Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Роль ЛПНП и воспаления в патогенезе атеросклероза 8
2.2. Сигнальные каскады ЛПНП в патогенезе атеросклероза 11
2.3. Роль воспаления в патогенезе атеросклероза 15
2.4. Роль ЛПВП в регрессии атеросклеротической бляшки 17
2.5. Противовоспалительные свойства ЛПВП 22
2.6. Роль аполипопротеина A-I в регуляции липидного обмена и воспаления 25
2.7. Сигнальные каскады, активируемые инсулином 29
2.8. Транскрипционный фактор FOXO1 32
2.9. Ядерные рецепторы семейства LXR 35
2.10. Регуляция экспрессии гена apoA-I 39
3. Материалы и методы 44
3.1. Ингибиторы сигнальных киназ, синтетические лиганды ядерных рецепторов и рекомбинантные белки 44
3.2. Антитела 44
3.3. Генетические конструкции 44
3.4. Сайт-направленный мутагенез 45
3.5. Клеточные культуры и трансфекция 45
3.6. -галактозидазный и люциферазный тесты 46
3.7. Обратная транскрипция (ОТ) 46
3.8. Полимеразная цепная реакция в реальном времени – RealTime-PCR 46
3.9. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) 3.10. Иммуноферментный анализ (ELISA) 49
3.11. Иммуноблоттинг 50
3.12. Получение ядерных экстрактов, ДНК-аффинная хроматография 50
3.13. Иммунопреципитация 51
3.14. Иммуноцитохимия 51
3.15. Статистический анализ 51
4. Результаты 52
4.1. Перекись водорода подавляет экспрессию гена apoA-I 52
4.2. Транскрипционные факторы LXR и FOXO1 участвуют в уменьшении уровня мРНК apoA-I при оксидативном стрессе 54
4.3. FOXO1 связывается с сайтом B гепатоцитарного энхансера 55
4.4. AMPK подавляет активность гена apoA-I 56
4.5. Сайты B и C гепатоцитарного энхансера необходимы для подавления активности гена apoA-I при оксидативном стрессе 58
4.6. Инсулин регулирует экспрессию гена apoA-I 59
4.7. Инсулин модулирует активность гена apoA-I через различные участки 5` регуляторной области 61
4.8. Участие различных сигнальных каскадов в подавлении активности гена apoA-I
инсулином 63
4.9. NF-B и HNF4 участвуют в подавлении активности гена apoA-I инсулином через сайт
А гепатоцитарного энхансара 65
4.10. Ядерные рецепторы LXRs участвуют в подавлении активности гена apoA-I инсулином 66
4.11. FOXO1 и FOXA2 участвуют регуляции экспрессии гена apoA-I инсулином 69
4.12. Сайт B гепатоцитарного энхансера участвует в подавлении экспрессии гена apoA-I инсулином 72
4.13. Транскрипционные факторы FOXO1 и LXR, а также FOXA2 и LXR взаимодействуют в клетках HepG2 73
4.14. LXRs и FOXO1 связываются с сайтами B и C гепатоцитарного энхансера 74
4.15. Инсулин уменьшает связывание FOXO1 с гепатоцитарным энхансером 76
4.16. TO901317 защищает комплекс FOXO1/LXR от инсулин-зависимого экспорта из
ядра 77
4.17. FOXO1 и LXR возвращаются на гепатоцитарный энхансер после 48-часовой инкубации с инсулином 78
4.18. Комплекс транскрипционных факторов FOXO1/LXR необходим для подавления
экспрессии гена apoA-I цитокином TNF 79
4.19. Инсулин усиливает активность проксимального промотора гена apoA-I 80
4.20. Инсулин влияет на экспрессию генов транскрипционных факторов
5. Обсуждение результатов 83
6. Заключение 95
7. Выводы 96
8. Список сокращений 97
9. Список цитируемой литературы 101
- Сигнальные каскады ЛПНП в патогенезе атеросклероза
- Генетические конструкции
- Ядерные рецепторы LXRs участвуют в подавлении активности гена apoA-I инсулином
- FOXO1 и LXR возвращаются на гепатоцитарный энхансер после 48-часовой инкубации с инсулином
Введение к работе
Актуальность проблемы. Аполипопротеин A-I (apoA-I) является ключевым участником липидного обмена. В качестве основного белка липопротеидов высокой плотности, apoA-I выполняет функции как акцептора холестерина и фосфолипидов в периферических тканях, так и антивоспалительного и антитромбического агента. Многочисленные фундаментальные и клинические исследования подтверждают ключевую роль apoA-I в защите от развития атеросклероза. Основная часть apoA-I плазмы крови синтезируется в клетках печени и тонкой кишки. Именно продукция apoA-I этими клетками и определяет уровень белка в плазме крови. Таким образом, изучение механизмов регуляции продукции apoA-I гепатоцитами и энтероцитами представляет значительный интерес.
Степень разработанности проблемы. Экспрессия гена и секреция белка apoA-I гепатоцитами регулируется большим количеством факторов. Подавление продукции apoA-I клетками печени в острой фазе воспаления происходит за счет угнетения экспрессии гена apoA-I цитокинами TNF и IL-1. Ранее в отделе биохимии НИИЭМ было показано, что ядерные рецепторы семейств LXR и PPAR играют ключевую роль в этом процессе (Mogilenko et al., 2010). Гормон инсулин регулирует метаболические пути во многих тканях организма, в том числе в печени, мышцах и жировой ткани. Экспрессия многих генов находится под контролем инсулин-зависимых сигнальных путей. Значительное внимание уделяется изучению влияния инсулина на экспрессию генов метаболизма глюкозы, таких как GK, PEPCK и G6Pase, однако известно, что инсулин регулирует и работу генов-участников метаболизма холестерина. В ранних работах по изучению экспрессии гена apoA-I было показано, что инсулин регулирует экспрессию гена apoA-I, однако детали этого процесса остались не изученными. В то же время оказалось, что apoA-I, входящий в состав ЛПВП, регулирует секрецию инсулина -клетками поджелудочной железы. Эти данные указывают на возможное существование отрицательной обратной связи между продукцией apoA-I и секрецией инсулина. Известно, что ядерные рецепторы, участвующие в инсулиновом сигналинге, контролируют экспрессию гена apoA-I в клетках печени. Кроме того, гепатоцитарный энхансер гена apoA-I содержит участок потенциального связывания одного из ключевых факторов сигналинга инсулина – белка FOXO1. Эти данные указывают на ядерные рецепторы и фактор FOXO1 как на потенциальных регуляторов экспрессии гена apoA-I. Учитывая ключевую роль инсулина в регуляции метаболизма и важнейшую роль apoA-I в предотвращении развития атеросклероза, были сформулированы цель и задачи данного исследования.
