Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы .12
1.1 Метаболизм холестерина в процессе злокачественной трансформации клетки...12
1.2 Биосинтез холестерина и роль его промежуточных метаболитов. Оксистеролы...14
1.3 Регуляция гомеостаза холестерина в клетке...17
1.3.1 Печеночный Х рецептор. Общее представление о работе рецептора и его лигандах ...18
1.3.2 Роль печёночного X рецептора в регуляции гомеостаза холестерина...21
1.3.3 Печеночный Х рецептор как мишень для воздействия на опухолевую клетку...23
1.4 KRas онкогенный белок...24
1.4.1 Структура KRas и его посттрансляционная липидная модификация как необходимый этап «созревания» белка...25
1.4.2 Место и роль KRas белка в системе внутриклеточных сигнальных путей. Последствия мутаций K-ras гена ...28
1.5 Современные методы лечения злокачественных опухолей, вызванных нарушениями работы KRas и EGFR. Перспективы воздействия на метаболизм холестерина в таких типах раковых заболеваний...30
1.6 Заключение .32
Экспериментальная часть .34
Глава 2. Материалы и методы исследования .34
2.1 Реактивы и оборудование 34
2.2 Объекты исследования .38
2.2.1 Объекты исследования in vitro .38
2.2.2 Объекты исследования in vivo 40
2.3 Исследование кожных папиллом in vivo .41
2.4 Анализ уровня экспрессии генов методом количественной ПЦРс обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)...43
2.5 Препарация и анализ образцов кожи мышей...43
2.6 Трансфекция клеток малой интерферирующей РНК...44
2.7 Анализ жизнеспособности клеток in vitro .45
2.8 Анализ уровня экспрессии белков методом Вестерн Блот...46
2.9 Анализ активации LXR с использованием люциферазного репортёра...47
2.10 Получение стабильных клонов SCC61 с повышенной экспрессией белка LXR...48
2.11 Окрашивание клеток на -галактозидазу, связанную со старением...49
2.12 Статистическая обработка данных...50
ГЛАВА 3. Результаты исследования 50
3.1 Влияние конститутивного и тамоксифен-обусловленного удаления NSDHL на пролиферацию кератиноцитов мышей in vivo .50
3.2 Влияние удаление NSDHL на появление и развитие KRasG12D-опосредованных кожных папиллом in vivo...56
3.3 Влияние удаления NSDHL на скорость роста и процесс иммортализации KRasG12D -мутантных первичных мышиных эмбриональных фибробластов...61
3.4 Активация экспрессии мишеней LXR в кератиноцитах мышей при удалении NSDHL в экспериментах in vivo .63
3.5 Активация экспрессии мишеней LXR в NSDHL-дефицитных мышиных эмбриональных фибробластах in vitro .67
3.6 Активация LXR при удалении NSDHL в экспериментах с люциферазным репортёром in vitro...69
3.7 Влияние удаления NSDHL и SC4MOL на активацию мишеней LXR в опухолевых клетках SCC61 и A431...70
3.8 Обратимость эффекта активации экспрессии мишеней LXR в результате выключения вышележащего по пути биосинтеза холестерина фермента СYP51A1 .72
3.9 Влияние LXR и LXR на возникновение эффектов, обусловленных удалением NSDHL в опухолевых клетках...73
3.10 Повышение чувствительности опухолевых клеток SCC61 к агонистам LXR при повышении экспресии LXR в этих клетках...74
3.11 Влияние нарушения гомеостаза холестерина на чувствительность опухолевых клеток к ингибиторам рецептора EGFR...76
Глава 4. Обсуждение результатов 82
Выводы 88
Список литературы .
- Печеночный Х рецептор. Общее представление о работе рецептора и его лигандах
- Место и роль KRas белка в системе внутриклеточных сигнальных путей. Последствия мутаций K-ras гена
- Объекты исследования in vivo
- Активация экспрессии мишеней LXR в кератиноцитах мышей при удалении NSDHL в экспериментах in vivo
Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Международного агенства по изучению рака число случаев онкологических заболеваний неуклонно растёт с каждым годом по всему миру, достигнув в 2012 году 14.1 миллионов новых случаев (для сравнения 12.7 млн в 2008 году) и 8.2 млн смертей (7.6 млн в 2008 году) (Ferlay et al., 2013). Онкологические заболевания являются результатом нарушения контроля роста и деления клетки вследствие генетических изменений, таких как активация онкогенов и подавление генов онкосупрессоров (Vogelstein and Kinzler, 2004; Croce, 2008).
