Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Глутамат и его рецепторы в патогенезерассеянного склероза (обзор литературы) 13
1.1. Эпидемиология рассеянного склероза 13
1.2. Этиология рассеянного склероза 15
1.3. Иммунопатогенез рассеянного склероза 19
1.4. Роль глуматата в патогенезе рассеянного склероза 30
1.4.1. Глутамат как нейромедиатор центральной нервной системы 30
1.4.2. Глутаматная эксайтотоксичность 34
1.4.3. Потенциальные источники и механизмы образованияизбыточного глутамата при рассеянном склерозе 35
1.5. Рецепторы глутамата и их участие в патогенезерассеянного склероза 41
1.5.1. Метаботропные рецепторы глутамата 41
1.5.2. Ионотропные рецепторы глутамата 44
1.5.3. NMDA-рецепторы глутамата 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 52
2.1.1. Объект исследования 52
2.1.2. Клиническая характеристика доноров 52
2.1.3. Перечень использованных реактивов и материалов 54
2.2. Методы исследований 56
2.2.1. Забор крови/биоматериала 56
2.2.2. Выделение лимфоцитов периферической крови 56
2.2.3. Культивирование лимфоцитов периферической крови 57
2.2.4. Количественное определение цитокинов с помощьюиммуноферментного анализа 57
2.2.5. Иммунофенотипирование лимфоцитов 58
2.2.6. Внутриклеточное иммуноцитохимическое окрашиваниецитокинов 58
2.2.7. Выделение суммарной РНК 59
2.2.8. Синтез комплиментарной ДНК (кДНК) с помощьюРНК-зависимой ДНК-полимеразы 60
2.2.9. Количественная полимеразная цепная реакция с обратнойтранскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени 61
2.2.10. Методы исследования дифференциальной экспрессии генов 64
2.2.11. Биоинформатические методы анализа 65
2.2.12. Статистическая обработка результатов исследований з
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение .
3.1. Регуляция NMDA-рецепторами продукции цитокинов Т-лимфоцитами
3.1.1. Влияние блокады NMDA-рецепторов на продукцию цитокинов Т-клетками здоровых доноров
3.1.2. Эффекты блокады NMDA-рецепторов на продукцию цитокинов Т-клетками доноров - больных рассеянным склерозом
3.2. Регуляция NMDA-рецепторами дифференцировки Т-лимфоцитов
3.2.1. Эффект (+)-МК801 на экспрессию генов транскрипционных факторов, специфичных для Т-клеточных субпопуляций, в лимфоцитах здоровых доноров и доноров - больных рассеянным склерозом
3.2.2. Влияние (+)-МК801 на соотношение CD4 и CD8 Т-клеточных субпопуляций у здоровых и доноров - больных рассеянным склерозом доноров
3.2.3. Эффект блокады NMDA-рецепторов на направление дифференцировки и баланс CD4+ Т-клеточных субпопуляций у здоровых доноров и доноров - больных рассеянным склерозом
3.2.4. Эффект блокады NMDA-рецепторов на направление дифференцировки и баланс CD8+ Т-клеточных субпопуляций у здоровых доноров и доноров - больных рассеянным склерозом
3.3. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при блокаде NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах
3.3.1. Экспрессионный профиль генов в Т-лимфоцитах здоровых доноров в условиях блокады NMDA-рецепторов
3.3.2. Экспрессионный профиль генов в Т-лимфоцитах доноров больных рассеянным склерозом в условиях блокады NMDA-рецепторов
Заключение.
Выводы.
Список литературы.
- Иммунопатогенез рассеянного склероза
- Перечень использованных реактивов и материалов
- Эффекты блокады NMDA-рецепторов на продукцию цитокинов Т-клетками доноров - больных рассеянным склерозом
- Экспрессионный профиль генов в Т-лимфоцитах здоровых доноров в условиях блокады NMDA-рецепторов
Введение к работе
Актуальность темы. Рассеянный склероз (PC) - широко распространенное
хроническое прогрессирующее аутоиммунное демиелинизирующее
нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), поражающее преимущественно лиц молодого трудоспособного возраста и неизбежно ведущее к инвалидизации (Столяров и др., 2008; Шмидт и др., 2012).
Существующие на сегодняшний день знания о PC позволяют рассматривать его патогенез как сложный многокомпонентный процесс, ведущую роль в котором играют аутоиммунные механизмы (Гусев и др., 2011). Установлено, что возможными причинами срыва иммунологической толерантности и развития аутоиммунной реактивности при PC являются нарушение функций, дифференцировки, а также изменение субпопуляционного баланса эффекторных CD4 Т-лимфоцитов (Kuchroo et al., 2012; Raphael et al., 2014). Интенсивно изучается функциональная значимость в инициации, формировании, прогрессии и ремиссии PC IL-17-продуцирующих CD4 Т-клеток (Brucklacher-Waldert et al., 2009; Jadidi-Niaragh et al., 2011; Huber et al., 2013). Особое внимание также уделяется определению роли эффекторных субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов (Saxena et al., 2011; Gravano et al., 2013). Кроме того, большое значение в формировании патологического процесса в мозге при PC имеет избыточная продукция провоспалительных цитокинов, сопровождающаяся снижением синтеза противовоспалительных цитокинов (Hollifield et al., 2003; Mikulkova et al., 2010; Kallaur et al, 2013).
