Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 12
2.1 Принятые классификации гликозидгидролаз 12
2.2 Механизмы действия гликозидгидролаз 15
2.3 Методы изучения механизмов ферментативных реакций 19
2.3.1 Спектрофотометрический метод определения скорости ферментативных реакций 19
2.3.2 Метод ЯМР-спектроскопии и его применение в биохимических исследованиях 20
2.3.3 Зависимость реакционной способности реагентов от их структуры 22
2.4 Ферментативный синтез гликозидной связи 26
2.4.1 Синтез гликозидной связи гликозилтрансферазами и гликозидгидролазами 26
2.4.2 Гликозилсинтазы 29
2.4.3 Региоселективность гликозидгидролаз и способы её изменения 32
2.5 Альфа-галактозиды – природные субстраты -галактозидаз 34
2.6 Альфа-галактозидазы микроорганизмов 36
3 Экспериментальная часть 39
3.1 Материалы и реагенты 39
3.2 Субстраты 39
3.3 Штаммы и плазмиды 40
3.4 Трансформация плазмид 40
3.5 Выделение рекомбинантной -галактозидазы дикого типа и её мутантных форм 41
3.6 Методы измерения гидролитической активности -галактозидазы из Thermotoga maritima 43
3.7 Определение концентрации белка 44
3.8 Методы определения гомогенности и молекулярной массы ферментов 44
3.9 Определение кинетических характеристик реакции гидролиза п-НФГ, катализируемой -галактозидазой 45
3.10 Определение кинетических характеристик реакции гидролиза мелибиозы, раффинозы и стахиозы, катализируемой TmГалА-ДТ 45
3.11 Исследование влияния рН на гидролитическую активность и стабильность рекомбинантных ферментов 46
3.12 Исследование влияния температуры на гидролитическую активность и стабильность TmГалА-ДТ 47
3.13 Анализ стереохимии продуктов ферментативного гидролиза п-НФГ, катализируемого рекомбинантными ферментами, методом ЯМР 1Н спектроскопии 47
3.14 Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза, катализируемой рекомбинантными ферментами 48
3.15 Определение влияния внешних нуклеофилов на гидролитическую активность ферментных препаратов 49
3.16 Метод тонкослойной хроматографии 50
3.17 Выделение и идентификация п-НФ-дигалактозидов, полученных в реакции трансгликозилирования, катализируемой TmГалА-ДТ 50
3.18 Анализ реакций трансгликозилирования, катализируемых ферментными препаратами -галактозидазы 51
3.19 Определение рН-оптимума реакций трансгликозилирования, катализируемых ферментными препаратами -галактозидазы 51
4 Результаты и обсуждение 53
4.1 Получение и характеристика рекомбинантной -галактозидазы из T. maritima MSB8 и её мутантных форм D327G и D387G 53
4.2 Установление механизма реакции гидролиза, катализируемой ТмГалА 58
4.2.1 Сравнение первичных аминокислотных последовательностей ферментов, гомологичных ТмГалА 58
4.2.2 Стереохимический результат действия -галактозидазы из T. maritima.59
4.2.3 Каталитические свойства исследуемых ферментов 61
4.2.3.1 Анализ кинетических параметров реакций гидролиза, катализируемых ТмГалА-ДТ, ТмГалА-D327G и ТмГалА-D387G 61
4.2.3.2 Влияние внешнего нуклеофила на скорость реакций гидролиза п-НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами 66
4.2.3.3 Зависимость скорости реакции гидролиза п-НФГ, катализируемой исследуемыми ферментами, от рН 72
4.2.4 Определение скорость-лимитирующей стадии реакций гидролиза п НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами 74
4.4 Изучение реакции трансгликозилирования, катализируемой ТмГалА 79
4.4.1 Исследование трансгликозилирующей активности ТмГалА-ДТ 79
4.4.2 Рациональный дизайн и характеристика мутантных форм ТмГалА 81
5 Основные результаты и выводы 88
6 Список сокращений 91
Список литературы 93
Приложение А. Сравнение первичных аминокислотных последовательностей -галактозидаз GH36 семейства 109
- Механизмы действия гликозидгидролаз
- Получение и характеристика рекомбинантной -галактозидазы из T. maritima MSB8 и её мутантных форм D327G и D387G
- Влияние внешнего нуклеофила на скорость реакций гидролиза п-НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами
- Рациональный дизайн и характеристика мутантных форм ТмГалА
Механизмы действия гликозидгидролаз
Абсолютное большинство гликозидгидролаз по механизму действия разделяются на так называемые «сохраняющие» и «обращающие» ферменты, в зависимости от результата каталитической реакции: наличия или отсутствия изменений аномерной конфигурации атома углерода в результате реакции (Рисунок 3).
