Введение к работе
Актуальность проблемы. Сигнальный путь Sonic Hedgehog (Shh) является ключевым механизмом, регулирующим клеточную пролиферацию в ходе эмбриогенеза и раннего онтогенеза позвоночных (Marti and Bovalenta, 2002). В отсутствии лиганда Shh, антагонизирующий рецептор Patched1 (Ptch1) подавляет активность онкопротеина Smoothened (Smo), тем самым блокируя передачу сигнала в каскаде. Взаимодействие Shh с Ptch1 отменяет ингибирование Smo, в результате чего происходит запуск каскада событий, кульминацией которых является активация транскрипционных факторов Gli, способствующих транскрипции генов, регулирующих пролиферацию. Чрезмерная активация каскада Shh являе тся ведущей причиной развития многих онкологических заболеваний, в том числе медуллобластомы (МБ) – злокачественной опухоли мозжечка у детей (Rubin and de Sauvage, 2006). Пятилетняя выживаемость при МБ составляет не более 75%, однако метастазирование и рецидив опухоли нередко приводят к снижению данного показателя до 35% (Gajjar and Robinson, 2014).
Традиционными методами лечения МБ является комбинация онкохирургии, краниоспинального облучения и хи миотерапии. Ввиду неспецифичности действия, данные подходы сопряжены с развитием тяжелых нейрокогнитивных и нейроэндокринных расстройств, обусловленных поражением развивающихся тканей и органов. Получившая широкое распространение таргетная терапия направлена на подавление каскада Shh в онкотрансформированных клетках (Kieran, 2014). Мишенью данного подхода является отдельный компонент каскада – онкопротеин Smoothened (Smo). В виду высокой токсичности и тяжелых побочных эффектов клинические испытания антагонистов Smo для больных МБ были остановлены (Robinson et al., 2015). Таким образом, существует острая необходимость в разработке эффективных и менее токсичных подходов к таргетной терапии МБ.
Несмотря на то, что каскад Shh изучен относительно хорошо, механизмы его регуляции неясны. В исследовании Yang сообщается, что после активации каскада Shh часть клеток завершает клеточный цикл и дифференцируется, в то время как остальные к летки продолжают бесконтрольное деление (Yang et al., 2008). Данное наблюдение указывает на существование некоего фактора, поддерживающего Shh-опосредованную клеточную пролиферацию. Ранее сообщалось, что ткани МБ экспрессируют маркер стволовых клеток филамент нестин (Rao et al., 2003). Нами было обнаружено, что клетки, продолжающие деление, экспрессируют нестин. Несмотря на то, что строение и функции нестина были описаны ранее, его значение в онкогенезе Shh-опосредованных заболеваний неизвестно.
Неисследованными остаются и механизмы регуляции экспрессии нестина. Известно, что холестерин необходим для функионирования отдельных компонентов каскада Shh. Исследования влияния холестерина и его производных на пролиферацию клеток МБ in vitro подтвердили потенциал данных соединений к регуляции Shh-опосредованного клеточного деления (Huang et al, 2016; Byrne et al, 2016).
Мы предположили, что высокая экспрессия белка нестина в тканях МБ обусловлена его ролью в онкогенезе, а именно может быть связана с передачей сигнала Shh в онкотрансформированных клетках. Вместе с тем , холестерин, выступая в качестве активатора каскада Shh, может оказывать регулирующие действие на экспрессию нестина, а значит в перспективе может явиться новой мишенью для таргетной терапии злокачественных новообразований группы Shh.
В соответствии с вышеизложенным была поставлена цель – выявить механизм, посредством которого биосинтез холестерина воздействует на экспрессию белка нестина при онкогенезе медуллобластомы типа Shh.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Провести анализ экспрессии белка нестина в мозжечке мыши в норме и при онкогенезе медуллобластомы типа Shh.
-
Исследовать влияние белка нестина на Shh-опосредованную пролиферацию клеток медуллобластомы мыши in vitro и in vivo.
-
Определить уровень активации биосинтеза холестерина в клетках и тканях медуллобластомы типа Shh.
