Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Монооксигеназная система ЭПР печеночных клеток, включающая ЫАО(Р)Н-зависимые флавопротеины и цитохромы Р450 и Ь5, ответственна за метаболизм широкого спектра эндогенных и экзогенных субстратов. Принимая участие в активации кинетически инертной молекулы кислорода и внедрении одного из его атомов в молекулу субстрата, эта ферментная система окисляет гидрофобные соединения, превращая их в более полярные и, таким образом, способствует выведению их из организма (Archakov and Bachmanova, 1990).
Для понимания механизмов взаимодействия белков и изучения молекулярной организации микросомальной монооксигеназной системы (ММС), представляющей собой многоферментный мембрано-связанный комплекс, используется метод реконструкции этой системы из отдельных высокоочищенных компонентов, фосфолипидов или детергентов. С помощью этого метода решен ряд вопросов, связанных с выяснением субстратной специфичности различных цитохромов Р450, механизма реакций окисления, идентификации функциональных групп, ответственных за взаимодействие белков (Канаева и др., 1985; Скоцеляс и др., 1987; Miwa and Lu, 1981; Miller-Enoch et al., 1984; Kanaeva et al., 1992 a, b). Для большинства оксигеназных реакций оказалось достаточным присутствия в реконструированной системе NADPH-зависимого флавопротеина (NADPH-FP), цитохрома Р450 (Р450) и фосфолипидов или детергентов.
В зависимости от типа окисляемого субстрата, формы Р450, соотношений белок : белок или белок : фосфолипид, фосфолипидного состава в реконструированных системах наблюдается разнообразное действие Ь5 на Р450-катализируемые реакции. Многие авторы наблюдали стимулирующий эффект цитохрома Ь5 (Ь5) на монооксигеназные реакции [Вознесенский и др.,1990б; Canova-Davis et al.,1984; Tamburini and Schenkman, 1987), другие - ингибирующий (Morgan and Coon, 1984; 4!avica and Golly, 1986; Golly et al.,1988 ). В некоторых случаях Ь5 не жазывал эффекта или его присутствие было обязательным как, например, іля реакций окисления п-нитроанизола и метоксифлурана (Sugiyama et .1.,1982: Konopka and Waskell, 1988; Lipka and Waskell, 1989). использование мономерной реконструированной системы (МРС) делает "юлее простым исследование влияния Ь5 на монооксигеназные реакции.
ММС, состоящая из мономеров цитохрома Р4502В4 (Р4502В4) и NADPH-FP, была реконструирована в присутствии неионного детергента эмульгена 913 при сотношении белок : детергент = 1:100. При этом концентрация Р4502В4 в растворе составляла 0.5 - 5 мкМ. Эта система, содержащая мономеры флаво- и гемопротешюв при их мольном соотношении 1:1, с высокой скоростью катализировала реакции восстановления Р4502В4 и N-деметилирования бензфетамина (ВФ), диметиланилина (ДМА) и аминопирина (АП). Было показано, что компоненты монооксигеназнои системы взаимодействовали по принципу случайных соударений согласно закону действующих масс (Bachmanova et al.,1986, 1989; Kanaeva et al.,1987, 1992 a, b).
В отличие от реконструированных систем, в микросомах имеет место совсем другое соотношение Р450 и NADPH-FP: па 1 молекулу NADPH-FP приходится 10-20 молекул Р450 (Dean and Gray, 1982; Archakov and Bachmanova, 1990). Поэтому представляло также интерес реконструировать ММС при соотношении NADPH-FP и Р4502В4, близком к микросомалыюму, и исследовать кинетические особенности ее функционирования в растворе.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: реконструировать монооксигеназную систему микросом печени, содержащую цитохром Р4502В4, NADPH-FP и цитохром Ь5 в виде мономеров, и выяснить роль цитохрома Ь5 в реакции окисления бензфетамина.
ЗАДАЧИ:
-
Исследовать влияние цитохрома Ь5 на скорость гидроксилирования бензфетамина и других субстратов в реконструированной монооксигеназнои системе, когда все се компоненты присутствуют в виде мономеров.
-
Исследовать стехиометрию NADPH-зависимых реакций окисления в мономерной реконструированной системе (МРС) в отсутствие и присутствии Ь5.
-
Провести сравнительный анализ исследованных параметров в МРС при соотношении гемо- и флавопротеинов 1:0.05 и 1:1 и микросомах печени кроликов, получавших фенобарбитал.
4. Измерить параметры взаимодействия Ь5 с Р4502В4: константу
связывания Kj, константы скорости образования (k+i) и распада
комплекса Р4502В4-Ь5 (к.}). Определить время жизни (t) комплекса
Ь5-Р4502В4 и сравнить его со скоростью переноса второго электрона в МРС.