Существующие на сегодняшний день методы борьбы с онкологическими заболеваниями, направленные на подавление пролиферации и жизнеспособности опухолевых клеток, зачастую приводят к тяжёлым побочным эффектам, т.к. затрагивают не только опухолевые, но и нормальные клетки. В настоящее время активно развивается таргетная терапия (от англ. «target» - мишень) - подход, при котором лекарственное вещество воздействует на конкретную мишень, затрагивая преимущественно опухолевую клетку или влияя на непосредственное её микроокружение (Widakowich et al., 2007). Несмотря на значительные успехи в развитии таргетной терапии, проблема лечения онкологических заболеваний остаётся нерешённой и требует выявления и изучения новых эффективных мишеней и направленных на них лекарственных препаратов.
Одним из распространённых подходов таргетной терапии к подавлению пролиферации опухолевых клеток является воздействие на сигнальные пути, регулирующие митотические процессы клетки и часто гиперактивированные именно в раковых клетках (Schmit and Ahmad, 2007). Однако при таком подходе обычно возникает проблема резистентности к лекарственному препарату за счёт активации обходных сигнальных путей (Cortot and Janne, 2014). Другой подход представляет собой воздействие на метаболические пути в клетке, которые обычно также изменены и гиперактивированы именно в опухолевых клетках (Boroughs and DeBerardinis, 2015). Всё большее внимание
учёных привлекает метаболизм холестерина и регуляция гомеостаза холестерина в клетке. Холестерин, его метаболиты и производные играют незаменимую роль в клетке и в организме в целом, затрагивая сигнальные, структурообразущие, пролиферативные процессы в клетке (Murai, 2015). При этом известно, что активно пролиферирующие опухолевые клетки нуждаются в повышенном уровне холестерина, что приводит к активации как метаболических процессов его биосинтеза de novo (Pitroda et al., 2009; Silvente-Poirot and Poirot, 2014), так и процессов поглощения клеткой холестерина извне (Guo et al, 2011). Один из примеров воздействия на метаболизм холестерина был описан в работе Сухановой и др., где было показано, что удаление ферментов биосинтеза холестерина NSDHL (НАД(Ф)-зависимой стерол дегидрогеназы) и SC4MOL (стерол-С4-метил оксидазы) приводит к накоплению их субстратов (мейоз активирующих стеролов - МАС) и, как результат этого, к повышению чувствительности (сенситизации) опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), а также подавлению роста и пролиферации опухолевых клеток (Sukhanova et al, 2013). Описанное явление, однако, требует дальнейшего изучения с целью выявления мишени, на которую воздействуют MAC, и механизма, посредством которого данная мишень вызвает наблюдаемые эффекты.
Цель настоящей работы заключалась в выявлении механизма, посредством которого нарушение метаболизма холестерина в клетке на уровне ферментов НАД(Ф)-зависимой стероидной дегидрогеназы и стерол-С4-метилоксидазы воздействует на регуляцию онкогенных сигнальных путей в клетке.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Выяснить функции ферментов биосинтеза холестерина НАД(Ф)-зависимой стероидной дегидрогеназы и стерол-С4-метилоксидазы как регуляторов пролиферации клеток;
-
Определить внутриклеточную мишень, на которую воздействуют мейоз активирующие стеролы, накапливающиеся в клетке при выключении
ферментов НАД(Ф)-зависимой стероидной дегидрогеназы и стерол-С4-метилоксидазы;
-
Исследовать роль НАД(Ф)-зависимой стероидной дегидрогеназы и стерол-С4-метилоксидазы в регуляции гомеостаза холестерина в клетке;
-
Выяснить эффект выключения фермента НАД(Ф)-зависимой стероидной дегидрогеназы на развитие KRas-зависимого канцерогенеза в эпителиальных клетках;
-
Провести анализ одновременного воздействия на биосинтез холестерина и на сигнальный путь EGFR в опухолевых клетках.
Научная новизна. В данной работе был впервые описан механизм воздействия накопления МАС на онкогенные сигнальные пути клетки. Было показано, что накопление МАС в результате удаления ферментов биосинтеза холестерина NSDHL и SC4MOL приводит к активации печеночного рецептора X (LXR) и его транскрипционных мишеней, что способствует в результате уменьшению общего уровня холестерина в клетке и препятствует потреблению клеткой холестерина извне. Такое холестериновое истощение, вызванное накоплением в клетке MAC, приводит к нарушению онкогенных сигнальных путей. При этом нами впервые было продемонстрировано, как выключение ферментов NSDHL и SC4MOL препятствует развитию KRasG12D-опосредованного онкогенеза на моделях in vivo и in vitro. Кроме того, основываясь на полученных данных, мы также впервые показали, что одновременное воздействие на компоненты онкогенных сигнальных путей и путей регуляции гомеостаза холестерина, оказывает синергический эффект на опухолевые клетки, способствуя подавлению их роста и пролиферации.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты способствуют разработке новых эффективных стратегий таргетной терапии, основанных на одновременном воздействии на пути регуляции гомеостаза холестерина в клетке и онкогенные сигнальные пути, и обладающих синергическим воздействием. При этом открываются возможности как для создания новых препаратов, направленных на ингибирование ферментов
NSDHL и SC4MOL, так и для более эффективного совместного использования уже существующих лекарственных средств, регулирующих внутриклеточный гомеостаз холестерина и ингибирующих онкогенные сигнальные пути в клетке.
