Введение к работе
Актуальность проблемны
Важная роль в регуляции иммунного ответа и эсспзления, в механизмах антимикробной устойчивости и противоонунміевой защиты организма принадлежи- растворимым медиаторам, секрегируемым акгпвзроззнннш макрофагами - моноюшам (Durun, орр?л&=ііс.. 1эеэ). В последние годы большое внимание уделяется исследованию фактора зекроза опухолзй-с (ФИО-а), одного из мзкрофагалькых зитокиное, его роли в интеграции иммунных, биохимических и Микологических процессов. Кзеєстно, что кроме цитотокскческого эффекта нэ клетки некоторых опухолей ФНО-а способен оказывать рзгуларугге воздействие на метаболизм нормальных клеток (маигу, гэве). йногочисленные экспериментальные данные свидетельствует о том, что SHO-a является
ОДНИМ ИЗ Важнейших ВОСПаЛИТеЛНЫХ медиаторов (B=utler 4 Ceiami,
1990; pong s Lowry, 1990). Клинические исследования покззали. что йЮ-я является центральны!»! медиатором септического шока при инфекционных заболеваниях, вызванных грзмстрицательш&и бактериями
(Тгасгу S Cerani, 1989).
Показано, что активированные макрофаги синтезируте в больших количествах ИЛ-8. который является хемотаксиком е активатором нейтрофилов, чем способствуют вовлечению кх в ьоспгЕіте"льішй ответ
(osiiimura Т, et а!., 1937; Van Damme J. et al.,1988; Durun - Oppenheim, 1989; Katsushina & Oppenheim; 19B9). КЛ-В-КЛЗСЇЄ C КЛ-І
обнарусивзется з образцах кожи пациентов с пссрюзом. Одной из причин этого заболевания считается нарушение норгпльясго сиктега этих двух цитокинов. Ил-8 также участвует в воспа-титгзьных процессах при артритах, поскольку оыло показано, что он секретируется
СТИМуЛИрОВаННЫШ СИНОВИаЛЬНЫМИ Клетками (Golds Е.Е. et al., 19S9) и ХОНДРСЦИТЗМИ (Van Dzsma J. et.all., 1Э90).
Молекулярные механизмы быстрого выделения SKQ-a и ШІ-8 моноцитами под влиянием бактериальных эндотоксина к настоящему времени изучены недг.статочно. " Исследования закономерностей синтеза ФНО-а и ИЛ-8 коноцптгми/макрофзгэми человека и животшх, выполненные несколькими группами исследователей, проведены на клетках, выделенных в условия! адгезии.ши в результате зведення тиогликолятз в брхиную полость подопытных животных. Применение таких методоз может вызывать 'активацию моноцитов и макрофагов и, следовательно, приводить к получению в экспериментах искагеняых даншпс о механизмах синтеза моноюшов, а также регуляции экспрессии ангионкогена р53. Исходя пз этого, был использован метод очистки г.оноцитов нэ градиентах плотности, позволяющий свести К МИНИЦ!»У возможность
активации клеток з процессе евдзлєния из доиорской крови.
Ядерный фэсфопротеик роЗ является одним из многофункциональных белков клетоЕ животных. В настоящее время, основываясь на множестве данных, р53 принято считать антионкогеном, нарушения эксвресии которого, либо мутации приводят к различным видам злокачественных
ОПУХОЛеЙ (Lewine A.J. et ai.,1991). ПО-ВИДИМОМУ p53 Участвует В
регуляции клеточного цикла,-поскольку известно, что количества белка в клетке, а также его мРНК меняются в зависимости от фазы цикла. Недавно было обнаружено, что активация лимфоцитов крови человека приводит к шязлении в них зрелой мРНК р53, а активация моноцитов
ЛЛС ПРИВОДИТ К реЗКОМУ СНИЖеНЖЮ И ИСЧЄЗНОВЄЕИЮ ЭТОЙ МРНК {Osipovich
et ai.,1992). Считается, что такое разное поведение мРНК р53 в лимфоцитах и моноцитах обусловлено различными фазани клеточного цикла в котором эти клетки находятся б состоянии покоя, по мимо этого актившда лимфоцитов приводит к их пролиферации, в то время как, моноцита не пролиферируют в ответ на активацию.