Цель работы. Целью данной работы служило установление влияния инсулина и оксидативного стресса на экспрессию гена apoA-I в клетках гепатомы человека HepG2, а также выяснение роли сигнальных каскадов и транскрипционных факторов в этом процессе.
Задачи исследования.
1. Изучить регуляцию экспрессии гена apoA-I при оксидативном стрессе и установить
сигнальные каскады и транскрипционные факторы, участвующие в этом процессе в клетках HepG2.
-
Изучить роль транскрипционного фактора FOXO1 в регуляции экспрессии гена apoA-I и выявить сайт связывания FOXO1 в 5`-регуляторной области гена apoA-I.
-
Изучить регуляцию экспрессии гена apoA-I при обработке клеток HepG2 инсулином и определить сигнальные каскады и транскрипционные факторы, участвующие в регуляции экспрессии гена apoA-I инсулином.
-
Изучить взаимодействие белков FOXO1 и LXR, а также FOXA2 и LXR в клетках HepG2.
-
Определить влияние инсулина на стабильность комплексов транскрипционных факторов FOXO1, LXR, FOXA2, LXR, и на их способность взаимодействовать с 5`-регуляторной областью гена apoA-I и клеточную локализацию комплексов.
Научная новизна полученных результатов. Впервые показано, что регуляция гена apoA-I инсулином зависит от времени инкубации концентрации гормона, и изучена роль белков FOXO1, FOXA2, LXR и LXR в этом процессе. Впервые показано подавление экспрессии гена apoA-I транскрипционным фактором FOXO1 в клетках гепатомы человека HepG2, а также участие данного фактора в регуляции экспрессии гена apoA-I при оксидативном стрессе. Показано, что подавление экспрессии гена apoA-I при оксидативном стрессе происходит за счет активации сигнальных каскадов p38, JNK, Src и AMPK, а также транскрипционного фактора LXR. Впервые показано образование комплекса белков FOXO1 и LXR, а также FOXA2 и LXR in vivo, и установлена необходимость данных комплексов для подавления экспрессии гена apoA-I инсулином. Показано, что подавление экспрессии гена apoA-I инсулином происходит за счет активации сигнальных каскадов PI3K/Akt/mTOR, p38, JNK, NF-B и MEK в регуляции экспрессии гена apoA-I инсулином.
Теоретическое и практическое значение результатов исследования. Полученные
результаты расширяют представление о регуляции экспрессии гена apoA-I факторами,
играющими ключевую роль в регуляции метаболизма и ответа на оксидативный стресс.
Учитывая ранее опубликованные данные об активации секреции инсулина -клетками
поджелудочной железы аполипопротеином А-I, в настоящей работе выявлена
отрицательная обратная связь между концентрацией инсулина и продукцией белка apoA-I
клетками HepG2. Эти данные необходимо учитывать при разработке
антиатеросклеротических препаратов на основе лигандов ядерных рецепторов и ингибиторов сигнальных белков, а также препаратов, повышающих содержание инсулина в крови. Выявленное в настоящей работе подавление экспрессии apoA-I при оксидативном стрессе позволяет предложить снижение уровня эндогенной H2O2 в клетках печени в качестве мишени антиатерогенных препаратов. Полученные результаты необходимо учитывать при разработке препаратов для терапии инсулин-резистентности и метаболического синдрома.
Методология исследования. Исследование влияния инсулина и оксидативного стресса на экспрессию гена apoA-I проводилось с использованием культуры клеток гепатомы человека HepG2. Изменения уровня мРНК исследованных генов проводились с помощью ПЦР, а количества внутриклеточных и секретируемых белков – с помощью
иммуноблоттинга и ИФА. Участие сигнальных каскадов и транскрипционных факторов в исследуемых процессах изучалось с помощью специфических ингибиторов, агонистов ядерных рецепторов и трансфекции клеток siRNA. Роли различных участков регуляторной области гена apoA-I в исследуемых процессах изучались с использованием иммунопреципитации хроматина, ДНК-аффинной хроматографии и плазмидных конструкций. Образование комплексов белков и их ядерно-цитоплазматическую транслокацию изучали с помощью иммунопреципитации и иммуноцитохимии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Экспрессия гена apoA-I в клетках HepG2 подавлена при оксидативном стрессе за счет активации сигнальных каскадов JNK, p38, Src и AMPK, а также транскрипционных факторов FOXO1 и LXR.
-
FOXO1 связывается с сайтом B гепатоцитарного энхансера гена apoA-I.
-
Инсулин подавляет экспрессию гена apoA-I в клетках HepG2 за счет активации сигнальных каскадов Akt, p38, MEK, mTORC1 и NF-B и транскрипционных факторов FOXO1, LXR, FOXA2 и LXR.
-
Белки FOXO1 и LXR, а также FOXA2 и LXR образуют комплексы в клетках HepG2. Обработка клеток инсулином вызывает ослабление связывания комплекса FOXO1/LXR с гепатоцитарным энхансером и его транслокацию в цитоплазму.