-
Выявить эффекты снижения уровня эндогенного холестерина на нестин-опосредованную пролиферацию клеток медуллобластомы типа Shh мыши in vitro и in vivo.
-
Установить внутриклеточную мишень, на которую воздействует холестерин при активации сигнального пути Shh в клетках медуллобластомы.
-
Показать влияние ингибиторов биосинтеза холестерина статинов и их комбинации с антагонистом Smo висмодегибом на рост подкожного аллотрансплантанта медуллобластомы типа Shh.
Научная новизна. В данной работе впервые установлено влияние биосинтеза холестерина на экспрессию структурного филамента нестина в контексте Shh-опосредованного онкогенеза МБ. Показано, что экспрессия нестина в клетках МБ и их предшественниках способствует поддержанию Shh-опосредованной пролиферации. Было обнаружено, что клетки МБ мыши характеризуются повышенной активностью биосинтеза холестерина, ингибирование которого блокирует опухолевый рост. Подавление митотической активности клеток МБ было обусловлено снижением экспрессии нестина и ослаблением передачи сигнала в каскаде Shh. Исследования по установлению внутриклеточной мишени холестерина выявили участие последнего в активации онкопротеина Smo. Использование ингибиторов биосинтеза холестерина статинов способствовало подавлению клеточной пролиферации и опухолевого роста МБ. Было п редложено обоснование для применения комбинированной терапии стати нов с антагонистом Smo висмодегибом, а также показана терапевтическая эффективность данной методики.
Научно-практическая значимость работы. Установление роли нестина и холестерина представляет особый интерес для глубокого понимания механизма регуляции и ф ункционирования сигнального каскада Shh. Наряду с фундаментальным значением, полученные данные предлагают обоснование для использования альтернативных мишеней для таргетной терапии Shh-
опосредованных онкологических заболеваний. Например, использование статинов для контроля опухолевого роста может способствовать сокращению побочных эффектов традиционной терапии МБ. Обнаружено, что использование статинов в сочетании антагонистом Smo висмодегибом характеризуется синергетическим эффектом в подавлении роста опухоли МБ. Использование данного подхода позволит снизить дозу высокотоксичного висмодегиба и тем самым минимизировать побочные эффекты терапии.
Положения, выносимые на защиту:
-
В ткани опухоли медуллобластомы типа Shh обнаружена высокая экспрессия белка н естина, который является модулятором Shh-опосредованной клеточной пролиферации.
-
Посредством активации онкопротеина Smoothened холестерин оказывает активирующее действие нестин-опосредованную клеточную пролиферацию.
-
Подавление биосинтеза холестерина с использованием генетических и фармакологических методов блокирует нестин-зависимую пролиферацию и прогрессию клеток медуллобластомы мыши.
Апробация работы. Результаты исследования были изложены на ежегодной конференции Американской ассоциации по исследованию о пухоли (American Association for cancer Research) (Филадельфия, США, 2015), на 4-ом ежегодном симпозиуме Темпльского Университета, посвященном проблемам трансляционной науки (Филадельфия, США, 2016), на III В сероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2016), на V съезде сообщества биохимиков России (Дагомыс, 2016), на 20-ой, 21-ой и 22-ой (устный доклад отмечен первым местом в рамках конференции) ежедгодных конференциях онкологического центра Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2015, 2016 и 2017), на VIII Конференции молодых ученых РМАНПО «Горизонты медицинской науки» (Москва, 2017), на ежегодной VI Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли » (Казань, 2017), на 4-ой международной конференции, посвященной фундаментальным и трансляционным исследованиям в области педиатрической нейро-онкологии (Society for Neuro-Oncology) (Нью-Йорк, США, 2017), на 22-ом ежегодном съезде нейро-онкологического сообщества (Society for Neuro-Oncology) (Сан-Франциско, США, 2017).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, среди которых 7 публикаций в журналах, рекомендуемых В АК и индексируемых в базе SCOPUS, а также 11 тезисов научных докладов в сборниках всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов их обсуждения, выводов, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включает 1 таблицу и 48 рисунков. Библиография включает 168 наименований.