Элементарные механизмы действия обеих групп гликозидгидролаз были предложены Koshland в 1953 году [61]. Между устройствами активных центров обеих групп гликозидгидролаз существует значительное сходство, связанное со стабилизацией в похожих переходных состояниях. Как правило, активные центры обеих групп гликозидгидролаз содержат две карбоновые кислоты, играющие ключевую роль в процессе катализа. Однако в ферментах разных групп, как стало позже известно из исследований структур этих белков, каталитические аминокислотные остатки находятся на разных расстояниях между собой: у «обращающих» гликозидгидролаз расстояние между двумя каталитическими аминокислотами составляет порядка 0.95 нм, а у «сохраняющих» - около 0.55 нм [73]. Подобная разница в расстояниях вполне согласуется с механизмами катализа. «Обращающие» гликозидгидролазы действуют по механизму прямого нуклеофильного SN2-замещения, в котором две карбоновые кислоты в активном центре расположены так, что кислотный каталитический аминокислотный остаток протонирует гликозидный кислород, в то время как основный каталитический аминокислотный остаток активирует входящую молекулу воды. Этот процесс характеризуется образованием промежуточного карбоксоний-ион подобного переходного состояния (Рисунок 4, взят из статьи [18]). Расстояние между аминокислотами размером 0.95 нм, по всей видимости, такое, чтобы субстрат и вода могли связываться одновременно.
Что касается типичных «сохраняющих» гликозидгидролаз, то они действуют по механизму двойного SN2-замещения, состоящему из двух стадий: образования ковалентно связанного фермент-субстратного комплекса (гликозилирования) и его гидролиза (дегликозилирования). Обе эти стадии также проходят через образование промежуточного карбоксоний-ион подобного переходного состояния. В реакции задействованы два аминокислотных остатка, один из которых выполняет функции кислотно-основного катализатора, а второй является нуклеофилом. На первой стадии реакции карбоксильная группа кислотной аминокислоты протонирует гликозидный кислород, в то время как нуклеофил атакует аномерный атом углерода сахара, что приводит к уходу агликоновой группы субстрата и образованию ковалентно связанного фермент-субстратного комплекса. На второй стадии реакции та же самая аминокислота, выполнявшая функции кислоты на первой стадии, действует как основание, активируя входящий акцептор, роль которого могут исполнять вода, спирт, сахарный остаток и другие соединения с гидроксигруппами. В результате образуется продукт, имеющий ту же самую аномерную конфигурацию первого углеродного атома, что и у субстрата (Рисунок 5, взят из статьи [18]). Более короткое расстояние между двумя каталитическими аминокислотами (около 0.55 нм) обусловлено необходимостью прямой нуклеофильной атаки.
По одному из двух вышеописанных механизмов действует подавляющее большинство известных гликозидгидролаз. Однако существуют и исключения. Так, в некоторых случаях ферменты не содержат каталитического нуклеофила, а их функции выполняет ацетамидная группа, присоединённая к С-2 атому субстрата [101]. Также недавно был обнаружен совершенно неродственный механизм реакции гидролиза, по которому действуют гликозидгидролазы, относящиеся к двум различным семействам, и требующий участия НАД+ в качестве кофактора [69, 88]. Идентификация аминокислот, участвующих в катализе, является важной задачей для понимания каталитического механизма фермента.
Для изучения механизмов ферментативных реакций используются разные методы. К классическим относятся манометрический, вискозиметрический и поляриметрический методы, к наиболее современным - ЯМР- и ЭПР-спектроскопия. Широко применяются спектрофотометрия, спектрофлуорометрия, автоматические титрование, а так же методы с использованием субстратов, меченных радиоактивными изотопами [3].