Апробация работы. Материалы работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих конференциях: 14ая Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, 19 - 23 апреля 2010 г., Пущино; II всероссийская научная конференция молодых ученых “Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия”, ФГБУ “НИИЭМ” СЗО РАМН, 12 - 14 ноября 2012 года, Санкт-Петербург; XXII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2015, МГУ, 13-17 апреля 2015 г., Москва; Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье, СПбГУ, 18 апреля 2015; Symposium of the International Atherosclerosis Society “Anitschkow Days”, Санкт-Петербург, 2 - 4 июня, 2016.
Личный вклад автора в проведение исследования. Соискателем были проведены:
анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение
основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях.
Выделение РНК и клеточных белков, реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном
времени, иммунопреципитация хроматина, иммунопреципитация, иммуноблоттинг,
конструирование генетических конструкций и сайт-направленный мутагенез,
люциферазный тест, выделение ядерных белков и ДНК-аффинная хроматография выполнены соискателем. Культивирование клеточной линии HepG2 выполнено совместно с ведущим научным сотрудником отдела биохимии, к.б.н. Э.Б. Диже.
Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 388 наименований, из них 388 наименований на английском
Сигнальные каскады ЛПНП в патогенезе атеросклероза
Многие исследователи склонны рассматривать атеросклероз как заболевание, в истоках которого лежат нарушения в регуляции воспалительных процессов, происходящих в стенках сосудов [3, 9]. Такие процессы приводят к образованию атеросклеротической бляшки, а также ее дальнейшему росту [3, 9].
Первым этапом возникновения атеросклероза является активация клеток эндотелия сосудов вследствии нарушения нормального ламинарного тока крови [10]. Увеличение содержания холестерина в ЛПНП также способствует активации клеток эндотелия сосудов [2]. Активированные клетки эндотелия продуцируют провоспалительные цитокины, привлекающие лимфоциты крови и тромбоциты, и усиливают синтез молекул клеточной адгезии. Это стимулирует взаимодействие между клетками стенок сосуда и иммунной системы, а ремодуляция цитоскелета активированных клеток эндотелия позволяет лимфоцитам проникать внутрь стенок сосудов [11]. Ростовые факторы, секретируемые эндотелиальными клетками, способствуют пролиферации гладкомышечных клеток сосуда, что приводит к росту бляшки [12].
Процессы, происходящие с моноцитами, привлеченными в бляшку хемокинами и цитокинами, отражены на рисунке 1. Проникающие в область роста бляшки моноциты дифференцируются в макрофаги под влиянием провоспалительных цитокинов (INFy, IL-lp, TNFa, МСР-1), синтезируемых эндотелиальными клетками. Значительную роль в этих процессах играют различные T-лимфоциты [13]. ЛПНП связываются с протеогликанами стенок сосудов за счет ионных взаимодействий между молекулами протеогликанов и основного белка ЛПНП ароВ [14], что повышает их локальную концентрацию. В условиях гиперхолестеринемии этот процесс значительно повышает вероятность образования модифицированных липопротеидов низкой плотности (мЛПНП) непосредственно в стенках сосудов. Фагоцитоз макрофагами мЛПНП приводит к образованию пенистых клеток, пересыщенных эфирами холестерина, а также свободным холестерином. Такие макрофаги гибнут апоптозом или некрозом, что, во-первых, вызывает привлечение в область бляшки новых лимфоцитов, а во-вторых, стимулирует поглощение образовавшихся частиц фагоцитами и, как следствие, образование новых пенистых клеток и разрастание бляшки. Растущая бляшка привлекает не только иммунные клетки - также в нее проникают и фибробласты, со временем формирующие фиброзную капсулу. Рост числа клеток внутри капсулы, а также секреция клетками металлопротеиназ и подавление синтеза коллагена цитокинами вызывают нестабильность бляшки. Такая бляшка может оторваться от стенки сосуда и стать причиной образования тромба [3, 15]. Рисунок 1. Привлечение моноцитов в бляшку и формирование пенистых клеток.
Центральным событием в развитии атеросклероза является образование пенистых клеток [9]. Этот процесс, по-видимому, является следствием нарушения липидного обмена в макрофагах и гладкомышечных клетках сосуда. В норме одной из ключевых функций макрофагов является удаление потенциально вредоносных субстанций из тканей, таких как бактерии, частицы апоптозировавших клеток или же модифицированные ЛПНП. Функцией ЛПНП считается перенос холестерина и фосфолипидов из тонкой кишки и печени в периферические ткани организма [9]. В процессе метаболизма ЛПНП часть из них претерпевает различные модификации, среди которых окисление [16, 17], агрегация [18], гликирование [9]. Выделяют несколько субфракций ЛПНП. Показано, что так называемые малые плотные ЛПНП (мпЛПНП; диаметр — 18-20 нм, плотность — 1.044-1.063 г/мл) являются проатерогенными в отличие от более крупных и менее плотных субтипов. По сравнению с другими субтипами ЛПНП, в составе мпЛПНП повышено содержание ароС-Ш, что, по всей видимости, усиливает их способность связываться с артериальными протеогликанами [19] и, таким образом, увеличивает их проатерогенность.
Накопление холестерина в макрофагах вызывает секрецию провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 и TNFa [20], и преобразование макрофагов в пенистые клетки. Такие клетки претерпевают клеточную смерть в ходе апоптоза или некроза [21]. Роль апоптоза в развитии бляшки неоднозначна. Kubo et al. показали, что агрегированные ЛПНП подавляют апоптоз, вызванный активацией протеин киназы С (РКС) форболовым эфиром, но способствуют апоптозу при обработке макрофагов цитокином M-CSF [22]. При этом окисленные ЛПНП подавляют макрофагальную синтетазу NO (iNOS), что ускоряет клеточную смерть [16]. Интерпретация результатов Kubo et al. усложняется тем фактом, что в данной работе использовались агрегированные ЛПНП, а не окисленные или минимально модифицированные ЛПНП. Кроме того, протокол выделения ЛПНП, использованный в данной работе, не предполагал отделения ЛПОНП от ЛПНП, что также могло повлиять на результаты исследования.