Кроме того, описанный механизм является интересным для понимания взаимодействий и связей между метаболическими и сигнальными путями в клетке. Таким образом, полученные данные представляют интерес как с практической точки зрения в качестве новых стратегий для создания терапевтических препаратов, так и с точки зрения теоретических дисциплин: молекулярной биологии и биохимии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Накопление субстратов ферментов НАД(Ф)-зависимой стероидной дегидрогеназы и стерол-С4-метилоксидазы активирует транскрипционный фактор печёночный X рецептор и его мишени в экспериментах in vitro и in vivo.
-
Выключение гена Nsdhl, продуктом которого является фермент НАД(Ф)-зависимая стероидная дегидрогеназа, подавляет пролиферацию кератиноцитов и фибробластов мышей in vitro.
-
Выключение гена Nsdhl, продуктом которого является фермент НАД(Ф)-зависимая стероидная дегидрогеназа, препятствует прогрессии KRas-зависимого канцерогенеза в эпителиальных клетках мышей in vivo.
-
Воздействие на ключевые факторы гомеостаза холестерина в клетке и подавление EGFR-завивсимого сигнального пути оказывает синергический антипролиферативный эффект на клетки карциномы головы и шеи человека.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на 3-ей и 4-ой международных научно-практических конференциях «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2013 и 2014), на 2-ом и 3-ем ежегодных симпозиумах университета Тэмпл, посвященных проблемам трансляционной науки (Филадельфия, США, 2013 и 2014), на ежегодной конференции Американской ассоциации исследования опухоли (Сан-Диего, США, 2014), на 18-ой и 19-ой ежедгодных конференциях онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2013 и 2014).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в список ВАК и 3 публикации в журналах базы SCOPUS.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, включает 33 рисунка. Библиография включает 132 наименования.
Печеночный Х рецептор. Общее представление о работе рецептора и его лигандах
Биосинтез холестерола является одним из основных метаболических путей в клетке и является высоко-консервативным в эукариотических организмах с небольшой лишь разницей в конечных продуктах, как, например, человеческий холестерин и эргостерол в грибах (Kanehisa et al., 2012).
Синтез холестерина в клетке осуществляется посредством мевалонатного пути. Первым этапом пути является превращение двух-углеродного блока, ацетил-СоА в ацетоацетил-СоА с помощью фермента ацетоацетил-CoA тиолазы. Затем полученные продукты превращаются в мевалонат при помощи ферментов HMG-CoA (3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А) синтазы и редуктазы (HMGCS и HMGCR, соответственно). При этом HMG-CoA редуктаза катализирует лимитирующую стадию холестеринового биосинтеза и потому представляет собой привлекательную мишень для воздействия на синтез стеролов. Высокий интерес к этому ферменту, как к потенциальной мишени привёл к интенсивному его изучению. Так, для лечения гиперхолестеролемии, заболевания проявляющегося вследствие избытка холестерина в клетке, были разработаны ингибиторы фермента HMG-CoA редуктаза – статины. Статины состоят из остатка, похожего на HMG, а также нескольких гидрофобных групп (Gotto, 1999). Это позволяет ингибиторам конкурировать с HMG-CoA за связывание с активным центром фермента, кроме того дополнительные гидрофобные группы статинов разупорядочивают каталитические остатки фермента. (Istvan and Deisenhofer, 2001). Кроме традиционного использования статинов в лечении заболеваний, связанных с повышенным уровнем содержания холестерина в клетке, было также обнаружено, что статины оказывают негативный эффект на рост и пролиферацию опухолевых клеток. Так, было показано, что ингибирование HMG-CoA редуктазы статинами вследствие предотвращения синтеза мевалоновой кислоты, препятствует образованию и последующих соединений пути – нестероидных изопреноидов. Они, в свою очередь, в норме участвуют в посттрансляционной модификации и заякоривании в мембране таких важных сигнальных белков, как Ras, Rho, Rac. Таким образом, статины подавляют активацию этих сигнальных путей в результате подавления синтеза изопреноидов. В дополнение к этому было показано, что статины оказывают про-апоптотический, анти-ангиогенный и иммуномодуляторный эффекты, которые также могут препятстовать развитию опхуоли. Известно, что статитны ингибируют пролиферацию клеток опухолей различных типов, включая рак груди, желудка, поджелудочной и предстательной желёз, нейробластому, меланому, мезотелиому и острую миелоедную лейкемию (Vallianou et al., 2014).