Известно, что р53 принимает участие в регуляции транскрипции гена мытечзог креатин киназы; совместно с продуктом гена Ras модулирет экспрессию гена маті; совместно с другим антионкогеном кь блокирует транскрипцию гена ИЛ-6; активирует транскрипцига кластера генов рибосоыных . РНК; . блокирует синтез ядерного антигена
ПрОЛИфераЦКИ предположить, что изменение экспрессии этого "гена может приводить'к различным состояниям активированных клеток. Цель исследования: Целью работы являлось исследование закономерностей транскрипции генов фактора некроза опухолей-д , интерлейкина-8 к р53 в моноцитах переферической крови человека при их активации in vitro. Задачи работа: Г! Отработать методику выделения моноцитов из фракции мононуклеаров периферической крови человека в неактивирующих условиях на градиенте плотности Перколла. Исследовать индукцию транскрипции генов ФНО-а, ИЛ-8 и р53 в моноцитах при различных условиях инкубации in vitro. Исслздовать влияние циклогексимида на скорость транскрипции генов ФНО-а, ИЛ-8,, р53 и на .накопление зрелых мРНК этих генов моноцитами крови человека in vitro. . Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе показано, что метод разделения мононуклеаров періі?ерстбгкой крови человека на прзформированнс* градиенте плотности Пгрколла позволяет получить неактизирован5нг мопоциты крови, которые не транскрибирует гены ФНО-а, ИІ-Іа Е JW-S и не содержат зрелой мРНК ФНО-с и ИЛ-8. Полученные этим методом моноциты можно использовать в качестве модели для изучения згшномерпостег. синтеза могоюшоз в норме и патологии. Обнаружено, что- инкубация моноцитов in ritro приводит к активации транскрипции зтих гєное. На предлогенной модели проанализирована активация транскрипции ГЄНЗ ФНО-а СуспеНЗИЬЙ ИНаКТЕВИрОВаНВЖ бактерИЗС Staphylococcus aureus covan і (САК). Внло показано, что активаїткя тразекрипции гена ФНО-а происходит при участии нескольких механизмов: зависядих и независящих от биосинтеза белка в моноцитах. Определены важные временные точки активации транскрипции гена ФНО-а з моноцитах переферической крови человека при их актизацин in rizro САК. Было показано, что инкубация моноцитов in rizrc в отсутствие липополисахарвдов бактерий приводит к значительному синтезу иммунореактивного белка 101-3. Синтез ИЛ-8 ве явзддаруетск к не модулируется при активации клеток экзогенным ФНО-е. Установлено, что ген р53 транскрибируется констшугивно з ядрах как в- свежевыделенных. так и культивируемых моношотв- Активация моноцитов САК либо обработка их циклогекстщдом (ПКГ) Ее изменяет скорости транскриции этого гена в моноцитах. Активашп моноцитов САК приводит-к быстрому исчезновению мРНК р53. Получешшз данные важны для понимания механизмов участия ФНО-а и ИЛ-8 е иммунорегуляцш к иммунопатологии. Апробация диссертации. Материала работы были доложены на 8 Меадународном иммунологической конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1992). Работа была апробирована на заседании пройЕШОй комиссии "Экспериментальная гематология и биотехнология- ГВЦ РАМН 9 июня 1993г. Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах. Объем и струкцра работы. Диссертанта вклвчает введение, главы "обзор литературы", материалы и методы", "результаты", "обсувдение результатов", выводы", "щвдожєеия" . Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и список цитированной литературы из 342 наименований.