Инактивация внутриклеточного транспортера холестерина АВСА2 в макрофагах предотвращает накопление эфиров холестерина в макрофагах и вызывает ускоренный апоптоз клеток и уменьшение как размера бляшки, так и количества холестерина в ней [23]. Многие исследователи полагают, что апоптоз в ранней бляшке носит целительный характер, способствуя быстрому очищению бляшки от мЛПНП, в то время как апоптоз в развитой бляшке приводит к аккумуляции мЛПНП и макрофагов в бляшке из-за ускоренного превращения макрофагов в пенистые клетки [3, 22]. В развитой бляшке массовый апоптоз макрофагов приводит к накоплению большого числа апоптотических частиц, содержащих большие количества эфиров холестерина и остатков мЛПНП. Апоптотические частицы поглощаются другими макрофагами и вызывают миграцию новых моноцитов в бляшку, что приводит к амплификации воспаления [15].
Поглощение нативных ЛПНП происходит с помощью рецептора к ЛПНП (LDLR) [24, 25], однако модификации ЛПНП приводят к потере сродства к данному рецептору. Удаление мЛПНП из плазмы осуществляется с помощью скэвенджер рецепторов: SR-A [26], CD36 [27], SR-BI [28], CD68 [17], SR-PSOX [29] и LOX-1 [30].
Необходимость удаления мЛПНП из плазмы вызвана их высокой проатерогенностью. Модифицированные ЛПНП подавляют активность нейтральной гидролазы эфиров холестерина (NCEH1), ответственной за деэтерификацию внутриклеточного холестерина, угнетая обратный транспорт холестерина [31, 32]. Модифицированные ЛПНП стимулируют продукцию специфических антител и являются антигенами для Т-лимфоцитов [33]. Такие специфические антитела связываются с мЛПНП, что ускоряет их поглощение макрофагами [34, 35]. Модифицированные ЛПНП вызывают апоптоз клеток эндотелия в культуре [36], а также подавляют вазадилатацию и увеличивают проницаемость стенок сосудов in vivo [3]. Кроме того, мЛПНП являются хемоатрактантами для моноцитов [17, 37]. Окисление фосфатидилхолина, входящего в ЛПНП, приводит к образованию молекул, чья структура напоминает структуру провоспалительного липидного медиатора, активирующего тромбоциты (PAF) [38]. Окисленный фосфатидилхолин способен взаимодействовать с рецепторами PAF, что усиливает воспалительный ответ макофагов и препятствует выходу дендритных клеток из бляшки [38]. Все эти свойства мЛПНП свособствуют разрастанию бляшки [3].
Эти эффекты достигаются за счет стимулирования экспрессии и секреции МСР-1, M-CSF, фактора роста, синтезируемого тромбоцитами (PDGF), фактора роста эпителия сосудов (VEGF) клетками эндотелия [17, 39, 40], а также активации ренин-ангиотензиновой системы [3]. Ангиотензин является сильным стимулятором экспрессии скэвенджер рецептора LOX-1, что способствует усилению поглощения мЛПНП клетками [41]. мЛПНП вызывают продукцию свободных радикалов (ROS) [42] и угнетают экспрессию iNOS макрофагами [43], что формирует петлю положительной обратной связи в развитии бляшки.
Генетические конструкции
Скэвенджер рецепторы также обладают способностью передавать сигнал внутрь клетки при взаимодействии с мЛПНП. Скэвенджер рецептор CD36 активирует киназы семейства Src Fyn и Lyn, что приводит к фосфорилированию МЕКК2, JNK1 и JNK2 и активации макрофагов. Другой мишенью Lyn является киназа PYK2, которая также участвует в активации JNK и Erk и усиливает продукцию ROS. Фосфорилирование цитоплазматического домена CD36 киназой Lyn способствует образованию комплекса CD36LR4. Таким образом, CD36 участвует в активации NF-кВ под действием мЛПНП в макрофагах. CD36 взаимодействует с TLR4 и мЛПНП-зависимо активирует Vav, который запускает эндоцитоз мЛПНП за счет взаимодействия с dynamin-2, активации PLCy и кальциевого сигналинга. Что особенно важно, способность мЛПНП блокировать эмиграцию макрофагов из бляшки зависит от CD36-опосредованной активации киназы FAK и продукции ROS [3].
Скэвенджер рецептор LOX-1, являющийся основным скэвенджер рецептором эндотелиоцитов, также играет важную роль в проатерогенном сигналинге мЛПНП [3, 41, 69]. Его вклад в эндоцитоз ЛПНП в макрофагах в норме невысок, но при стимуляции клеток ЛПНП экспрессия LOX-1 значительно усиливается, и доля его участия в поглощении мЛПНП существенно возрастает. LOX-1 участвует в мЛПНП-зависимой активации экспрессии генов хемокинов МСР-1, IL-8, CXCL2, CXCL3, ростовых факторов PDGF, VEGF и HB-EGF, молекул клеточной адгезии ICAM-1, VCAM-1, P-selectin, E-selectin, металлопротеиназ ММР-1 и ММР-9. Блокирование сингналинга LOX-1 уменьшает вероятность апоптоза при обработке эндотелиоцитов мЛПНП и ослабляет мЛПНП-зависимое усиление экспрессии Fas. При этом увеличение количества молекул LOXIN, альтернативной сплайс-изоформы LOX-1, защищает клетки от апоптоза. мЛПНП активируют экспрессию гена вазоконстриктора ЕТ-1, который, в свою очередь, усиливает экспрессию гена LOX-1, что приводит к созданию петли положительной обратной связи. Цитоплазматический домен LOX-1 служит доком для сборки комплекса ARHGEF1/MMP1/ROCK2, взаимодействие которого с RhoA приводит к активации киназной активности ROCK2 и последующему фосфорилированию и инактивации PI3K, РКВ и eNOS. Этим частично объясняется вклад LOX-1 в апоптоз эндотелиоцитов и вазоконстрикцию. ROCK2 также активирует NF-кВ, способствуя усилению экспрессии провоспалительных генов. LOX-1 также способствует продукции ROS через взаимодействие с Racl [3, 41, 69].