Более подробно об основных используемых в данной работе методах рассказано ниже.
Получение и характеристика рекомбинантной -галактозидазы из T. maritima MSB8 и её мутантных форм D327G и D387G
Ранее ген -галактозидазы galA из T. maritima MSB8 был клонирован и экспрессирован в клетках бактериальной культуры E. coli BL21(DE3) [68]. Генетические конструкции на основе вектора pET24D (Novagen, San Diego, CA), содержащие гены -галактозидазы дикого типа из Thermotoga maritima и её мутантных форм D327G и D387G, были любезно предоставлены проф. R. Kelly (North Carolina State University, США).
Рекомбинантная TmГалА-ДТ и её мутантные формы, TmГалА-D327G и TmГалА-D387G, были выделены из культуры E. coli BL21(DE3) и очищены до гомогенного состояния в ходе двух хроматографических стадий. Очищенные ферменты имели удельную активность 8.5 ± 0.1 ед/мг (TmГалА-ДТ), 0.030 ± 0.002 ед/мг (TmГалА-D327G) и 0.014 ± 0.002 ед/мг (TmГалА-D387G) и не содержали примесных экзо-гликозидазных активностей. Анализ очищенных ферментов в денатурирующих условиях с использованием электрофореза в полиакриламидном геле показал, что все выделенные ферменты мигрируют в виде единичной зоны с молекулярной массой 60±1 кДа (Рисунок 11).
Для исследования свойств рекомбинантных ферментов в качестве субстрата использовался пара-нитрофенил--D-галактопиранозид (п-НФГ), если не указано иное. Данный субстрат является синтетическим, и продукт реакции его гидролиза – свободный пара-нитрофенол, является хромофором. Пара-нитрофенол имеет область поглощения в видимой области спектра, причём, максимум поглощения и коэффициент экстинкции зависят от рН раствора. Скорость реакции гидролиза легко можно измерить по скорости появления п-НФ в реакционной смеси. Высокий коэффициент экстинкции (18300 М-1см-1 при рН 10.2 [2]) позволяет проводить измерения при невысоких значениях конверсии, что позволяет получить кривые полной кинетики с достаточной точностью, зависящей от технических характеристик прибора. Таким образом, спектрофотометрический метод оказался очень удобным при проведении данного исследования.
Все кинетические исследования проводились при температуре 37 С, если не указано иное. Такая температура была выбрана для минимизации спонтанного гидролиза субстратов.
При изучении физико-химических свойств TmГалА-ДТ было установлено, что фермент обладает наибольшей активностью в диапазоне рН 4.5 - 5.5 (рисунок 12) и высокой термостабильностью (рисунок 13). Время полужизни рекомбинантной TmГалА-ДТ при температуре 80 С составляет более 10 минут.
Было установлено, что а-галактозидаза из Т. maritima катализирует реакцию гидролиза субстратов с а-галактозой в качестве гликона; активности ТмГалА-ДТ по таким субстратам, как 4-нитрофенил-а-ксилопиранозид, 4-нитрофенил-а-Ь-фукопиранозид, 4-нитрофенил-а-маннопиранозид и 4 нитрофенил--глюкопиранозид обнаружено не было. В качестве природных субстратов были взяты соединения, содержащие -D-(1-6)-галактопиранозид на невосстанавливающем конце, такие как: мелибиоза (-D-галактопиранозил-(1-6)-D-глюкопираноза), раффиноза (-D-галактопиранозил-(1-6)--D-глюкопиранозил-(1-2)--D-фруктофуранозид) и стахиоза (-D-галактопиранозил-(1-6)--D-галактопиранозил-(1-6)--D-глюкопиранозил-(1-2)--D-фруктофуранозид). Кинетические параметры реакции гидролиза и формулы природных субстратов представлены в таблице 2.
По принятой номенклатуре [19] гликон занимает -1 сайт активного центра фермента, в то время как уходящая группа занимает +1 сайт. Самое низкое значение Km и самое высокое значение kcat/Km было найдено для мелибиозы, в то время как два других, более длинных, сахарида показали пониженное сродство к ферменту. Согласно теории Hiromi [49, 50], полученные данные позволяют сделать предположение, что в активном центре фермента имеются только два сайта связывания субстрата, т. е. ТмГалА-ДТ не обладает +2 сайтом связывания.