Помимо аутоиммунных механизмов, значительная роль в разрушении миелина, гибели нейронов и, особенно, олигодендроцитов отводится нейромедиатору ЦНС глутамату, который образуется в больших количествах в мозге при PC (Pitt et al., 2000; Werner et al., 2000; Mature et al., 2001). Имеющиеся литературные данные свидетельствуют об участии глутамата в механизмах нейровоспаления, осуществляемом, в том числе за счет регуляции функций как поступивших в мозг аутореактивных Т-клеток, так и периферических Т-лимфоцитов (Schori et al., 2001). По данным ряда авторов, антагонисты NMDA-рецепторов мемантин и (+)-МК801 снижают выраженность неврологических нарушений у животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом, уменьшая воспаление в ЦНС вследствие ограничения проницаемости гемато-энцефалического барьера для цитокинов и Т-лимфоцитов, не препятствуя при этом развитию демиелинизации (Paul et al., 2002; Abdurasulova et al., 2004).
К настоящему времени доказана экспрессия ионотропных рецепторов глутамата (NMDA и АМРА подтипов) на поверхности Т-клеток человека, а также
установлена их роль в регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток, таких как пролиферация и апоптоз, а также секреция цитокинов и дифференцировка субпопуляций CD4 Т-лимфоцитов (Зайнуллина и др., 2011; Ganor et al., 2012). Важно отметить, что на настоящий момент в доступной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению роли глутаматных рецепторов NMDA подтипа, экспрессированных на клетках иммунной системы, в функционировании Т-лимфоцитов больных с рассеянным склерозом.
Цель исследования - изучение роли NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-лимфоцитов у больных рассеянным склерозом.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию продукции про- и
противовоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами, полученных от здоровых
лиц и больных рассеянным склерозом;
2. Охарактеризовать влияние NMDA-рецепторов на содержание CD4+ и СТЖ
популяций Т-лимфоцитов и их соотношение у здоровых лиц и больных
рассеянным склерозом;
-
Исследовать роль NMDA-рецепторов в регуляции дифференцировки эффекторных субпопуляций CD4 Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;
-
Оценить участие NMDA-рецепторов в регуляции дифференцировки эффекторных субпопуляций CD8 Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных рассеянным склерозом;
-
Установить спектр генов, дифференциально регулируемых NMDA-рецепторами, в Т-клетках здоровых лиц и больных рассеянным склерозом.
Научная новизна. В проведенном исследовании впервые получены данные о роли NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов в иммунопатогенезе PC. Выявлены особенности регуляции NMDA-рецепторами функций Т-клеток при PC. Охарактеризовано влияние NMDA-рецепторов на секрецию и синтез Т-лимфоцитами, полученными от больных PC доноров, провоспалительных (IFNy, TNFa) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов, а также обладающего плейотропным действием IL-6. Показано, что уменьшение секреции цитокинов при блокаде NMDA-рецепторов селективным антагонистом (+)-МК801 связано с ингибированием экспрессии генов
соответствующих белков. По сравнению со здоровыми донорами, у больных PC данный негативный эффект блокады типа рецепторов менее выражен.
Показано, что блокада NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов антагонистом не сопровождается изменением относительного количества CD4 и CD8 Т-лимфоцитов и их соотношения у пациентов с PC и здоровых лиц.
Установлена вовлеченность глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляцию дифференцировки и поддержание баланса эффекторных субпопуляций CD4 и CD8 Т-лимфоцитов при PC. Впервые показано ингибирующее действие (+)-МК801 на экспрессию цитокинов (IL-4, IL-17, IFNy) и генов транскрипционных факторов (ТВХ21, GATA3, RORyt, FOXP3) при PC. Отмечено, что различные субпопуляции CD4 и CD8 Т-клеток обладают разной чувствительностью к блокаде NMDA-рецепторов. Так, у больных PC по сравнению со здоровыми лицами эффект блокады NMDA-рецепторов был менее выражен в отношении ТЫ и Tel клеток и более - в отношении Thl7 и Тс 17 лимфоцитов. Выявлено, что блокада рецепторов (+)-МК801 приводит к смещению субпопуляционного баланса CD4 и CD8 Т-лимфоцитов в сторону клеток 1 типа (ТЫ и Тсі) в большей степени выраженному у больных PC.