Ключевую роль во всех вышеописанных процессах играет воспаление. Провоспалительные цитокины как правило способствуют развитию атеросклероза, то есть являются проатеросклеротическими, вызывая увеличение количества макрофагов М1 типа и Tы лимфоцитов в бляшке. В тоже время цитокины, лимитирующие развитие воспаления и способствующие специализации макрофагов по М2 фенотипу и привлечению Treg и Th2 лимфоцитов, как правило, являются антиатеросклеротическими [26, 70]. Макрофаги M2 типа секретируют противовоспалительные цитокины, ограничивая развитие бляшки. В то же время, они синтезируют факторы роста и ангиогенеза, такие как VEGF, что может способствовать пролиферации гладкомышечных и эпителиальных клеток и росту бляшки. В регрессирующих бляшках отношение количества М2 макрофагов к числу М1 макрофагов существенно выше, чем в растущих бляшках, что подчеркивает антиатеросклеротические свойства М2 макрофагов. При этих условиях синтез факторов ангиогенеза М2 макрофагами, очевидно, не является атерогенным. Однако в растущих бляшках продукция VEGF и других факторов М2 макрофагами может вносить вклад в развитие атеросклероза [11, 26].
Цитокины могут проявлять как проатерогенные, так и антиатерогенные свойства в зависимости от ситуации. Провоспалительный цитокин INFy подавляет синтез коллагена эндотелиоцитами и усиливает пролиферацию гладкомышечных клеток, одновременно активируя транскрипцию генов металлопротеиназ, скэвенджер рецептора CD36, молекул клеточной адгезии и провоспалительных цитокинов. Все эти процессы способствуют отрыву бляшки от стенки сосуда и патогенному тромбообразованию. Противовоспалительный цитокин TGFp, характерный для Tьг-ответа, проявляет свойства, противоположные INFy. TGFp проявляет функцию иммуномодулятора, стимулируя Ть2-ответ и способствуя дифференцировке Treg клеток, происходящей за счет активации дендритных клеток. Кроме того, TGFP напрямую стимулирует экспрессию фактора FoxP2 в T-лимфоцитах, что необходимо для развития Treg. TGFp подавляет экспрессию CD36, способствует синтезу коллагена и противовоспалительных цитокинов и, как следствие, затуханию воспаления и стабилизации бляшки. В то же время, INFy подавляет синтез скэвенджер рецептора SR-PSOX, а TGFP стимулирует продукцию проатерогенного LOX-1. Как следствие, ни один из этих цитокинов нельзя строго характеризовать как про- или антиатерогенный [26, 27, 71].
Провоспалительные цитокины TNFa, IL-lp и INFy индуцируют экспрессию скэвенджер-рецепторов в гладкомышечных клетках сосудов. Это приводит к поглощению гладкомышечными клетками мЛПНП и превращению их в пенистые клетки. Кроме того, провоспалительные цитокины и мЛПНП стимулируют пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток в бляшку. TNFa оказывает эффекты на все типы клеток в атеросклеротической бляшке, стимулируя пролиферацию, экспрессию провоспалительных цитокинов, захват мЛПНП и синтез молекул клеточной адгезии. В частности, TNFa повышает экспрессию LOX-1, подавляя при этом продукцию скэвенджер-рецептора SR-A. TNFa также способствует апоптозу пенистых клеток, оказывая значительное влияние на прогресс атеросклероза [3, 26, 71].
Интерлекины IL-ip и IL-6 также являются провоспалительными цитокинами. Оба вызывают пролиферацию гладкомышечных клеток и способствуют продукции молекул клеточной адгезии и цитокинов. Однако в исследованиях in vivo на мышах, нокаутированных по гену IL-ip и потому частично защищенных от атеросклероза, отсутствие IL-6 способствовало росту бляшки. Это объясняется тем, что помимо своих проатеросклеротических эффектов IL-6 также индуцирует экспрессию противовоспалительных факторов IL-10 и растворимого антагониста рецептора IL-1 (TL-1RA). Таким образом, в отличие от TNFa и IL-1 р, суммарный эффект от действий IL-6 является антиатеросклеротическим [11].
Противовоспалительный цитокин IL-10 обладает сильными антиатеросклеротическими свойствами. Так, IL-10 подавляет экспрессию генов клеточной адгезии и цитокинов, индуцированную провоспалительными цитокинами, ингибируя МАРК и NF-кВ сигналинг. Кроме того, IL-10 снижает стабильность мРНК многих провоспалительных цитокинов и пролиферацию гладкомышечных клеток в ответ на П.-1р [11, 71].
Роль цитокина M-CSF в развитии атеросклероза также неоднозначна. M-CSF является хемоаттрактантом для моноцитов и вызывает их дифференцировку в макрофаги, тем самым способствуя увеличению размера бляшки [26]. Кроме того, M-CSF способствует поглощению мЛПНП и этерификации холестерина макрофагами, постепенно подавляя экспрессию LDLR с течением дифференцировки макрофагов [32]. В то же время, M-CSF усиливает отток холестерина, в том числе и за счет активации гидролиза эфиров холестерина NCEH1, и секрецию макрофагами apoE и растворимой фосфолипазы и защищает макрофаги от апоптоза, индуцированного агрегированными ЛПНП [22, 32]. Таким образом, действия M-CSF могут быть полезны на ранних этапах развития бляшки. Продукция M-CSF клетками в развитой бляшке может напротив приводить к чрезмерному увеличению размеров бляшки и образованию пенистых клеток.