Влияние внешнего нуклеофила на скорость реакций гидролиза п-НФГ, катализируемых исследуемыми ферментами
Эксперимент по восстановлению гидролитической активности мутантных форм ферментов путём добавления внешнего нуклеофила может предоставить однозначные доказательства роли заменённых аминокислот в реакции гидролиза, а также подтвердить предложенный двух-стадийный механизм катализа [81]. В результате замены каталитической аминокислоты (остаток аспарагиновой кислоты в случае ТмГалА) на глицин в активном центре фермента образуется пространство, куда могут проникать внешние нуклеофилы, такие как азид. В случае, когда заменённая на нейтральную аминокислота выполняла роль кислотно-оснвного катализатора, ион азида атакует гликозилферментный комплекс, в результате чего образуется гликозилазид с сохранённой аномерной конфигурацией (Рисунок 16).
В случае, когда заменённая аминокислота выполняет функции нуклеофила, ион азида атакует аномерный атом углерода сахара, что приводит к образованию гликозилазида с обращённой аномерной конфигурацией (Рисунок 17).
Обнаружение соответствующих продуктов в реакционной смеси подтверждает назначение двух каталитических остатков.
Так, для ТмГалА-ДТ, ТмГалА-D327G и ТмГалА-D387G было исследовано влияние внешних нуклеофилов, для чего использовали такие низкомолекулярные соединения, как азид натрия (NaN3) и формиат натрия (HCOONa). В случае фермента дикого типа увеличения каталитической скорости или эффективности в присутствии как азида, так и формиата натрия не наблюдалось. Это согласуется с данными по -галактозидазе из S. solfataricus, где также не наблюдалось увеличение активности при добавлении в реакционную смесь внешнего нуклеофила [16].
Добавление азида натрия в реакцию, катализируемую ТмГалА-D327G, привело к 30-кратному увеличению скорости реакции гидролиза субстрата п-НФГ. При этом скорость имела очевидную зависимость от концентрации внешнего нуклеофила (рисунок 18).
Было показано, что даже при небольших концентрациях азида (40 мМ) активность мутанта увеличивалась в 10 раз, что представляет собой типичное поведение для нуклеофильных мутантов сохраняющих гликозидаз, таких как -фукозидаза из T. maritima и 1,3-1,4--глюканаза из Bacillus licheniformis [99, 104]. Компоненты реакционной смеси после реакции гидролиза субстрата п-НФГ в присутствии азида натрия с концентрацией 100 мМ, катализируемой ТмГалА-D327G, были проанализированы методами ТСХ и ЯМР-спектроскопии, в результате чего было обнаружено появление нового продукта (Rf = 0.53), отличного от -D-галактопиранозида (Rf = 0.27) и п-НФГ (Rf = 0.64). Этот новый продукт был идентифицирован как азид--D-галактопиранозид (Таблица 5). Очевидно, что азид активизирует ТмГалА-D327G, в результате чего посредством единичной обращающей трансформации сахарного кольца образуется галактозилазид, что окончательно доказывает, что аминокислотный остаток D327 является каталитическим нуклеофилом.
При гидролизе п-НФГ ферментом ТмГалА-D387G в присутствии 100 мМ азида натрия наблюдалось меньшее, а именно, 40%-ное, увеличение скорости реакции гидролиза и, соответственно, каталитической эффективности, что характерно в случаях, когда дегликозилирование является скорость-лимитирующей стадией реакции гидролиза гликозидной связи [96]. Метод ЯМР-спектроскопии показал появление дополнительного ассоциированного сигнала с химическим сдвигом = 5.55 вместе с ожидаемыми сигналами для - и -аномеров D-галактозы. Через 60 минут концентрация нового продукта достигла 0.57 мМ, что составляло 57% от всех полученных продуктов. Значения химических сдвигов для этого соединения показали, что данный продукт является азид--D-галактопиранозидом (Таблица 5). Образование -галактозилазида в реакции, катализируемой ТмГалА-D387G, и его отсутствие в реакции, катализируемой ТмГалА-ДТ скорей всего является следствием ослабления оснвного катализа в ТмГалА-D387G, из чего можно сделать предположение, что аминокислотный остаток D387 является кислотно-оснвным каталитическим остатком. В целом, конечное сохранение аномерной конфигурации атома С1 наблюдалось методом ЯМР-спектроскопии для продуктов реакции гидролиза п-НФГ, катализируемой ТмГалА-D387G.