Последующее превращение мевалоната в холестерин включает в себя координированные действия множества ферментов данного пути. Так, сначала мевалонат метаболизируется в фарнезил-дифосфат путём серии превращений, катализируемых ферментами в пероксисомах. На следующем этапе 47кДа фермент эндоплазматического ретикулума – сквален синтаза – катализирует превращение двух молекул фарнезил-дифосфата в сквален. Сквален синтаза строго регулируется уровнем содержания холестерина в клетке. Кроме того, именно на этом этапе содержание холестрина в клетке определяет по какому пути будет использоваться фарнезил-дифосфат: по стерольной или нестерольной ветвям. Сквален затем превращается в первое соединиение с цикличной структурой стерола – ланостерол – при помощи ферментов сквален эпоксидазы и оксидосквален циклазы. Ланостерол конвертируется в холестрин посредством серии окислительных, восстановительных и деметилирующих реакций (Liscum, 2002). В результате этих реакций кроме конечного продукта холестерина продуцируются также различные промежуточные метаболиты – оксистеролы – непосредственно обладающие биологической аткивностью. Так, примером могут служить С-4-метилированные стеролы, известные также, как мейоз активирующие стеролы за их уникальную роль в регуляции второй стадии мейоза в половых железах (Byskov et al., 1995).
Оксистеролы обладают очень широким спектром биологической активности, включая воздействие на метаболизм сфинголипидов, агрегацию тромбоцитов, апоптоз и пренилирование белков. Наиболее значимые функции оксистеролов в нормальных клетках заключаются в регуляции холестеринового гомеостаза в клетке за счёт их взаимодействия с различными рецепторами, такими как оксистерол-связывающий белок, белок, связывающий стерольный регуляторный элемент (SREBP), печеночный рецептор Х (LXR), рецептор липопротеинов низкой плотности (LDLR) и др. (Schroepfer, 2000). Кроме того, было показано, что оксистеролы препятствуют пролиферации клеток многих типов опухолей, таких как лейкемия, глиобластома, рак кишечника, молочной и предстательной железы. При этом такое влияние осуществляется посредством различных механизмов, многие из которых ещё до сих пор не изучены (Weille et al., 2013).
Таким образом, холестериновый биосинтез представляет собой сложный путь, в котором участвует множество различных ферментов. При этом помимо конечного продукта – холестерина, на этом пути происходит образование различных других соединений, обладающих разнообразной биологической активностью. Большое интерес при этом вызывают оксистеролы, обладающие противоопухолевой активностью.
Место и роль KRas белка в системе внутриклеточных сигнальных путей. Последствия мутаций K-ras гена
В работе были использованы следующие клеточные линии: А431 (эпидермоидная карцинома) и FaDu (сквамозная карцинома), полученные из коллекции клеточных культур «American Tissue Culture Collection» (ATCC, США). Происхождение клеток было подтверждено при помощи анализа единичных тандемных повторов ДНК (Biosynthesis, США). Кроме того, клеточные линии SCC61 и SCC25 (сквамозная карцинома) были любезно предоставлены доктором Сейертом (Dr. T.Y. Seiwert) (Университет Чикаго, США). Для продукции вируса (глава 2.10) использовали клетки HEK293T (эмбриональные клетки почки человека), также полученные из коллекции «American Tissue Culture Collection» (ATCC, США). Все клеточные линии были тестированы на наличие микоплазмы и показали отсутствие контаминации микоплазмой. Тестирование проводилось в отделении Клеточных культур онкологического центра «Fox Chase Cancer Center» (Филадельфия, США). Клеточные линии культивировались в ростовой среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), L-глютамин и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-ного СО2 при 37С.
Мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ) были получены из мышиных эмбрионов на 13.5 день развития, стандартным методом (Xu, 2005). Вкратце, эмбрионы на 13.5 день развития были извлечены из утробы матери в стерильных условиях в ламинарном шкафу. Голова и зачатки внутренних органов эмбрионов были удалены и использованы для последующего генотипирования (описано в главе 2.2.2). Оставшаяся часть эмбриона была гомогенизирована при помощи хирургического скальпеля до состояния мелких тканевых остатков и обработана 0.25%-ным раствором трипсина с ЭДТА в течение 30 минут в атмосфере 5%-ного СО2 при 37С. Полученный гомогенат далее был ресуспендирован в ростовой среде DMEM, содержащей 10% ЭБС, L-глютамин и 1% пенициллина-стрептомицина. Суспензии дали отстояться в течение 3-5 минут для осаждения крупных кластеров неразрушенной ткани. Супернатант с суспензией клеток был собран в отдельные чистые пробирки и отцентрифугирован при центробежном ускорении 900g в течение 5 мин. Полученный осадок, содержащий клетки, был посажен на матрас для культивирования клеток в ростовой среде DMEM, содержащей 10% ЭБС, L-глютамин и 1% пенициллина-стрептомицина. В результате получали культуру прикреплённых первичных клеток МЭФ.