Идентифицированы паттерны генов, регулируемые NMDA-рецепторами у здоровых лиц и пациентов с PC. Определены биологические процессы, в регуляцию которых могут быть вовлечены NMDA-рецепторы Т-лимфоцитов при PC. Установлено ингибирующее влияние (+)-МК801 на экспрессию важных с точки зрения патогенеза PC генов (CCL20,1Ь-8и др.).
Научно-практическая значимость работы. Выполненная работа имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Полученные новые экспериментальные данные расширяют и углубляют представления о роли глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляции функции Т-клеток и в развитии иммунопатологических процессов при PC. Результаты проведенных экспериментов раскрывают возможные механизмы, посредством которых реализуются иммуномодулирующие функции NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов, и позволяют рассматривать данные рецепторы в качестве новой мишени для фармакотерапевтической коррекции PC и, возможно, других аутоиммунных демиелинизирующих заболеваний.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2013), VI Российском Симпозиуме «Белки и пептиды»
(Уфа, 2013), 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013), VII Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Аутоиммунные заболевания нервной системы» - единство и многообразие» (Новосибирск, 2015), XX Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе, 2 статьи в журнале из перечня ВАК.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантом РФФИ № 15-04-01441 и грантом Президента РФ для ведущих научных школ НШ-5923.2014.4.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы (глава 1), описание материалов и методов исследования (глава 2), результаты исследования и их обсуждение (глава 3), заключение, выводы. Список цитированной литературы включает 559 наименования, в том числе 46 работ отечественных и 506 работ иностранных авторов. Работа изложена на 204 страницах машинописного текста и иллюстрирована 15 таблицами, 13 рисунками. Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной иммунологии и фармакологии ИБГ УНЦ РАН за ценные советы в период подготовки к защите диссертационной работы.
Иммунопатогенез рассеянного склероза
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в области изучения патогенеза и клиники рассеянного склероза, четкого понимания этиологии PC до сих пор не существует. Наиболее распространенной является гипотеза о том, что PC - мультифакториальное заболевание, в инициировании и развитии которого критическую роль играет взаимодействие генетических и средовых факторов (Ишманова, 2003; Спирин и др., 2003; Sospedra et al., 2005; Ebers, 2008; Столяров и др., 2008; Шмидт и др., 2012).
Существование наследственной предрасположенности к этому заболеванию было выявлено в результате эпидемиологических, популяционных и близнецовых исследований. Описаны семейные случаи PC, составляющие в разных популяциях 5 - 7 % от общего числа больных. Достоверно установлено увеличение риска развития PC у родственников больного (Barcellos et al, 2002; Wilier et al, 2003; Ebers et al, 2004). Конкордантность PC составляет 31 % среди монозиготных близнецов, что в 6 раз выше частоты заболевания среди дизиготных близнецов (5 %) (Sadovnick et al, 1993; Zuvich et al, 2009).
Большинство работ, посвященных изучению генетических факторов PC, указывают на то, что заболевание развивается вследствие независимого действия, либо взаимодействия множества генов, каждый из которых вносит небольшой вклад в развитие болезни (Dyment et al., 2004; Forte et al., 2006; Столяров и др., 2008; Zuvich et al., 2009). На данный момент насчитывается более 100 потенциальных «генов-кандидатов», чье участие изучается в патогенезе PC (Гусев и др., 2011). К ним относятся: гены главного комплекса гистосовместимости человека (ГКГС/HLA), гены цитокинов и их рецепторов (JL-10, IL-lra, IL-lb, IL-4, TNF, TGFB1, IL7RA, IL2RA), гены хемокинов и их рецепторов (CCR5, RANTES), гены костимулирующих молекул и рецепторов лимфоцитов (CTLA4, CD24), гены молекул, участвующих в адгезии (ICAM-1, CD58, CD6), гены Т-клеточного рецептора (TCRbeta), гены компонентов миелиновой оболочки аксона (MOG, МБР), иммуноглобулинов и белков системы комплемента (Bomprezzi et al., 2003; GAMES, 2003; Baranzini et al., 2009; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, 2013). Сравнительно недавно было высказано предполоние, что мутации и некоторые полиморфные варианты генов митохондриальной ДНК также могут участвовать в формировании предрасположенности к PC (Mihailova et al., 2007).
Одной из доказанных на сегодняшний день генетических детерминант PC являются гены главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), расположенные на 6-й хромосоме (Dyment et al., 2005; Hafler et al., 2007; Шмидт и др., 2012). Система ГКГС играет важнейшую роль в распознавании чужеродных антигенов Т-лимфоцитами и развитии иммунного ответа. Ассоциация с PC определена для разных аллелей генов (области DR, DP или DQ) ГКГС класса II (Barcellos et al., 2003, 2006; Yeo et al., 2007; Chao et al, 2008).