Рациональный дизайн и характеристика мутантных форм ТмГалА
По результатам молекулярного моделирования, выполненного Рычковым Г.Н., кафедра биофизики, Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и описанного в работе [1], было предложено исследовать свойства ферментов, содержащих семь отдельных точечных мутаций.
Ферменты ТмГалА-ДТ и мутантные формы ТмГалА-W85Y, ТмГалА-F194K, ТмГалА-L195C, ТмГалА-F328A, ТмГалА-P402D, ТмГалА-P402S, ТмГалА-G385L были выделены с использованием двух хроматографических стадий согласно методу, описанному ранее. На конечной стадии очистки были получены гомогенные по данным электрофореза ферменты. Согласно данным электрофореза в присутствии ДСН, каждый белок мигрировал в виде единичной зоны, молекулярная масса фермента соответствовала 60 ± 1 кДа, в точном соответствии с молекулярной массой ТмГалА-ДТ. Были получены кинетические параметры Km, kcat и kcat/Km реакции гидролиза п-НФГ, представленные в Таблице 5.
Никаких значительных изменений в кинетических параметрах гидролитических реакций не наблюдалось для ТмГалА-P402S и ТмГалА-W85Y, в то время как значения kcat/Km для ТмГалА-P402D, ТмГалА-F328A и ТмГалА-L195C уменьшились более чем в два раза по сравнению с ТмГалА-ДТ. Мутация G385L привела к уменьшению удельной активности фермента в два раза в процессе его очистки. Кинетические параметры для ТмГалА-G385L не были определены из-за его нестабильности.
Для того чтобы оценить изменения активности мутантных форм ТмГалА в реакции трансгликозилирования, кинетические параметры этих реакций были получены для очищенных ферментных препаратов. Исключение составил грубый препарат ТмГалА-G385L, полученный после стадии тепловой обработки. Сравнение проводилось с данными, полученными в таких же условиях для реакции трансгликозилирования, катализируемой ТмГалА-ДТ. Три мутантных фермента заметно улучшили свои свойства в реакции трансгликозилирования. В частности, у ТмГалА-P402D и ТмГалА-F328A выход продуктов с типом связи (1,2) увеличился соответственно в 4 и 16 раз по сравнению с выходом продуктов у ТмГалА-ДТ (Таблица 6).
При этом наблюдалось общее снижение выхода продуктов с типами связи (1,3)-/(1,6)- по отношению к (1,2)-. Грубый препарат G385L также продемонстрировал увеличение выходов продуктов трансгликозилирования, но не рассматривался в дальнейшем из-за своей нестабильности в чистом виде.
Для ТмГалА-F328A и ТмГалА-P402D были определены оптимальные условия рН в реакциях гидролиза и трансгликозилирования. В гидролитических реакциях оптимум рН как ТмГалА-F328A и ТмГалА-P402D, так и ТмГалА-ДТ, существенно не отличался и находился в диапазоне рН 4,5–5,5 (данные не показаны). В то же время изменение pH неодинаково сказывалось на характере трансгликозилирующей активности каждого из ферментов. У мутантной формы фермента ТмГалА-F328A наблюдалась строгая зависимость выхода (1,2)-дигалактозидов от величины рН (Рисунок 23, б), при этом скорость их образования в диапазоне рН 3,0–3,5 была в 4–5 раз выше, чем для двух других региоизомеров.
Однако увеличение pH выше 6,0 не приводило к дальнейшему изменению выходов всех трёх изомеров. Характеристики мутанта ТмГалА-P402D имели существенные отличия (Рисунок 23, в). Так, общий выход продуктов трансгликозилирования был на порядок меньше, чем для ТмГалА-F328A, и при величине рН 6,0 отмечался максимум активности в отношении образования (1,2)-региоизомеров, который, тем не менее, незначительно превышал базовую активность. Дальнейший сдвиг значений pH в щелочную сторону приводил к снижению активности ТмГалА-P402D. В отношении ТмГалА-ДТ не удалось выявить строгой зависимости образования (1,2)- и (1,6)-дигалактозидов от pH (Рисунок 23, а), при этом для образования (1,3)-дигалактозида кислые значения рН были более предпочтительны.