При работе с прикреплёнными клетками, для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизировался 0.25%-ным раствором трипсина с последующей его инактивацией добавлением среды DMEM с 10%-ной сывороткой. Клетки затем осаждались центрифугированием при центробежном ускорении 900 g в течение 5 мин. Жизнеспособность и подсчет плотности клеток производились после окраски клеток 0.4%-ным раствором трипанового синего при помощи камеры Горяева под оптическим микроскопом. Расчет количества клеток проводился по формуле (1) : где N – количество клеток на 1 мл объёма клеточной суспензии, a – общее количество клеток в четырёх квадратах камеры, b – количество синих клеток.
В экспериментах in vivo были использованы мыши следующих линий: мыши, несущие Nsdhlflx5 аллель, были любезно предоставлены доктором Херман (Dr. G. Herman) (Исследовательский институт при Общенациональном Детском Госпитале, Колумбус, США); 129S/Sv-Krastm4Tyj/J мыши (из первоначального стока JAX 008180) и Tg(Krt5-Cre/ERT2)Ajdg мыши были любезно предоставлены доктором Жанг (Dr. R. Zhang) (Институт Вистар, Филадельфия, США) и доктором Клейн-Сзанто (Dr. A.J.P. Klein-Szanto) (Онкологический центр «Фокс Чейз», Филадельфия, США) соответственно. Мыши линии Tg(KRT14-cre)1Amc/J были получены из Лаборатории «Jackson Laboratory» (из первоначального стока JAX 004782). Генотипирование мышей проводилось методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) при помощи смеси для ПЦР «GoTaq Green Master Mix» (Промега, США) в соотвествии с инструкцией производителя с использованием следующих праймеров:
Прямой праймер: 5 gtg cta ctg tag act gaa cc 3 Обратный праймер: 5 gtg tcc ttg caa tct cag tg 3 Результат: дикий тип – 977 п.н.; экзон 5, фланкированный loxP-сайтами – 1106 п.н. и продукт вырезания экзона 5 – 271 п.н. Cre-рекомбиназа:
Праймер oIMR1084: 5 gcg gtc tgg cag taa aaa cta tc 3 Праймер oIMR1085: 5 gtg aaa cag cat tgc tgt cac tt 3 Праймер oIMR7338: 5 cta ggc cac aga att gaa aga tct 3 Праймер oIMR7339: 5 gta ggt gga aat tct agc atc atc c 3 Результат: праймеры oIMR1084 + oIMR1085 образуют продукт, идентифицирующий Cre трансген – 100 п.н., и праймеры oIMR7338 + oIMR7339 – продукт внутреннего контроля – 325 п.н. Прямой праймер 1: 5 gtc ttt ccc cag cac agt gc 3 Прямой праймер 2: 5 agc tag cca cca tgg ctt gag taa gtc tgc a 3 Обратный праймер: 5 ctc ttg cct acg cca cca gct c 3 Результат: дикий тип – 622 п.н., LSL-кассета – 500 п.н. и рекомбинированный аллель – 650 п.н.
Мыши содержались в стерильных условиях, свободных от патогенов в Питомнике Онкологического центра «Фокс Чейз» (Филадельфия, США), одобренном комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC).
Для индукции образования кожных папиллом использовали мышей, полученных в результате скрещивания LSL-KRasG12D (129S/Sv-Krastm4Tyj/J), K5CreERT (Tg(Krt5-Cre/ERT2)AJdg) и NSDHLflx5 мышей, как показано на рис. 2.
Рис. 2. Схема скрещивания мышей для получения «трёхгенной» модели Nsdhlflx5; K5CreERT; LSL-KRasG12D/+. Самок Nsdhlflx5/flx5 (показаны как flx5/flx5) скрестили с самцами линии Tg(Krt5-Cre/ERT2)AJdg (показаны как K5CreERT). Полученное в результате потомство использовали для следующего скрещивания, чтобы получить самок Nsdhlflx5/flx5 несущих K5CreERT аллель. Самки Nsdhlflx5/flx5; K5CreERT были далее скрещены с гетерозиготными LSL-KRasG12D/+ самцами для того, чтобы получить потомство, состоящее из Nsdhlflx5/+; K5CreERT; LSL-KRasG12D/+ самок и Nsdhlflx5/Y; K5CreERT; LSL-KRasG12D/+ самцов, которое можно использовать для индукции папиллом.