На предрасположенность к данной патологии могут также оказывать влияние гены, кодирующие рецептор витамина D (VDR), остеопонтин (OPN) и аполипопротеин Е (АРОЕ) (Chabas et al., 2001; Burwick et al., 2006; Бабенко и др., 2009). Аполипопротеин Е (АроЕ) участвует в регенерации аксонов и миелина в центральной и периферической нервной системах. Было показано, что АроЕ также участвует в презентации молекулами CD1 сывороточных липидных антигенов специфическим Т-клеткам. При исследовании PC была выявлена корреляция между аллелями гена, кодирующего АроЕ, и тяжестью заболевания. Так, аллель эпсилон-4 (АроЕє4) был ассоциирован с тяжелым течением PC, а аллель эпсилон-2 (АроЕє2) - с более благоприятным исходом (Burwick et al., 2006). Таким образом, генетические факторы не только влияют на риск возникновения, но и могут обуславливать особенности течения заболевания, тем самым, формируя разнообразие клинических форм патологии.
Дополнительным подтверждением этого являются результаты исследования экспрессионного профиля генов в тканях мозга (Graumann et al., 2003; Dutta et al., 2012) и в мононуклеарных клетках периферической крови больных PC (Bomprezzi et al., 2003). Благодаря использованию метода транскрипционного профилирования были выявлены не только группы генов, специфичные для PC, но и паттерны генов, изменяющие свою экспрессию в зависимости от стадии заболевания (Achiron et al., 2004; Brynedal et al., 2007) и принимаемой терапии (Singh et al., 2007; Sellebjerg et al., 2008; Данилова и др., 2014). Среди дифференциально экспрессирующихся генов обнаружены гены врожденного и адаптивного иммунитета, клеточного цикла, передачи сигнала, систем воспаления, окислительного стресса, апоптоза, транскрипции, трансляции, деградации и др. (Tajouri et al., 2007). Ряд авторов подчеркивает необходимость изучения изменений в работе тех или иных генов в мононуклеарах периферической крови больных PC. Было показано, что они отражают интенсивность течения патологии (Brynedal et al., 2007) и могут служить в качестве прогностических маркеров и, возможно, терапевтических мишеней (Achiron et al., 2004; Brynedal et al., 2007).
Реализации наследственной предрасположенности к PC, безусловно, способствуют внешние факторы. Наиболее значимыми среди них являются географические факторы (инсоляция), вирусные и бактеральные инфекции, стресс, некоторые интоксикации и особенности диеты (Завалишин и др., 2003; Спирин и др., 2003; Compston et al, 2008).
Нарушения в обмене витамина D, мелатонина и витамина А, как отмечается в ряде исследований, повышают риск развития PC в зависимости от степени инсоляции (Holick, 2004). Кроме того, доказана роль этого витамина в иммунорегуляции, в частности при аутоиммунных заболеваниях (Adorini et al., 2008; Kamen et al., 2010). В условиях ЭАЭ недостаток витамина D у модельных животных значительно усиливал патологические проявления. Установлено, что у больных витамин D влияет на активность регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), участвующих в иммунопатогенезе PC (Ascherio et al, 2010; Simon et al, 2012).
В качестве инфекционной причины PC рассматриваются некоторые вирусные и бактериальные патогены (Sospedra et al., 2005; Гусев и др., 2011). Известно, что некоторые вирусы способны напрямую повреждать олигодендроциты и миелин, запускать аутоиммунные реакции по механизмам молекулярной мимикрии, вызывать поликлональную активацию иммунокомпетентных клеток (Т-клетки, В-клетки, макрофаги, микроглия, дендритные клетки и т.д.), а также модулировать уровень экспрессии молекул представления антигена, действовать как суперантигены и т.д. (Ascherio et al, 2007; Compston et al., 2008).
В последние годы особое внимание уделяется изучению роли вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в инициации PC. В тоже время существуют исследования, демонстрирующие участие в развитии PC и других вирусных патогенов, таких как ретровирусы, вирус герпеса, вирус гриппа, вирус ветряной оспы, TTV (Torque Teno virus). Однако эти сведения требуют дальнейшего изучения (Ломакин, 2014).
Наблюдается положительная корреляция между риском возникновения заболевания и длительными контактами с органическими растворителями или продуктами переработки бензина. Люди, проживавшие в детстве в непосредственной близости от металлургических или нефтеперерабатывающих заводов, более подвержены развитию PC (Ebers, 2008).
Перечень использованных реактивов и материалов
Лимфоциты выделяли из периферической венозной крови больных PC и условно-здоровых доноров-добровольцев. Процедуру выделения лимфоцитов проводили не позднее 2 часов с момента забора крови. Все работы проводили в стерильном ламинарном боксе. Выделение фракции мононуклеаров проводили по стандартной методике центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1.077 г/см ) (Воушп, 1968). Моноцитарную фракцию элиминировали адгезией в 12-луночных планшетах в течение 24 ч при 37 в атмосфере 5 % СОг. Содержание фракции нелейкоцитарных клеток контролировали по параметрам бокового светорассеяния (SS) и флуоресценции конъюгированных антител CD45-ECD методом проточной цитофлуорометрии. Представленность данной фракции клеток не превышала 5.0 ±2.0%.
