Введение к работе
Актуальность проблеми. Выяснение природы и механизмов действия факторов, контролирующее протекание того или иного метаболического процесса и сопрягающих его с другими процессами, является одной из актуальных проблем биохимии. Основной акцепт исследованиіі по регуляции метаболических процессов в последние годы смещен в направлении изучения контроля их интегрирования в функциональную систему обмена. Этот акцент проявляется и в исследовании процесса глю-конеогенеза, который рассматривается как составная часть системы обмена, включащеіі также гликолиз, літогенез, ЦТК.
Заметный успех достигнут в исследованиях регуляции глюконео-генеза и сопряжения его с гликолизом и літогенезом в печени взрослых животных при экспериментально вызываемом изменении соотношения между процессами путем изменения режима питания или гормональном воздействием (Krebs, 1973; Wieland et al., 1973; Romsos, Levellee, 1974; Kohl, Cottam, 1976; Rio et al., 1978; Hers, Van Schaftingen, 1982; NoGuchi et al., 1982).
Однако, несомненно, больший интерес представляет контроль интегрирования метаболической системы, включающей глюконеогенез, при становлении ее в ходе онтогенеза, т.е. когда отсутствует влияние экспериментатора, а изменение соотношения между процессами про-> исходит в ходе реализации генетической информации. Однако, этот ас-* пект проблемы регуляции глюконеогенеза исследован крайне-недостаточно . Немногочисленные сведения по этому вопросу получены в основном при исследовании контроля сопряжения глюконеогенеза с другими процессами при их становлении в печени крысы, т.е. объекта, в котором глюконеогенез появляется относительно.поздно - после рождения животного (Ballard, І97І; Knowles, Ballard, 1974; Back, Angel, 1983). Причем вопросы взаимодействия глюконеогенеза с ЦТК в этих исследованиях практически не затронуты. Данные по контролю сопряжения глюконеогенеза с другими процессами на более ранних стадиях развития еще более ограничены. К началу нашей работы среди такого рода сведений заслуживали внимания результаты Мильмана и Юровицко-го (1973) по энзиматическому контролю координирования глюконеогенеза с гликогенолизом в оогенезе и раннем эмбриогенезе вьюна, а
Используемые сокращения: ЦДТ - пируватдегидрогеназа, ПК -лируватгашаза, ПКК - яируваткарбоксилаза, ФЕГІ - фосфоенолпируват, ФЕП-КК - фосфоенолпируват-карбокеккиназа
также данные Гудриджа (Goodridge, 1968) по контролю сопряжения глюконеогенеза с липогенезом некоторыми сателлитными ферментами глюконеогенеза в печени эмбриона курицы.
Таким образом, в последних работах не рассматривали регуляции глюконеогенеза как части метаболической системы, включающей также"и гликолиз, и літогенез, и ЦТК, т.е. с точки зрения сопряжения глюконеогенеза со всеми этими процессами. Именно этот аспект проблемы регуляции глюконеогенеза на ранних стадиях развития привлек наше внимание.
Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в исследовании регуляции глюконеогенеза и сопряжения его с другими процессами в зависимости от степени дифференцировки и внутриклеточной локализации первого ключевого фермента глюконеогенеза фосфоенолпируват--карбоксикиназы на ранних стадиях онтогенеза.
В качестве моделей исследования были использованы созревание ооцитов и ранний эмбриогенез вьюна, а также печень развивающегося эмбриона курицы. Такой выбор объектов: ооциты, ранние зародыши вьюна и печень эмбриона курицы, - позволял исследовать регуляцию глюконеогенеза и сопряжения его с другими процессами в недифференцированной клетке и на.ранних стадиях дифференцировки, а также в специализированном глюкогенном органе на стадии эмбриогенеза. Одновременно эти объекты предоставляли возможность исследовать зависимость регуляции глюконеогенеза на ранних стадиях развития от внутриклеточной локализации ФЕП-КК, так как в ооцитах и яйцах вьюна этот фермент находится в основном в цигозоле, а в печени эмбриона курицы - в митохондриях.