Мышам в возрасте 4 недель давали тамоксифен, per os, растворённый в кукурузном масле в дозе 40 мг/кг в объёме 100 мкл раз в день в течение 5 последовательных дней. Мышей обследовали раз в неделю визуально на наличие изменений кожных покровов. Измерения появляющихся папиллом проводили два раза в неделю по формуле (2): где N – объём папилломы, a – длина и b – ширина папилломы. Мышей наблюдали в течение 5 месяцев или до появления признаков значительного ухудшения состояния здоровья: увеличение объёма опухоли более 2000 мм3, изъязвление папиллом, потеря веса более, чем 10% массы тела, в соответствии с рекомендациями комитета по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC). По окончании измерения папиллом, мышей усыпляли с помощью CO2 и собирали паппиломы и образцы кожи. Каждую папиллому (если позволяли размеры опухоли) разделяли на две части. Первая часть немедленно была гомогенизирована в буфере для экстракции белков из тканей «T-PER», содержащем фосфотазные и протеазные ингибиторы, при 4С. Неразрушенные клетки и кусочки ткани осаждали центрифугированием со скоростью 13000g при 4С в течение 30 мин. Супернатант собирали и анализировали методом Вестерн Блот (глава 2.8). Вторую часть папилломы использовали для выделения ДНК стандартным методом с использованием смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (Sambrook and Russell, 2006). Образцы кожи фиксировали в формалине или фиксирующем растворе Боуина для дальнейшего анализа методом иммуногистохимии (глава 2.5).
Объекты исследования in vivo
Для того, чтобы подтвердить, что полученные данные о влиянии потери NSDHL на пролиферацию кератиноцитов кожи мышей также верны и для других типов клеток, мы исследовали пролиферацию первичной культуры мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). Первичная культура МЭФ была получена из трансгенных мышей, несущих Nsdhlflx5 и LSL-KrasG12D генетические конструкты (описаны в разделе 3.2). Известно, что экспрессия мутантного эндогенного KRasG12D в первичной культуре МЭФ приводит к иммортализации клеток (Jackson et al., 2001). Мы предположили, что удаление NSDHL в этих клетках может препятствовать их пролиферации и иммортализации. Для этого полученные из мышиних эмбрионов (как описано в разделе 2.2.1) МЭФ на 1-ом пассаже были инфицированы аденовирусом, кодирующим Cre-рекомбиназу, для активации экспрессии KRasG12D и удаления NSDHL или контрольным, GFP-кодирующим вирусом. Клетки росли в полной среде DMEM c 10% ЭБС и количество сажаемых и собираемых клеток считалось при каждом следующем пассаже. Было показано, что LSL-KrasG12D клетки после инфекции Cre-кодирующим вирусом, несущие в результате реарранжировки Lox-KRasG12D конструкт, претерпевали ускорение пролиферации по сравнению с GFP-инфицированными контрольными клетками МЭФ (рис. 15).
При этом в Nsdhl5;Lox-KRasG12D клетках в трёх независимых линиях первичных МЭФ потеря NSDHL приводила к подавлению пролиферации несмотря на активированный мутантный KRasG12D (рис. 15). Клетки с потерей NSDHL (как с мутантным KRasG12D, так и с KRas дикого типа) невозможно было растить после 10-ого пассажа, так как клетки претерпевали ускоренное клеточное старение по сравнению с клетками МЭФ, экспрессирующими NSDHL на уровне дикого типа. Клеточное старение оценивалось по уровню экспрессии его маркёра -галактозидазы, связанной со старением. Полученные результаты представлены на рис. 16А, 16Б.
Рис. 16. Подавление пролиферации первичной культуры МЭФ было связано с повышенной скоростью старения этих клеток, что было оценено методом окрашивания на -галактозидазу, ассоциированную со старением (-ГАСС). Количественная оценка скорости старения клеток (А). Окрашивание клеток МЭФ на -ГАСС: в светлом поле клетки, окрашенные голубым цветом, являются -ГАСС позитивными. Для определения общего количества клеток использовался краситель для окрашивания ядер DAPI (Б).
Известно, что при удалении фермента NSDHL происходит накопление его метаболитов – мейоз актвирующих стеролов (МАС) (Sukhanova et al., 2013). В то же время было показано, что МАС являются лигандами транскрипционного фактора из семейства ядерных рецепторов LXR (Janowski et al., 1996). Основываясь на данных литературы, мы предположили, что эффекты, вызванные потерей NSDHL могут быть опосредованны активацией LXR с помощью накопленных МАС. Для того, чтобы проверить нашу гипотезу, мы исследовали уровень экспрессии мишеней LXR в образцах кожи мышей с удалённым ферментом NSDHL. Мышиные модели, использованные для этого эксперимента, аналогичны описанным ранее в разделе 3.1. Мы исследовали экспрессию двух важных мишеней LXR, регулирующих гомеостаз холестерина в клетке – ABCA1 и LDLR (Guo et al., 2011; Bensinger et al., 2008; Zelcer et al., 2009). Иммуногистохимический анализ биопсии кожи мышей (рис. 17А, 17Б), анализ полученных из кожи белковых лизатов (рис. 17В) и анализ уровня мРНК методом ОТ-ПЦР (рис. 17Г) показали, что в коже новорождённых мышей K14Cre; Nsdhl5/Y происходит значительное повышение экспрессии ABCA1 по сравнению с мышами контрольной группы с уровнем экспрессии NSDHL дикого типа (Nsdhlflx5).