Таким образом, по данным эксперимента in silico были предложены несколько мутаций фермента, способных вызвать изменение эффективности ТмГалА в реакции трансгликозилирования. Однако из семи предложенных мутаций только три, действительно, продемонстрировали заметное увеличение способности фермента образовывать новые галактозидные связи. Наиболее перспективной оказалась замена F328A, которая привела к увеличению выхода (1,2)-дигалактозида в 16 раз. Такое увеличение продуктов трансгликозилирования с (1,2)-дигалактозидной связью можно объяснить тем, что в ферменте дикого типа фенильное кольцо F328 предотвращает близкий подход ОН2 галактозы п-НФГ к аномерному центру C1 галактозила в составе ковалентного комплекса. Замена этого аминокислотного остатка на меньший приводит к расширению входа в активный центр фермента рядом с аномерным углеродом стабильного интермедиата. Кроме того, экспериментальные данные, полученные для ТмГалА-F328А, показали увеличение трансгликозилирующей активности в кислом диапазоне значений рН. Возможно, протонирование обоих каталитических аминокислотных остатков в активном центре приводит к снижению гидролитической активности фермента и увеличению выходов продукта Гал-(1,2)-Гал-п-НФ.
В случае мутации P402D взаимодействия OH2 и OH3 групп п-НФГ с карбоксилатом D402 стабилизируют положения акцептора, выгодные для образования (1,6)-гликозидной связи, в то время как аналогичные взаимодействия OH6 с карбоксилатом препятствуют плотному контакту OH2 и OH3 групп с аномерным атомом C1 галактозила. Необходимо отметить, что для ТмГалА-F328A и ТмГалА-P402D увеличивается посещаемость конформаций, выгодных для формирования (1,2)- и (1,6)-галактозидных связей, а для ТмГалА-F328A, помимо этого, появляется возможность формирования (1,4)-галактозидной связи.
Кроме того, для увеличения общей трансгликозилирующей активности представлялось целесообразным увеличить кислотность аминокислоты, выполняющей роль кислотно-основного катализатора (в нашем случае – остаток D387). Подобный подход был продемонстрирован для -L-фукозидазы из T. maritima, которую методом направленной эволюции преобразовали в трансгликозидазу [85]. Авторы показали, что несколько аминокислотных остатков, расположенных во второй полости активного центра фермента, оказывали влияние на способности -L-фукозидазы к трансгликозилированию путём переориентации аминокислотных остатков, находящихся в прямом взаимодействии с субстратом. Были сопоставлены обе структуры (-L-фукозидазы и ТмГалА; данные не показаны) и обнаружено, что в ТмГалА существует аминокислотный остаток, который потенциально может вызвать тот же эффект, что и в упоминаемом ферменте. Однако в экспериментальных условиях мутация G385L привела к незначительному изменению трансгликозилирующей активности. Было обнаружено 4-кратное увеличение удельной активности в клеточном лизате и общая нестабильность ферментативных свойств этого мутанта в очищенном виде. Одним из возможных объяснений подобного эффекта может быть существенное изменение третичной структуры белка, моделирование которого требует использования методов молекулярной динамики с чрезвычайно продолжительной траекторией и проведения отдельного структурного исследования. Главным результатом данной части работы было обнаружение мутаций в ТмГалА, которые привели к предсказанному увеличению трансгликозилирующей эффективности -галактозидазы. Примечательно, что достаточно высокие выходы продуктов трансгликозилирования были достигнуты в отношении связи (1,2)-, которая синтезировалась в минорных количествах ферментом дикого типа. Фермент ТмГалА-F328A показал значительный сдвиг региоселективности реакции трансгликозилирования, что подтверждает возможность управления свойствами фермента на основе теоретических расчётов, выполненных методами молекулярного моделирования. Полученные в результате настоящей работы данные об аминокислотных остатках, вовлечённых в реакцию трансгликозилирования ТмГалА, дают возможность создать эффективный инструмент для направленного синтеза -галактосодержащих соединений с высокими выходами.