Конкретными задачами работы были следующие:
-
исследовать роль соотношения адениловых нуклеотидов: (АТФ):(АДФ), (АТФ):(АДФ+АМФ) и степени фосфорилировашя адениловой системы (величины фосфатного потенциала) в координировании глюконеогенеза и гликолиза;
-
выяснить значение окислительно-восстановительного состояния НАД в цитоплазме и митохондриях, а также соотношения между ци-топлазматическим отношением (НАД+):(НАДН) и фосфатным потенциалом в сопряжении глконеогенеза и гликолиза; .
-
раскрыть механизмы, посредством которых пируваткиназа контролирует изменение соотношения между гликолизом и глюконеоге-незом;
-
исследовать полифункциональность глюкозо-6-фосфатазы и оценить ее значение в регуляции глюконеогенеза;
-
выяснять роль сателлитных ферментов глюконеогенеза: лируватдегидрогеназы, цитрат-синтазы и других в контроле сопряжения глюконеогенеза с літогенезом и ЦТК;
-
определить динамику содержания некоторых метаболитов, являющихся субстратами или модуляторами активности ключевых или са-теллитных ферлентов глюконеогенеза: оксалоадетата, ацетил-КоА, КоА и др.
Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна работы заключается в сопоставлении и выявлении особенностей регуляции глюконеогенеза и сопряжения его с гликолизом (гли-когенолизом), літогенезом и ЦТК на ранних стадиях онтогенеза объектов, различающихся степенью дшйеренцировки и внутриклеточной локализацией ФЕП-КК: ооцитов, зародышей вьюна и печеш курищі в эмбриональном и раннем постэмбриональном развитии.
Впервые показано значение окислительно-восстановительного состояния НАД, величины фосфатного потенциала и соотношения аде-ниловых нуклеотидов в координировании глюконеогенеза и гликолиза в ооцитах, яйцах вьюна и в печени развивающегося эмбриона курица.
На основании сопоставления данных по величинам фосфатного
потенциала и соотношения (НАД+):(НАДН) в цитоплазме, полученных
наш для ооцитов и яиц вьюна, а также для печени развивающегося
эмбриона курицы, и другими авторами - для печени крысы, морской
свинки, голубя нами впервые сформулировано положение о том, что
I) в объектах с цитозольной локализацией ФЕП-КК изменения соотно
шения глюконеогенез/гликолиз сопровождаются изменениями величины
фосфатного потенциала и цитоплазматического отношения (НАД4):(НАДН),
хотя направленность изменений этих показателей в разных объектах
этой группы животных может быть неодинаковой; 2) в объектах, в
которых ФЕП-КК локализована в основном в митохондриях, отсутст
вует корреляция между фосфатным потенциалом и отношением
(НАД+):(НАДН) в цитоплазме. г
Впервые установлено, что пируваткиназа в печени развивающейся курицы, представленная Мо-изозимом, участвует в координировании глюконеогенеза и гликолиза посредством механизма, основанного на взаимопревращении двух форм фермента, различающихся кинетически, по сродству к субстрату фосфоенолпирувату.
Впервые выявлена карбачил-фосфат- и пирофосфат-глхжозо фосфотрансферазнал активность глюкозо-6-фосфатазы и оценено значение этой, активности, а также степени латентності! карбамил--фосфат-, ппрофосфат-глюкозо фосфотрансфераз и глюкозо-6-фосфат
фос$огидролазы в контроле скорости глюконеогенеза в печени развивающегося эмбриона курицы. * .
Для выяснения значения сателлитных ферментов глюконеогенеза в регуляции сопряжения процесса с липогенезом и ЦТК впервые определена динамика активности ЦЦГ, цитрат-синтазы и других ферментов в ооцитах и зародышах вьюна, а также в печени курицы в эмбриональном и постэмбриональном развитии. Впервые показано, что регуляция глюконеогенеза сателлитными ферментами в ооцитах и зародышах вьюна отличается рядом особенностей от регуляции процесса в печени. Впервые установлено, что ЦЦГ в раннем эмбриогенезе вьюна ив печени курицы в раннем постэмбриональном развитии контролирует изменения соотношения между глюконеогенезом vi сопряжонными с ним процессами посредством изменения активности дефосфорилировашюй формы фермента.