Рис. 17. Удаление NSDHL в кератиноцитах кожи новорождённых мышей K14Cre; Nsdhl5/Y активирует LXR. Иммуногистохимическое окрашивание образцов кожи новорождённых мышей показало повышение экспрессии ABCA1 и понижение уровня LDLR при дефиците NSDHL (А). Количественная оценка иммуногистохимичекого окрашивания (Б). Анализ уровня экспрессии белков в лизатах кожи мышей методом Вестерн Блот (В). Результаты количественной оценки уровня экспрессии мРНК белка ABCA1 методом ОТ-ПЦР (Г). (1) p=0.01; , p 0.01; , p 10-9.
Также было показано, что уровень экспрессии LDLR, подвергающийся деградации при активации LXR (Zelcer et al., 2009), был значительно ниже в образцах кожи, полученных от мышей с потерей NSDHL, по сравнению с кожей мышей, экспрессирующей NSDHL дикого типа (рис. 17А, 17Б, 17В). Активация экспрессии ABCA1, мембранного транспортера, откачивающего холестерин из клетки (Wang et al., 2001), и деградация рецептора LDLR, способствующего поступлению холестерина в клетку (Zelcer et al., 2009), а также остановка внутриклеточного синтеза холестерина вследствие удаления NSDHL совместно приводят к понижению уровня холестерина в клетке (Radhakrishnan et al., 2008). Это вызывает, в свою очередь, компенсаторную активацию транскрипционного фактора SREBP-2, регулирующего экспрессию генов биосинтеза холестерина (Hua et al., 1993). Актвивация SREBP-2 выражается в отщеплении от его предшественника активной ядерной формы, транслоцируемой затем в ядро (яSREBP-2). Такая вызванная понижением уровня холестерина в клетках индукция яSREBP-2 наблюдалась в коже новорождённых мышат K14Cre; Nsdhl5/Y с потерей NSDHL в кератиноцитах по сравнению с кожей мышат дикого типа (рис. 17В).
Иммуногистохимический анализ кожи 4-х недельной самки с мозаичной экспрессией NSDHL (K14Cre; Nsdhl5/+ мыши, описанные в разделе 3.1) также показал, что участки кожи с потерей NSDHL, кроме утоньшения эпидермиса и уменьшения экспессии Ki-67 маркера пролиферации (явления, описанные в разделе 3.1) также обладали повышенным уровнем экспрессии ABCA1 и пониженным уровнем экспрессии LDLR (рис. 18А, 18Б).
Активация экспрессии мишеней LXR в кератиноцитах мышей при удалении NSDHL в экспериментах in vivo
Нужно отметить, что ранее опубликованные работы по изучению NSDHL и SCMOL описывали появление серьёзных дефектов развития при наличии гипоморфных вариантов исследуемых генов (He et al., 2011; McLarren et al., 2010) и высокую токсичность, приводящую к остановке развития уже на ранних эмбриональных этапах, при тотальном выключении этих ферментов во всём организме (Caldas et al., 2005). В нашей работе в частности было показано, что удаление NSDHL в кератиноцитах кожи мышей на постнатальном этапе развтития in vivo приводит к подавлению пролиферации кератиноцитов и препятствует нормальному развитию кожного и волосяного покровов (рис. 5, 6), что в гомозиготном состоянии при тотальном удалении NSDHL (у самцов) приводит к летальному исходу (рис. 4). Однако в нашей работе также впервые было выяснено, что частичное удаление NSDHL лишь в определённых клетках взрослого организма (частичное удаление в кератиноцитах, в нашем случае) обладает минимальной токсичностью (рис. 8, 9). Это имеет большое значение для дальнейшего развития данной стратегии как потенциально применимой в терапии опухолевых заболеваний.
Ранние исследования удаления NSDHL и SC4MOL оставили неразрешённым вопрос о том, является ли накопление МАС само по себе ответственным за наблюдаемые биологические эффекты или они проявляются как следствие изменения общего содержания холестерина в клетке. Вследствие сложной организации биологических систем, скорее всего верны оба этих аспекта, будучи при этом тесно связанными и неотделимыми друг от друга. Данное исследование, определяющее ядерный стерол-связывающий рецептор LXR как критическую мишень для МАС, таким образом, открывает дополнительные связи между уровнями МАС и холестерина, помимо известной роли МАС как метаболитов холестеринового биосинтеза. Активированный LXR дерегулирует поглощение холестерина посредством усиления деградации рецептора липопротеинов низкой плотности LDLR (Guo et al., 2011; Chawla et al., 2001) и транскрипционной индукции транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC-транспортеры), известных как негативные регуляторы пролиферации гематопоэтических (Bensinger et al., 2008; Yvan-Charvet et al., 2010) и опухолевых клеток (Guo et al., 2011). Мы показали в данной работе на моделях in vivo, что при удалении NSDHL происходит активация мишеней LXR – ABCA1, ABCG1, деградация LDLR – регулирующих поглощение и выброс холестерина клеткой (рис. 17, 18). Более детально мы подтвердили эти результаты, изучив эффекты дефицита SC4MOL и NSDHL in vitro в клеточных линиях карцином человека (рис. 22, 23, 24) и в линиях клеток МЭФ (рис. 19, 20, 21), также подтвердив активацию мишеней LXR.