Ядерные рецепторы LXRs участвуют в подавлении активности гена apoA-I инсулином
Все ядерные рецепторы функционируют в качестве димеров. Рецепторы эстрогенов и некоторые другие рецепторы образуют гомодимеры, в то время как все остальные гетеродимеризуются с RXR. Часть таких димеров рецепторов может выполнять свои функции, провзаимодейстовав с лигандом RXR, 9-цис-ретиноевой кислотой [243].
Димеры ядерных рецепторов выполняют свои функции, связываясь с HRE в регуляторных участках генов. Поскольку различные ядерные рецепторы могут связываться с одной и той же последовательностью, существует конкуренция за связывание с этими участками ДНК. Кроме того, поскольку множество ядерных рецепторов гетеродимеризуется с RXR, все они конкурируют за пул этого белка в клетке.
В соответствии с классической моделью функционирования нестероидных ядерных рецепторов такие белки всегда связаны со своим сайтом на ДНК [243]. При отсутствии лиганда ядерный рецептор взаимодействует с различными корепрессорами, подавляя экспрессию гена [243, 244]. Связывание лиганд-связывающего домена с лигандом приводит к диссоциации корепрессоров и формированию комплекса с коактиваторами, в результате чего происходит активация экспрессии гена [243].
Подсемейство LXR состоит из двух генов – LXR и LXR, причем гомология между ними составляет 80%. LXR экспрессируется в печени, макрофагах, почке, кишке, селезенке и адипоцитах. LXR экспрессируется во всех типах клеток [245, 246]. LXRs относится к группе нестероидных рецепторов и действуют в качестве гетеродимеров с RXR. Лигандами LXRs являются метаболиты холестерина, оксистеролы, продукты окисления холестерина ЛПНП и синтетические агонисты LXR, например, T0901317. Лиганды RXR могут активировать комплекс LXR/RXR, а совместное добавление лигандов как RXR, так и LXR приводит к еще более существенной активации [247]. На промоторах генов ABCA1 и SREBP-1 показано, что в отсутствии лигандов LXR и LXR взаимодействуют с корепрессорами N-CoR и SRMT, подавляя экспрессию генов. Взаимодействие лигандов с ядерными рецепторами приводит к диссоциации корепрессоров [244, 248]. Любопытно, что у LXR/ -/- мышей уровент белка ABCA1 в макрофагах (но не в гепатоцитах) и уровень ЛПВП в плазме крови значительно выше, чем в WT мышах, что объясняется отсутствием корепрессор-зависимой инактивации гена. В то же время, подобный эффект на экспрессии гена SREBP-1 не наблюдался [248]. Таким образом оказалось, что данный эффект является не только тканеспецифичным, но и ген-специфичным.
LXR существует в виде трех изоформ – LXR1, LXR2 и LXR3. LXR1 экспрессируется повсеместно, LXR2 специфичен для семенников, а LXR3 экспрессируется в малых количествах в щитовидной железе, легких и селезенке. По-видимому, LXR3 является функциональным антагонистом LXR1, так как не имеет лиганд-связывающего домена и не может активировать транскрипцию [245, 246]. Показано, что LXRs могут регулировать экспрессию генов за счет трансрепрессии. SUMO-нилирование LXRs позволяет им связыватся с промоторами генов и предотвращать уход корепрессорных комплексов [249].
Агонисты PPAR усиливают экспрессию гена LXR в различных типах клеток [250]. Этот механизм ответственен за активацию экспрессии гена ABCA1 в печени [251] и макрофагах [250] и усиление транскрипции apoE в адипоцитах [252]. Агонисты PPAR фибраты также усиливают экспрессию LXR [253]. Кроме того, промотор гена LXR содержит LXRE, что создает возможность для лиганд-зависимой аутоактивации [254].
Влияние LXRs на обратный транспорт холестерина неоднозначно. Их агонисты усиливают экспрессию apoA-IV, apoЕ, apoС-I, apoС-II, apoC-IV, SR-BI, ABCA1 и ABCG1 в различных типах клеток [245, 246, 255], но подавляют экспрессию гена и секрецию белка apoA-I в гепатоцитах [4, 256]. LXRs проявляют противовоспалительную активность в макрофагах, ингибируя синтез COX-2 и MMP9, и в T и B лимфоцитах, подавляя клеточное деление [257]. Цитокины острой фазы воспаления подавляют экспрессию генов LXRs, что ослабляет обратный транспорт холестерина и поддерживает развитие воспаления [258].
LXRs участвуют в инсулин-зависимой регуляции активности метаболических генов, а также лиганд-зависимо предотвращает развитие инсулин-резистентности и способствует усилению сигнала от инсулина [259]. Лиганды LXR подавляют синтез глюкозы в печени, угнетая экспрессию генов G6Pase и PEPCK. Данный эффект зависит от LXR, участие же LXR в данном процессе не подтверждено [259]. Стоит отметить, что глюкоза активирует экспрессию генов LXR, LXR, PPAR и PPAR по крайней мере в энтероцитах Caco2 [260]. Не исключено, что данный эффект представляет собой механизм отрицательной обратной связи. Двойной нокаут LXR-/- LXR-/- отменял эффекты инсулина на экспрессию некоторых LXR-зависимых генов (FAS, ACC, GK, ME, S14, HMG-CoAR, SS), но не на метаболизм глюкозы в целом [261].
LXRs активируют экспрессию важного участника инсулинового сигналинга,
транскрипционного фактора SREBP-1c. Его активность зависит от концентрации холестерина в мембране эндоплазматического ретикулюма. LXRs лиганд-зависимо активируют экспрессию гена SREBP-1c [262], и необходимы для инсулин-индуцированной экспрессии гена [261]. Любопытно, что SREBP-1c активирует экспрессию miR-613, которая подавляет трансляционную активность мРНК LXR, связываясь с 3`-UTR [263]. Кроме того, LXR также является мишенью miR-1 и miR-206 [264]. Таким образом, формируется петля отрицательной обратной связи, препятствующая гиперактивации лиганд-зависимого LXR-сигналинга.