Выделенные лимфоциты отмывали дважды (10 мин, 400 g) 1 х PBS, затем инкубировали в 48-луночных планшетах («SPL Lifesciences», США) (37С, 5 % С02) в полной среде культивирования RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 х Ю" М Z-глутамин и 50 мкг/мл гентамицина сульфата. Концентрация клеток в культуре составляла 1-2 х 106кл/мл. В работе использовали следующие методы стимуляции Т-клеток in vitro: - инкубация лимфоцитов с моноклональными антителами (МКА) к CD3 (aCD3 МКА, клон ОКТЗ, 2.5-5 мкг/мл) и к CD28 (aCD28 МКА, клон 37.51, 1.25-2.5 мкг/мл), воспроизводящая физиологический путь активации через Т-клеточный рецептор (TCR); - добавление в культуру клеток активатора протеинкиназы С 4-форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА, 25 нг/мл) и кальциевого ионофора иономицина (1 мкг/мл) (рецепторно-независимая стимуляция). Для изучения роли NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-клеток данный вид рецепторов блокировали их неконкурентным антагонистом (+)-МК801 (дизоцилпин, (5S,10R)-(+)-5-Memii-10,l 1-дигидро-5Н-дибензо [а, с1]циклогептен-5,10-имин) в концентрации 10 4 М. (+)-МК801 является канальным блокатором, который связывается с GluNl -субъединицей при активации NMDA-рецепторов (Coan et al., 1987).
Количественное определение цитокинов проводили с помощью коммерческих наборов для твердофазного иммуноферментного анализа «ИФА-1Ь6», «ИФА-1Ы0», «ИФАNFa», «ИФА-INFy» (Цитокин, Россия). В качестве проб использовали супернатант культуры лимфоцитов, полученный после 24 - 48 часов антигенной стимуляции с одновременной блокадой NMDA-рецепторов. Концентрацию цитокинов (пг/мл) в пробах рассчитывали на основании калибровочной кривой стандартов, прилагающихся к наборам. Измерение оптической плотности образцов проводилось с помощью мультипланшетного анализатора «EnSpire Multimode Plate Readers» (Perkin Elmer, США) при 450 нм и референсной длине волны 650 нм.
Фенотипирование лимфоцитов осуществляли путем окрашивания клеток моноклональными антителами к поверхностным CD-маркерам лимфоцитов - CD4 и CD8, конъюгированными с флуоресцентными красителями - фикоэритрином (РЕ) и комплексом фикоэритрина и цианина (РЕ-Су5), соответственно. Окрашивание лимфоцитов антителами выполняли по следующей схеме: к 100 мкл клеточной суспензии (1-2 х Ю6 клеток) добавляли раствор антител (конечная концентрация 1.25 мкг/мл), инкубировали 20 мин при комнатной температуре, в темноте, затем дважды отмывали 1 х PBS. Флуоресценцию регистрировали на проточном цитофлуориметре «Cytomics FC 500» (Beckman Coulter, США). В каждом измерении регистрировали 30000 событий. Последующую обработку данных проводили в программе «FCS Express 4.0» (De Novo Software, Канада).
Для определения внутриклеточного уровня цитокинов IFNy, IL-4, IL-17A и TGFpi суспензию лимфоцитов (2 х Ю6 кл/мл) окрашивали как описано выше (см. 2.2.5), затем фиксировали 1 %-ным параформальдегидом 10 мин при температуре 37 С, пермеабилизовали 90 %-ным этанолом 30 мин при 4 С. Блокировку неспецифических сайтов связывания AT проводили 0.5 %-ным БСА в 1 х PBS в течение 10 мин. Далее лимфоциты инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте с МКА к IFNy-FITC, IL-4-Alexa Fluor 488, IL-17A-FITC, TGFpi-CFS (табл. 2). В качестве отрицательного контроля использовали изотипические антитела, рекомендованные производителем (табл. 2). Клетки отмывали 0.5 %-ным БСА віх PBS и ресуспендировали в 1 х PBS.
Интенсивность флуоресценции детектировали с помощью проточного цитофлуориметра «Cytomics FC 500» (Beckman Coulter, США). В координатах малого углового (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния выделяли область лимфоцитов и анализировали популяции CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов с одновременной детекцией одного из исследуемых цитокинов. В каждом образце анализировали 30000 событий. Определение количества цитокин-продуцирующих CD4+ или CD8+ Т-клеток проводили в программе «FCS Express 4.0» (De Novo Software, Канада).