Впервые обнаружено, что в раннем эмбриогенезе вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицы скорость цитрат-синтазной реакции (максимальная и внутриклеточная) Не является показателем скорости НТК. На примере печени развивающегося эмбриона курицы установлено, что им может служить активность о^-кетоглутаратде-гидрогеназы.
Таким образом, полученные нами результаты существенно расширяют теоретические представления о механизмах регуляции глюконеогенеза и интеграции его с другими процессами на разных стадиях онтогенеза позвоночных.
Основные теоретические положения и выводы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по регуляции метаболизма. Они легли в основу спецкурса "Молекулярные механизмы интеграции метаболизма", который читается для студентов 5-го курса Львовского Государственного Университета по специальности биохимия.
Результаты и методы проведенного исследования используются в работе ряда лабораторий Института биологии развития им. Н.К. Кольцова АН СССР, Института биохимии им, А.В.Палладина АН УССР, Института биологии АН Латвийской ССР, Проблемной научно-исследовательской лаборатории фотосинтеза Тбилисского Государственного' Университета, на кафедре биохимии Львовского Государственного Университета. Разработанные нами методические приемы включены в методическое пособие "Методы биологии развития" (Наука, Москва, 1974).
Обнаружение нами лабильности системы активации пируватде-
гидрогеназы в печени курицы в эмбриональном и постэмбриональном развитии и возможность стабилизации ее сывороткой важно с точки зрения разработки методических приемов для выделения пируватде-гидрогеназного комплекса из печени курицы. Установление пали наличия в печени эмбрионов курицы и однодневного цыпленка КоА практически полностью в дисульфидноіі форме имеет значение для определенля содержания КоА и ацетил-КоА циклическим методом в ' печени кур и, возможно, других птиц.
Полученные нами результаты по механизмам сопряжения глюко-неогенеза с другими процессами в онтогенезе курицы полезны для птицеводческих хозяйств при решении вопросов регуляции углеводно-жирового обмена у птиц.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Ш. ІУ, У Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974; Ленинград, 1979; Киев, 1986), Ш Симпозиуме "Механизмы контроля раннего эмбрионального развития" (Москва, 1974), Симпозиуме "Митохондрии, транспорт электронов и преобразование энергии" (Моста, 1976), Ш Всесоюзной конференции "Экологическая физиология рыб" (Киев, 1976), Всесоюзном Симпозиуме "Регуляторные системы обмена веществ в раннем эмбриогенезе" (Киев, 1979), УІ Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981), УІ Всесоюзном Симпозиуме биохимических обществ СССР и ІДР "Регуляция метаболизма и биоэнергетика" (Таллинн, 1981), Всесоюзном Симпозиуме "Метаболическая регуляция физиологического состояния" (Пущино, 1984), Симпозиуме по адаптации в перинатальном периоде развития (Лейпциг, ГДР, 1984), У! Всесоюзной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Паланга, 1985), П Симпозиуме по печени (Иена, ІДР, 1986), Конференции "Энергетический обмен рыб" (Суздаль, 1986), I Симпозиума "Экологическая биохимия рыб" (Ярославль,'1987).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 работ в отечественных и зарубежных изданиях, среди них монография "Регуляция глюконеогенеза в онтогенезе" (Наука, Москва, 1987) и раз-целы в книгах: "Современные проблемы оогенеза" (Наука, Москва, 1977) и "Oocyte growth and maturation" (Consult. Bureau, N.Y., b.,1988).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, эбзора литературы, описания материалов и методов исследования, ІЗЛОЯЄН.ІЯ полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста, включая 21 таблицу и 13 рисунков. Список