LXR лиганд-зависимо активирует экспрессию GK, связываясь с промотором гена. Активация транскрипции GK инсулином зависит от LXR, но не требует наличия лигандов LXR. Кроме того, для действия инсулина необходимы SREBP-1c и PPAR [265]. LXR контролирует экспрессию и секрецию инсулина в -клетках поджелудочной железы. TO901317 активирует экспрессию гена Ins2 и секрецию инсулина, в то время как нокаут гена LXR ослабляет активность гена [266].
Инсулин модулирует активность LXRs с помощью нескольких механизмов. Вo-первых, инсулин усиливает экспрессию гена LXR у крыс [261]. Во-вторых, активация Akt-mTORC1 сигнального пути приводит к фосфорилированию LXR киназой p70S6K, активируя ядерный рецептор и усиливая LXR-зависимую экспрессию генов мишеней [267]. В то же время, AMPK фосфорилирует LXR, инактивируя его [267].
LXR фосфорилирутеся и другими киназами. Показано, что LXR фосфорилируется по сайту S198 [268] киназой CK2 и что данное фосфорилирование влияет на экспрессию ряда LXR-зависимых генов [269]. Фосфорилированный LXR взаимодейсвует с NcoR или другими корепрессорами на промоторах генов, таких как AIM, CCL24, LPL [269] и CCR7 [99], но не влияет на экспрессию других генов мишеней LXRs (ABCA1, ABCG1, SREBP-1c, PLTP) [269]. Лиганды LXRs (TO901317, GW3965 и 25-эпоксихолестерол) усиливают фосфорилирование по S198, а лиганд RXR 9-цис-ретиноевая кислота препятствует данному фосфорилированию и способствует активации генов, угнетаемых LXR, фосфорилированным по S198 [99, 269].
Показано, что PKA фосфорилирует LXR в клетках печени крысы и мыши по четырем сайтам (S195, S196, S290, S291) [270]. В результате такого фосфорилирования нарушается гетеродимеризация между LXR и RXR и способность LXR взаимодействовать с коактиваторами, что приводит к подавлению LXR-зависимой экспрессии гена SREBP-1c, но не ABCA1. Кроме того, данное фосфорилирование усиливает взаимодействие между LXR и NCoR [270], что может потенциально способствовать активности LXR в качестве корепрессора.
Из вышеизложенного можно заключить, что LXRs играют ключевую роль в предотвращении развития атеросклероза за счет своей способности активировать обратный транспорт холестерина из макрофагов.
Ядерные рецепторы и белки семейства Forkhead зачастую регулируют экспрессию одних и тех же генов, взаимодействуя и усиливая или ослабляя эффекты друг друга. FOXO1 и HNF4 кооперативно регулируют экспрессию генов GK и G6Pase [219, 271]. HNF4 является активатором экспрессии GK, в то время как FOXO1 подавляет экспрессию гена. При этом для угнетения экспрессии GK FOXO1 требуется как взаимодействие FOXO1 с сайтом связывания на промоторе гена, так и связывание HNF4 со своим сайтом на промоторе. При формировании комплекса между белками происходит ослабление связывания HNF4 со своим сайтом [219].
FOXO1 и LXR возвращаются на гепатоцитарный энхансер после 48-часовой инкубации с инсулином
Обработка клеток инсулином вызывает активацию части сигнальных каскадов, также принимающих участие в сигналинге от рецептора цитокина TNF. Ранее в нашей лаборатории было показано, что TNF подавляет экспрессию гена apoA-I в клетках гепатомы человека, задействуя сигнальные каскады p38-MAPK, JNK-MAPK и NF-B [4]. Мы изучили участие сигнальных каскадов MAP-киназ и NF-B в инсулин зависимом подавлении экспрессии гена apoA-I c помощью специфических ингибиторов (Рис. 21Б).
Ингибитор JNK SP600125 не оказывал влияния на подавление транскрипции apoA-I инсулином, в то время как ингибиторы MEK U0126 и p38 SB20358 отменяли инсулин-зависимое подавление экспрессии apoA-I. Как и в предыдущих экспериментах [4], подавление активности MEK увеличивало количество мРНК apoA-I, в то время как ингибитор p38 не оказывал никакого эффекта. Обработка клеток ингибитором сигнального пути NF-B не изменяла экспрессию гена apoA-I и отменяла угнетение экспрессии гена 100 нМ инсулина при двух суточной инкубации. Таким образом, инсулин подавляет экспрессию гена apoA-I за счет активации сигнальных каскадов p38, NF-B и MEK. 4.9. NF-B и HNF4 участвуют в подавлении активности гена apoA-I инсулином через сайт А гепатоцитарного энхансара
Мы показали, что обработка клеток HepG2 ингибитором сигнального каскада NF-B QNZ отменяет инсулин-зависимое подавление экспрессии гена apoA-I. Ранее было показано, что NF-B регулирует экспрессию гена apoA-I через сайт А гепатоцитарного энхансера [321]. Для выяснения возможной роли сайта А гепатоцитарного энхансера во влиянии инсулина на экспрессию гена apoA-I, мы трансфецировали клетки HepG2 плазмидой pA1(-256;+72)mutA, содержащей ген люциферазы под контролем ГЭ с инактивированным сайтом А (Рис. 22А).