Суммарную РНК выделяли из 2-5 х ю6 Т-клеток с использованием TRI Reagent (MRC, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Для этого клетки центрифугировали 5 мин. при 400g , затем удаляли супернатант и к осадку добавляли экстрагирующий раствор TRI Reagent. Соотношение количества клеток к объему экстрагента во всех экспериментах составляло 5 х ю6 клеток на 1 мл. Последующие выделение и очистку проводили с помощью коммерческого набора «Direct-zol RNA MiniPrep Kit». Количество и качество выделенных препаратов РНК контролировали с помощью спектрофотометра NanoDrop 3000 (Thermo Scientific, США), а также электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл бромида этидия. В использованных образцах РНК соотношение оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм (А2бо/А28о) находилось в пределах 1.9-2.1.
Выделенная по данному протоколу РНК далее использовалась в реакции построения первой цепи кДНК для количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
кДНК получали из 0.5-2 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием 0.5 мкг oligo(dT)12-18-npafiMepoB или «случайных» праймеров (наномеры) и 40 ед. акт. обратной транскриптазы RevertAid Reverse Transcriptase в 20 мкл 250 мМ Tris-HCI буфера рН 8.3, содержащего 250 М КС1, 20 мМ MgCl2, 50 мМ ДТТ, 10 мМ каждого dNTP и 20 ед. RNAsin. Реакцию проводили в течение 1 ч при 42 С.
Для оценки эффективности построения кДНК проводили ПЦР с праймерами к 3 - и 5 - концам мРНК актина (табл. 4). Реакцию амплификации отдельных фрагментов гена актина проводили в 50 мкл 1М трис-НСІ буфера (рН 8.6), содержащего 250 мМ КС1, 20 мМ MgCl2, ЮмМ MgS04, 1% Тритон-ХЮО, 15 нг кДНК, ЮмМ каждого dNTP, по 200 нМ прямого и обратного праймеров, 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Продукты амплификации анализировали в 1.5 %-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл бромида этидия. Наличие соответствующих полос в агарозном геле подтверждало эффективность реакции обратной транскрипции и нативность мРНК. Полученную кДНК использовали для дальнейшего проведения количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Эффекты блокады NMDA-рецепторов на продукцию цитокинов Т-клетками доноров - больных рассеянным склерозом
Эффект блокады NMDA-рецепторов на баланс субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов (Тс). Данные представлены в виде Me (10%—90%). - р 0.05; - р 0.01 относительно группы «ФМА/ионо»; Суммируя полученные данные, можно заключить, что смещение баланса субпопуляций Тс-клеток при блокаде NMDA-рецепторов вызвано, прежде всего, менее выраженным ингибирующим действием (+)-МК801 на внутриклеточную продукцию IFNy, которое сочетается со значительным подавлением синтеза IL-17 CD8+ Т-лимфоцитами. Негативный эффект блокады глутаматных рецепторов данного типа на цитокин-продуцирующую активность CD8+ Т-лимфоцитов в большей степени выражен у больных PC, по сравнению со здоровыми лицами. Обнаруженное существенное негативное влияние NMDA-рецепторов на синтез IL-17 и, как следствие, на долю Тс 17 клеток представляет особый интерес, так как считается, что данные клетки совместно с ТЫ 7 участвуют в первичном проникновении аутореактивных Т-клеток в ЦНС и прогрессировании PC (Saxena et al., 2011).
Сопоставление данных о влиянии антагониста NMDA-рецепторов на секрецию исследуемых цитокинов в CD4+ и CD8+ лимфоцитах показало, что в цитотоксических клетках (Тс) синтез IFNy, IL-4 и IL-17 снижен в большей степени, чем в хелперной субпопуляции (Th).
В совокупности результаты проведенного исследования, представленные в главе 3.2, демонстрируют, что у здоровых индивидуумов и у больных PC антагонист NMDA-рецепторов (+)-МК801 оказывает ингибирующее действие на дифференцировку CD4+ и CD8+ эффекторных Т-лимфоцитов и продукцию ими цитокинов (IFNy, IL-4, IL-17) посредством дифференциальной модуляции экспрессии генов транскрипционных факторов (ТВХ21, GATA3, RORyt), контролирующих синтез про- и противовоспалительных цитокинов. При этом выраженность негативного эффекта блокады рецепторов в отношении экспрессии ТФ и цитокинов отличается в разных субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-клеток, что приводит к смещению направления дифференцировки Т-лимфоцитов в сторону «провоспалительных» Т- клеток 1 типа (ТЫ и Тсі), в большей степени у больных PC, стимулируя клеточно-опосредованный иммунный ответ. В настоящее время иммунным реакциям, опосредованным Т-клетками 1 типа, отводится ключевая роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, в том числе PC (Raphael et al., 2014). Считается, что это связано, прежде всего, с продукцией ТЫ и Tel лимфоцитами мощного провоспалительного цитокина IFNy, который индуцирует активацию макрофагов и секрецию ряда хемокинов, а также усиливает экспрессию Толл-подобных рецепторов на иммунных клетках и молекул главного комплекса гистосовместимости I и II класса и т. д. При исследовании патогенетических Т-клеток, сенситизированных к основному белку миелина, было обнаружено, что данные клетки синтезируют преимущественно провоспалительные IFNy и TNF, а не противовоспалительный цитокин IL-4 (Voskuhl et al., 1993). Патогенетическая роль Т-клеток 1 типа и IFNy была подтверждена исследованиями ЭАЭ. Olsson и соавторы (1992) показали, что аутореактивные миелин-специфичные Т клетки при ЭАЭ продуцируют значительное количество IFNy (Olsson et al., 1992). Адоптивный перенос миелин-специфичных Thl типа приводит к развитию ЭАЭ (Ando et al., 1989). Блокада ключевого транскрипционного фактора ТЫ лимфоцитов - ТВХ21, сопровождается резистентностью животных к развитию ЭАЭ (Ji et al., 2011). Таким образом, блокада NMDA-рецепторов (+)-МК801 может привести к еще большему дисбалансу между субпопуляциями Т-клеток и усилить иммунопатологические процессы при PC, однако данное предположение требует дальнейших исследований.
