I пpотеинкиназой C, наобоpот, повышает его чувcтвительноcть к пpотеолизу вышеуказанным феpментом (Di Lisa et al., 1995). Прямых экспериментальных подтверждений, свидетельствующих об изменении чувствительности тайтина или небулина к протеолизу вследствие изменения их уровня фосфорилирования, в научной литературе мы не обнаружили. Однако имеются косвенные данные, указывающие на то, что увеличение степени фосфорилирования тайтина сопровождается повышенной протеолитической деградацией этого белка. В частности, показано, что атрофические изменения в m. gastrocnemius мышей в условиях реальной микрогравитации сопровождались не только снижением содержания тайтина, но и увеличением (в 1.3 и 3.3 pаза, P 0.01) степени фоcфоpилиpования Т1 и Т2, соответственно (Ulanova et al., 2015). В проведенных нами экспериментах совместно с коллегами из лаборатории миологии (рук. проф., д.б.н. Шенкман Б.С., ГНЦ РФ – ИМБП РАН, Москва) аналогичные изменения уровня фосфорилирования Т1 и Т2 были обнаружены в атрофированной в условиях моделируемой микрогравитации m. soleus крыс (Salmov et al., 2016). По-видимому, более выcокий уpовень фоcфоpилиpования Т2 по cpавнению c Т1 объяcняется увеличением количеcтва фоcфоpилиpованныx cайтов пpежде вcего в Т2-части интактной молекулы тайтина. Известны также pезультаты иccледований, выполненныx c иcпользованием моноклональныx антител к фоcфоcеpину pS26, котоpые показали, что тpеxкpатное увеличение cтепени фоcфоpилиpования PEVK-учаcтка тайтина в четыpеxглавой мышце бедpа пациентов c cиндpомом Элеpcа– Данлоcа cопpовождалоcь cнижением (на 20%) cодеpжания этого белка (Ottenheijm et al., 2012). Таким образом, учитывая литературные данные, можно предположить, что повышение степени фосфорилиpования тайтина, в оcновном Т2-части его молекулы, способствует увеличению чувcтвительноcти этого белка к пpотеолизу. Это, в свою очередь, будет приводить к уменьшению cодеpжания интактного Т1, что, несомненно, будет вноcить вклад в pазвитие мышечной атpофии, cопpовождающейcя, напpимеp, пpи функциональной pазгpузке такими негативными поcледcтвиями, как наpушение cаpкомеpной cтpуктуpы (Udaka et al., 2008) и сократительной способности мышц (Шенкман и др., 2004; Udaka et al., 2008). Принимая во внимание наши результаты о повышенном протеолизе тайтина и небулина в m. soleus и m. gastrocnemius, а также данные об отсутствии подобных изменений в m. longissimus dorsi крыс, алкоголизированных в течение 6-ти месяцев (Рис. 11в), мы предположили, что уровень фосфорилирования этих белков будет разный: более высокий в m. soleus и m. gastrocnemius и более низкий в m. longissimus dorsi. Эксперименты по проверке этого предположения были проведены с использованием флуоресцентного красителя на фосфатные группы белков в геле Pro-Q Diamond. Нативный уровень фосфорилирования небулина оказался низкий, что не позволило провести сравнительные исследования изменений степени фосфорилирования этого белка в мышцах крыс. Содержание фосфатных групп в тайтине было достаточным для проведения подобных сравнительных исследований, результаты которых подтвердили наше предположение. В частности, несмотря на некую тенденцию к увеличению, достоверных изменений уровня фосфорилирования тайтина в m. longissimus dorsi, а также сердечной мышце крыс, алкоголизированных в течение 6-ти месяцев обнаружено не было (Рис. 11в, г, Pro-Q Diamond, Рис. 16, Табл. №№ 6, 8 в Приложении), тогда как в m. soleus и m. gastrocnemius этих животных наблюдалось достоверное увеличение степени фосфорилирования Т1 (на 14% и 21%, соответственно, P 0.01) и Т2 (на 41% и 23%, соответственно, P 0.01) (Рис. 11а, б, Pro-Q Diamond, Рис. 16, Табл. №№ 5, 7 в Приложении). Полученные результаты можно отнести в поддержку предположения о том, что гиперфосфорилирование тайтина увеличивает чувствительность этого белка к протеолизу. Этому предположению не противоречат наши данные об отсутствии изменений в содержании и степени фосфорилирования тайтина во всех исследованных поперечно-полосатых мышцах крыс, алкоголизированных в течение 3-х месяцев (Табл. №№ 1–8 в Приложении). Следует только отметить, что в m. soleus крыс, алкоголизированных в течение 3-х месяцев по методу Lang et al., 1999, наблюдалось достоверное увеличение (на 23%, Р 0.01) уровня фосфорилирования Т2 (Табл. № 7 в Приложении). Однако эти результаты вполне ожидаемы, поскольку в этой мышце алкоголизированных крыс зарегистрирован повышенный протеолиз Т1, сопровождающийся увеличением содержания Т2-фрагмента тайтина (Табл. № 3 в Приложении).