В ранних исследованиях было показано, что потеря NSDHL и SCMOL оказывает влияние на сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста EGFR в опухолевых клетках (Sukhanova et al., 2013). В данной работе мы обнаружили, что действие активированного LXR синергично по отношению к антагонистам EGFR. Так, синергический эффект оказывало лечение клеток карцином человека SCC61, SCC25 и A431 активаторами LXR (FF-MAS, 22-(ОН)-холестеролом) совместно с ингибитором EGFR эрлотинибом (рис. 31, 33). Это указывает на то, что путь биосинтеза холестерина является критической мишенью, регулирующей пролиферацию клеток человеческой карциномы. Полученные результаты также интересны в контексте недавнего исследования, где было обнаружено, что активированный EGFR в клетках глиобластомы позитивно регулирует поглощение холестерина посредством LDLR и биосинтез холестерина de novo (Guo et al., 2011; Guo et al., 2009). В нашей работе мы обнаружили похожие сигнальные взаимодействия в KRas-индуцированных кожных папилломах, что позволяет применить механизм МАС-LXR взаимодействия к онкогенному KRas – одному из основных онкогенов, для которых в настоящее время не существует эффективной терапии. Так, на модели клеток МЭФ in vitro было показано, что дефицит NSDHL позволяет этим клеткам преодолевать KRas-опосредованную активацию пролиферации и способствует ускоренному старению клеток (рис. 15, 16). Ещё более значимые результаты мы получили на моделях in vivo, где выключение NSDHL в кератиноцитах, препятствовало их гиперпролиферации (рис. 11), и росту кожных папиллом, вызванных активацией экспрессии мутантного онкогенного KRas в этих клетках (рис. 12, 13, 14).
Предыдущие попытки нарушить гомеостаз холестерина в опухолевых клетках посредством ингибиторов HMGCR-редуктазы (статинов) не были столь эффективны. Вероятно, это было обусловлено компенсацией эффектов понижения активности HMGCR-редуктазы посредством повышения поглощения холестерина извне и его биосинтеза de novo (Clendening et al., 2010; Dong et al, 2010). Прерывание пути биосинтеза холестерина более дистально, на этапах С4-деметилирующих ферментов имеет потенциал к созданию необратимой метаболической ловушки, состоящей в комбинации блокады синтеза холестерина de novo, LXR-зависимой блокады поглощения холестерина в составе липопротеинов низкой плотности (вследствие деградации LDLR), а также LXR-зависимого выброса холестерина из клетки через транспортеры ABCA1 и ABCG1. Детальный анализ каждого из этих регуляторных элементов способен выявить новые метаболические мишени для создания эффективных противоопухолевых препаратов.
В целом, полученные в работе данные свидетельствуют о существовании важного механизма активации ядерного рецептора LXR посредством мейоз активирующих стеролов, накапливающихся в результате выключения ферментов дистального этапа пути биосинтеза холестерина – SCMOL и NSDHL. При этом было показано, что такая активация LXR совместно с блокадой пути биоситеза холестерина de novo (в результате выключения SCMOL и NSDHL) приводит к истощению содержания общего холестерина, так необходимого для активного роста и пролиферации опухолевой клетки. Описанные данные, во-первых, безусловно представляют интерес с теоретической точки зрения, т.к. открывают новые ветви метаболических взаимодействий: между промежуточными метаболитами пути биосинтеза холестерина и важным регулятором многих аспектов жизнедеятельности клетки ядерным рецептором LXR. Однако помимо теоретического интереса, описанные явления имеют большую практическую значимость, открывая новые направления таргетной терапии, направленной на совместное воздействие на пути регуляции гомеостаза холестерина и сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста EGFR, оказывающее синергический антипролиферативный эффект на жизнедеятельность и пролиферацию опухолевых клеток. При этом важно, что открывается новый потенциал как для более эффективного использования уже существующих лекарственных препаратов, так и для создания новых, направленных на не использованные ранее новые мишени – NSDHL и SC4MOL. Такие новые способы противоопухолевой терапии могут повысить эффективность лечения EGFR- и KRas-опосредованных типов опухолей.