Обращает на себя внимание тот факт, что у больных PC блокада NMDA-рецепторов смещала направление дифференцировки Т-лимфоцитов в сторону Т-клеток 1 типа (ТЫ и Tel) сильнее, чем у здоровых лиц, несмотря на то, что они принимали препараты интерферона Р-1а и глатирамера ацетата. Известно, что эти препараты относятся к иммуномодулирующим препаратам первой линии и способны изменять течение PC (предотвращение обострений, стабилизация состояния, предупреждение перехода заболевания в более тяжелую форму) (Завалишин и др., 2007). Иммунологическими эффектами интерферона Р-1а являются подавление пролиферации и активации иммунных клеток, ингибирование продукции провоспалительных цитокинов и изменение цитокинового баланса в сторону противовоспалительного фенотипа, а также предотвращение инфильтрации аутореактивных Т-лимфоцитов в ЦНС путем влияния на молекулы адгезии, хемокинов и металлопротеиназ (Johnson et al., 2001). Механизм действия глатирамера ацетата заключается в конкурентном с основным белком миелина связывании с молекулой главного комплекса гистосовместимости II класса, активацией Т-лимфоцитов 2 типа и усиление продукции противовоспалительных цитокинов, что обусловливает угнетение аутоиммунных реакций при PC (Panitch et al., 2001). Одним из возможных объяснений наблюдаемых различий в эффектах блокады NMDA-рецепторов на Т-лимфоциты (их дифференцировку, продукцию цитокинов) у здоровых доноров и больных PC доноров может являться молекулярный механизм действия (+)-МК801, который, возможно, задействует иные компоненты сигнальных путей, чем интерферон Р-1а и глатирамера ацетат, из-за чего данные препараты неспособны предотвращать эффекты, опосредованные блокадой NMDA-рецепторов (+)-МК801. Можно также предположить, что в процессе экспериментальной пробоподготовки Т-лимфоцитов пациентов с PC эффект интерферона Р-1а и глатирамера ацетата нивелируется. Известно, что применение описанных лекарств требует их постоянного присутствия в крови больного (инъекции 1 раз в день или неделю), а в наших экспериментальных условиях клетки были отмыты 1 х PBS и инкубировались в среде культивирования в отсутствии интерферона Р-1а и глатирамера ацетата.
Экспрессионный профиль генов в Т-лимфоцитах здоровых доноров в условиях блокады NMDA-рецепторов
Таким образом, согласно полученным данным, NMDA-рецепторы участвуют в поддержании субпопуляционного баланса, регуляции процесса дифференцировки, пролиферации, апоптоза и эффекторных функций (продукция цитокинов) Т-лимфоцитов. Выявленные особенности регуляции NMDA-рецепторами функций Т-клеток, полученных из крови больных PC, указывают на важность данного типа рецепторов в иммунопатогенезе PC, что позволяет рассматривать данный подтип глутаматных рецепторов в качестве потенциальной мишени для разработки новых средств коррекции аутоиммунного процесса при данной патологии.
Принимая во внимание литературные и полученные нами ранее данные (Зайнуллина и др., 2011), возможным молекулярным механизмом реализации столь широкого спектра функций NMDA-рецепторов в Т-клетках, по нашему мнению, является участие данного типа глутаматных рецепторов в механизмах кальциевой сигнализации. Отметим, что, как известно, субъединицы NMDA-рецептора формируют канал, селективный и высокопроницаемый для Са . (+)-МК801, в свою очередь, является эффективным блокатором данного канала и, таким образом, подавляет ток Са2+. В пользу данного предположения свидетельствуют появившиеся в последние годы работы, в которых показано, что глутамат и его синтетические аналоги - селективные агонисты ионотропных и метаботропных рецепторов стимулируют повышение содержания Са2+ при митогенной стимуляции Т-клеток, а антагонисты блокируют данный процесс (Lombardi et al, 2001; Boldyrev et al., 2004; Pacheco et al, 2004; Miglio et al., 2005; Mashkina et al., 2007). Некоторыми исследователями выдвинуты предположения, что NMDA-рецепторы принимают участие в обеспечении депо - управляемого входа (SOCE) (store-operated channel entry) кальция в Т-лимфоциты (Зайнуллина, 2013).