Рисунок 22. Инсулин подавляет активность гена apoA-I за счет факторов, взаимодействующих с сайтом А ГЭ. Клетки HepG2 инкубировали с 100 нМ инсулина 48 часов. Люциферазный тест. Результаты представлены как процент от контрольного значения (100% в контрольных клетках). А: Инактивация сайта А отменяет супрессорный эффект инсулина. Б: Инсулин инактивирует HNF4. pEGFP – вектор экспрессии GFP; pCMVHNF4 – вектор экспрессии HNF4. В-Г: NF-B участвует в подавлении активности люциферазы инсулином за счет взаимодействия с сайтом А. QNZ – ингибитор NF-B. Статистический анализ различий между группами выполняли с использованием проверки по непарному t-критерию Стьюдента (n=15, p 0.05).
Оказалось, что суточная обработка клеток, трансфецированных pA1(-256;+72)mutA, приводит к снижению активности люциферазы, в то время как референсная плазмида pA1( 66 256;+72) сохраняла исходную активность. В то же время, инсулин подавлял активность люциферазы в клетках, трансфецированных pA1(-256;+72), но не pA1(-256;+72)mutA, после двухсуточной инкубации. Эти результаты заставляют предположить, что транскрипционные факторы, связывающиеся с сайтом А, замедляют инсулин-зависимое подавление экспрессии гена apoA-I.
Для выявления возможного участия NF-B в эффектах инсулина, зависящих от сайта А, клетки, трансфецированные pA1(-256;+72) или pA1(-256;+72)mutA, обработали QNZ и инсулином (Рис. 22Б). Ингибитор NF-B ослаблял базальную активность pA1(-256;+72) и отменял угнетение активности плазмиды инсулином. Ни один из этих эффектов не наблюдался в клетках, трансфецированных pA1(-256;+72)mutA. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что участие NF-B в подавлении экспрессии гена apoA-I инсулином опосредовано сайтом А гепатоцитарного энхансера.
Ранее было показано, что ядерный рецептор HNF4 связывается с сайтом А гепатоцитарного энхансера и активирует экспрессию гена apoA-I [4, 292, 293]. Для определения возможной роли HNF4 в подавлении транскрипции гена apoA-I инсулином плазмида pA1(-256;+72) котрансфецировалась с вектором экспрессии HNF4 pCMVHNF4 (Рис. 22В,Г). Оверэкспрессия HNF4 усилила активность люциферазы. Обработка клеток инсулином не только подавляла активность люциферазы, но и отменяла положительный эффект HNF4 на ее экспрессию. Таким образом можно предположить, что инсулин инактивирует белок HNF4, что приводит к ослаблению активности гена apoA-I.
Транскрипционные факторы семейства LXR участвуют в регуляции липидного обмена инсулином и способны связываться с сайтом C ГЭ [256]. Показано, что инсулин активирует комплекс mTORC1, что приводит к фосфорилированию LXR киназой p70S6K и усилению активности ядерного рецептора [267], а обработка клеток HepG2 рапамицином предотвращает подавление экспрессии гена apoA-I инсулином (Рис. 21А).
Для изучения возможного участия LXRs в инсулин-зависимой регуляции экспрессии гена apoA-I мы обработали клетки HepG2 нестероидным агонистом LXRs TO901317 (Рис. 23). Ранее было показано, что TO901317 подавляет экспрессию гена apoA-I при суточной инкубации [4, 256]. TO901317 угнетал экспрессию гена apoA-I как при 24 часах (Рис. 23А), так и при 48 часах инкубации (Рис. 23Б), в то время как инсулин подавлял активность apoA-I только через 48 часов после начала инкубации. Рисунок 23. TO901317 участвует в инсулин-зависимой регуляции гена apoA-I. Клетки обрабатывали DMSO или TO901317, инкубировали в течение часа и затем добавляли инсулин. ОТ-ПЦР в реальном времени. Результаты представлены как процент от контрольного значения (100% в контрольных клетках). А: 24 часовая инкубация.. Б: 48 часовая инкубация. Статистический анализ различий между группами (с или без добавления TO901317) выполняли с использованием проверки по непарному t-критерию Стьюдента (n=20, p 0.05) и по критерию Даннета (с или без добавления различных концентраций инсулина) (n=20, # p 0.05).
Преинкубация HepG2 с TO901317 в течение часа перед добавлением 100 нМ инсулина приводила к отмене ослабления транскрипции гена apoA-I под действием инсулина. В то же время, инсулин не препятствовал подавлению экспрессии гена apoA-I лигандом LXRs при суточной инкубации. Эти результаты подтверждают гипотезу об участии LXRs в регуляции экспрессии гена apoA-I инсулином. Однако разница в сроках действия инсулина и TO901317 говорит о том, что эффект инсулина не сводится лишь к лиганд-зависимой активации LXRs и подтверждает участие других транскрипционных факторов в этом процессе. TO901317 является лигандом как для LXR, так и для LXR. Для выяснения индивидуальной роли каждого из LXRs в регуляции экспрессии гена apoA-I инсулином клетки гепатомы человека были трансфецированы siRNA против LXR или LXR (Рис. 24). siRNA против LXR подавляла экспрессию LXR на 40% и уменьшала количество мРНК LXR на 20% (Рис. 24А). siRNA против LXR уменьшала количество мРНК LXR на 50%, и активировала экспрессию гена LXR на 30%. Кроме того, трансфекция клеток HepG2 siRNA против LXR снижала концентрацию белка LXR в гепатоцитах (Рис. 24Б). siRNA против LXR активировала экспрессию гена apoA-I на 20% (Рис. 24Г), в то время как siRNA против LXR не оказывала никакого эффекта (Рис. 24В). siRNA против LXR, но не siRNA против LXR отменяла негативный эффект TO901317 на экспрессию гена apoA-I. Суточная инкубация клеток HepG2 с инсулином не оказала никакого эффекта на контрольные клетки, но вызвала подавление экспрессии гена apoA-I в клетках, трансфецированных siRNA против LXR или LXR. Угнетающий эффект инсулина сильнее проявился в клетках, обработанных siRNA против LXR.