В результате проведенных исследований была реконструирована монооксигеназная система, все компоненты которой (Р4502В4, NADPH-FP и Ь5) присутствовали в виде мономеров. Выявлено, что для переноса электронов с NADPH-FP на Ь5 наличие гидрофобных мембранных фрагментов этих белков не является обязательным. В случае образования комплексов цитохромов Р4502В4 и Ъ5, регистрируемых электрофоретически и спектрофотометрически, наличие гидрофобного фрагмента Ь5 было абсолютно необходимым. Только детергентный рггохром Ь5 (д-Ь5) оказывал стимулирующий эффект на скорости жисления различных субстратов в МРС и на степень сопряжения MADPH-зависимых реакций окисления бензфетамина при различном :оотношении Р4502В4 : NADPH-FP. В механизме сопрягающего іействия Ь5 следует учитывать как увеличение константы скорости іереноса второго электрона, так и ингибирование непродуктивного распада іероксикомплекса Р4502В4. Определено время жизни комплекса Э4502В4 - Ь5, которое равно 10 с.
ШРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы были [редставлены на 8ой Международной конференции по биохимии, іиофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, \иссабон, 1993), на 10ом Международном симпозиуме по микросомам и кислению лекарств (Канада, Торонто, 1994), на Зеи Международной онференции по молекулярному узнаванию (Сингапур, 1995) и на 9ой Леждупародной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной пологий цитохрома Р450 (Швейцария, Цюрих, 1995). Апробация аботы состоялась на научной конференции лабораторий НИИ иомедицинской химии РАМН.
ІУБАИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
ОБ'ЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на Q% страницах машинописного текста, включает ^ таблиц и рисунков и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы".
Высокоочищенный препарат цитохрома Р4502В4 получали по методу Imai and Sato (Imai and Sato, 1974) с некоторыми модификациями аффинной хроматографии (Карузина и др., 1979).
NADPH-цитохром Р450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi and Masters (1976).
Выделение д-Ь5 проводили по модифицированному методу Spatz and StrittmaUer (1971). Трипсиковые фрагменты NADPH-FP (т-NADPH-FP) и Ь5 (т-Ь5) выделяли по методу Omura and Takesue (1970).
Содержание цитохрома Р450 измеряли по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО-комплекса при длинах волн 450 и 490 нм (Omura and Sato, 1964). При расчетах использовали коэффициент молярной экстинции 91 мМ"1 см"1.
Содержание NADPH-FP определяли по абсолютному спектру поглощения в диапазоне 300-600 нм, используя коэффициент молярной экстинции 21.4 мМ'1 см"1 для "К 456 (Dignam and Strobe!, 1977).
Содержание цитохрома Ь5 определяли но дифференциальной схеме. Коэффициент молярной экстинции для А424-408 восстановленной формы Ь5 165 мМ-1 см-1.
Мономеризацию Р4502В4 и NADPH-FP проводили по методу Kanaeva et al. (1992, а).
Мономеризацию цитохрома Ь5 проводили в 500 мМ К-фосфатном буфере, рН=7.2, содержащем 0.25 г/л эмульгена 913, в течении 18-24 часов.
Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmli (1970).
Для регистрации спектров связывания Р4502В4 и Ь5 использовали дифференциальную схему для четырехкюветнои тандемной системы в
диапазоне 350-450 нм. Расчет Kj проводили с использованием программы "Spec Ks/Kd" по уравнению Скэтчарда.
Кинетику NADPH- и дитионит-записимого восстановления Р4502В4 и Ь5 регистрировали в анаэробных условиях при 30 С. За процессом восстановления следили по изменению разности оптических плотностей при длинах волн 450 и 490 для Р4502В4, 424 и 408 для Ь5. Обработку кинетических кривых восстановления осуществляли с использованием методов нелинейной регрессии при помощи программы SpectraLab (Davydov et al., 1995).
Определение скорости окисления NADPH проводили при 340 нм, в термостатируемой кювете при 30 С, используя коэффициент молярной экстинции 6.22 мМ"1 СМ"1.
Все спектральные измерения проводили на спектрофотометре "Hewlett Packard" 8451А (США).
Скорость генерации Н2О2 определяли тиоцианатным методом (Thurman et а]., 1972).
Скорость генерации О2 определяли путем регистрации скорости восстановления сукцинилировашюго цитохрома с (Жуков и Арчаков, 1985).
Скорость NADPH-зависимого N-деметилирования БФ, ДМА и анилина (АН) определяли по накоплению формальдегида (ФА). Скорость О-деметилирования п-нитроанизола (п-НА) определяли по скорости накопления п-нитрофенола (Kanaeva et al., 1992 a, b)
Определение концентрации оксикомплекса Р4502В4 проводили по истоду Werringloer and Kawano (1980).
Константы скорости образования комплекса Р4502В4 - Ь5 к+\ были засчитаны из кривых сдвига спинового равновесия Р4502В4 в сторону его чысокоспиновой формы, регистрируемого по увеличению разности эптическнх плотностей при длинах волн 386 и 417 нм, с использованием такета программ SpectraLab (Davydov et al., 1995). Константы скорости эаспада комплекса Р4502В4 - Ь5 были расчитапы из следующей рормулы:
k.i - !< Зремя жизни комплекса расчитывали как X — 1 / k_j