Известно, что кальциевая сигнализация является существенным компонентом регуляции всех внутриклеточных процессов в Т-лимфоцитах. Показано, что 75 % генов в Т-клетках, экспрессия которых запускается после активации, являются Са -зависимыми (Feske et al., 2001). Повышение внутриклеточного кальция наблюдается при активации Т-клеток и запускает различные транскрипционные программы, ведущие, в том числе, к секреции цитокинов и терминальной дифференцировке Т- лимфоцитов.
Следует отметить, что профиль кальциевого сигнала (амплитуда и продолжительность повышения уровня Са ) определяет специфичность иммунного ответа, приводя к активации определенных сигнальных каскадов, транскрипционных факторов, дифференциальной экспрессии групп генов (Lewis, 2001). В частности было показано, что транскрипционный фактор NF-кВ активируется при непродолжительных и сильных повышениях концентрации кальция, тогда как небольшие и длительные повышения уровня кальция приводят к активации ТФ NFAT (Dolmetsch et al., 1997). Известно, что NF-kB и NFAT регулируют транскрипцию многочисленных генов, ответственных за развитие, активацию, дифференциацию Т-лимфоцитов, а также индукцию и поддержание Т-клеточной толерантности (Hogan et al., 2003; Macian, 2005; Rudensky et al, 2006; Sundrud et al, 2007). Недавно было показано, что NFAT оказывает свое влияние на данные процессы путем транскрипционной регуляции ТФ, специфичных для субпопуляций Т-лимфоцитов, в частности, T-bet (ТВХ21), GAT A3, RORyt и FOXP3. Кроме того, семейство NFAT регулирует транскрипцию ряда ключевых цитокинов (IFNy, IL-4, IL-17), а также их рецепторов (Hermann-Kleiter et al., 2010). Считается, что основным стимулятором для ТФ NF-kB является РКС, а активация NFAT требует мобилизации внутриклеточного Са (Isakov et al., 2002; Hermann-Kleiter et al, 2010). Noble А. и соавторы (2000) продемонстрировали зависимость направления дифференцировки Т-клеток от баланса между активностью РКС и уровнем кальциевого сигнала (Noble et al., 2000). Согласно полученным исследователями данным, сильный кальциевый сигнал и слабая стимуляция РКС приводили к формированию пула ТЫ клеток, а при иных экспериментальных условиях (слабый кальциевый стимул и сильная активация РКС) формировались, в основном, Th2 клетки. Сходные результаты были получены на Tel и Тс2 клетках.
Кроме того, в исследованиях по изучению роли кальция в различных путях развития лимфоцитов показано, что регуляция уровня внутриклеточного кальция (кальциевый профиль) в состоянии покоя и при активации отличается в разных эффекторных субпопуляциях Т-лимфоцитов (Robert et al., 2013). Так, базальный уровень кальция в покоящихся Th2 клетках выше, чем в ТЫ и ТЫ7 (Fanger et al., 2000). После активации уровень внутриклеточного кальция повышается, однако, в Th2 лимфоцитах в меньшей степени по сравнению с ТЫ и даже ТЫ7 клетками (Weber et al., 2008). Следовательно, регуляция кальциевого сигнала зависит от типа Т-клеток.
Таким образом, в совокупности данные литературы и полученные нами результаты позволяют полагать, что обнаруженное общее ингибирующее действие (+)-МК801 на функции Т-лимфоцитов может быть обусловлено участием NMDA-рецепторов в регуляции кальциевого гомеостаза (кальциевой сигнализации) в данном типе клеток. Селективное влияние блокады NMDA-рецепторов на различные субпопуляции Т-клеток и их функции и формирование, возможно, является следствием разной чувствительности к кальциевому сигналу различных компонентов сигнальных путей, участвующих в процессе дифференциации Т-лимфоцитов, а также особенностями регуляции кальциевой сигнализации в Т-клеточных субпопуляциях. В исследованиях последних лет приводятся данные, свидетельствующие о том, что одной из причин развития аутоиммунного процесса при PC может быть дисрегуляция кальциевого гомеостаза (Izquierdo et al., 2014), что, как мы предполагаем, отражается в выявленных особенностях ответа на блокаду NMDA-рецепторов Т-клеток, полученных от больных PC.
Подводя итог, важно подчеркнуть, что полученные нами сведения способствуют углублению знаний о патогенетических механизмах развития и прогрессирования PC и позволяют определить роль NMDA-рецепторов в данных процессах при PC. Кроме того, результаты проведенного исследования свидетельствуют о возможности использования данного подтипа глутаматных рецепторов в качестве мишени для создания новых средств для лечения PC.