Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Рак яичников 11
1.1.1 Эпителиальный рак яичников 11
1.1.2 Серозные карциномы яичников 13
1.1.3 Эпидемиология эпителиального рака яичников 14
1.1.4 Лечение эпителиального рака яичников 16
1.2. Гистонметилтрансфераза EZH2 18
1.2.1 Модификация гистонов при раке яичников 18
1.2.2 Гистонметилтрансфераза EZH2 и белки группы поликомб 18
1.2.3 Строение и характеристика EZH2 19
1.2.4 Роль EZH2 в онкогенезе 21
1.2.5 EZH2 и рак яичников 22
1.2.6 Регуляция EZH2 22
1.2.7 Мишени EZH2 в раковых клетках 24
1.2.8 Потенциальные анти-EZH2 противоопухолевые препараты
1.3 Противоопухолевое действие РНКазы Bacillus pumilus 27
1.4 Свойства и функции фактора NF-Y 28
2. Материалы и методы исследований 30
2.1. Материалы 30
2.1.1. Реактивы 30
2.1.2. Ингибитор активности EZH2
2.1.3 Биназа Bacillus pumilus 32
2.2.3 Клеточные линии 32
2.1.3 Ксенографты 32
2.1.4 Базы данных 33
2.2. Методы 33
2.2.1 Иммуногистохимимический анализ 33
2.2.2 Количественная ПЦР 34
2.2.3 Иммуноблоттинг 34
2.2.4 Люциферазный репортерный анализ промотера 35
2.2.5 Иммунопреципитация хроматина (ChIP) 36
2.2.6 Индуцируемая гиперэкспрессия, малые шпильковые РНК, продукция лентивируса и ретровируса 37
2.2.7 Рост колоний в полужидкой агарозной среде 37
2.2.8 Определение апоптоза методом Guava Nexin 38
2.2.9 Миграция и инвазивность клеток
2.2.10 Цитометрический анализ популяций клеточного цикла и культивирование клеток в матригеле в трехмерных условиях 39
2.2.11 Статистический анализ 39
3. Результаты исследований 41
3.1 EZH2 регулируется на транскрипционном уровне в клетках ЭРЯ человека 41
3.2 NF-YA высоко экспрессирован в клетках ЭРЯ человека и индуцирует экспрессию EZH2 44
3.3 Экспрессия NF-YA положительно коррелирует с экспрессией EZH2 в клетках ЭРЯ человека и прогнозирует более короткую выживаемость у пациентов 46
3.4 NF-YA связывается с проксимальной частью промотора EZH2 в клетках ЭРЯ человека 48
3.5 Нокдаун NF-YA подавляет экспрессию EZH2 и ингибирует рост клеток ЭРЯ человека in vitro и в ксенографтах 50
3.6 Нокдаун NF-YA вызывает апоптоз клеток ЭРЯ человека 54
3.7 Ингибирование активности EZH2 в клетках ЭРЯ не подавляет их пролиферацию в двумерных условиях роста 57
3.8 Ингибирование активности EZH2 в клетках ЭРЯ подавляет их пролиферацию в трехмерных условиях роста 60
3.9 Ингибитор активности EZH2 подавляет инвазивность клеток ЭРЯ человека 62
3.10 Ингибитор активности EZH2 вызывает апоптоз в клетках ЭРЯ в трехмерных,
но не в двумерных условиях роста 64
3.11 Биназа подавляет жизнеспособность клеток ЭРЯ 67
3.12 Биназа индуцирует апоптоз в клетках ЭРЯ и не влияет на экспрессию EZH
4. Обсуждение Результатов 70
4.1 Регуляция экспрессии EZH2 в клетках ЭРЯ 70
4.2 Ингибирование активности EZH2 в 2D и 3D условиях 71
4.3 Цитотоксическое действие биназы на клетки ЭРЯ 73
Заключение 75
Список сокращений 77
Список литературы
- Гистонметилтрансфераза EZH2 и белки группы поликомб
- Иммуногистохимимический анализ
- Экспрессия NF-YA положительно коррелирует с экспрессией EZH2 в клетках ЭРЯ человека и прогнозирует более короткую выживаемость у пациентов
- Ингибирование активности EZH2 в 2D и 3D условиях
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Каждый год в мире регистрируется 12,7 миллионов новых случаев рака, из которых больше 1 миллиона приходится на гинекологические формы рака [Jemal et al., 2011]. Согласно данным международного агентства исследования рака (International Agency for Research on Cancer, 2008) эпителиальный рак яичников (ЭРЯ) является четвёртой наиболее часто встречающейся причиной смертности от рака среди женщин в мире.
Гистопатология эпителиальных опухолей яичников неоднородна: каждый подтип ЭРЯ содержит изменения экспрессии генов, эпигенетические изменения, генетические мутации, которые все чаще оцениваются на предмет их способности являться целевыми мишенями молекулярных методов лечения и обуславливать эффективность последних. Таким образом, поиск новых доступных целей для терапии ЭРЯ является крайне актуальной темой современной онкологии. В последнее время, появилось множество публикаций, сообщающих о критической роли г истонметилтрансферазы EZH2 в прогрессии онкологических заболеваний самых разных локализаций. Большинство опубликованных работ исследовали влияние уровня экспрессии EZH2 на рост и характеристики культур раковых клеток in vitro, в ксенографтах, а также анализировали ретроспективные данные.
В данной работе был использован новый подход. Впервые был поставлен вопрос, как именно регулируется экспрессия EZH2. В большинстве существующих работ для изучения роли EZH2 использовали нокдаун или сайленсинг гена EZH2, но не специфическое ингибирование активности гистонметилтрансферазы EZH2. Для исследования влияния активности EZH2 на рост и характеристики клеток ЭРЯ мы использовали новый S-аденозилметионин конкурентный ингибитор активности EZH2 – GSK343. Такой подход позволил исключить побочные эффекты нокдауна EZH2, и сфокусироваться на оценке важности его функции эпигенетической регуляции в клетках ЭРЯ.
В соответствии с вышеизложенным, в данной работе была поставлена следующая цель: выявить и охарактеризовать регуляторный механизм экспрессии
гена гистонметилтрансферазы EZH2 и её активности в клетках эпителиального рака яичников.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить уровень экспрессии EZH2 в клеточных линиях эпителиального рака яичника SKOV3, OVCAR-5, PEO1 и нормальных клетках эпителия яичника.
-
Создать репортерные конструкции на основе гена люциферазы для определения активности промотора гена EZH2 в клеточных линиях эпителиального рака яичников и охарактеризовать сайты связывания регуляторов транскрипции гена EZH2.
-
Определить уровень экспрессии NF-YA биоинформационными, биохимическими и иммуногистохимическими методами в нормальных и опухолевых клетках эпителия яичника и подтвердить связывание NF-YA с идентифицированной последовательностью промотора гена EZH2.
-
Выявить регуляторные эффекты нокдауна NF-YA в культурах опухолевых клеток яичника и ксенографтных моделях иммунодефицитных мышей.
-
Установить влияние ингибитора активности EZH2 на клетки эпителиального рака яичников в двумерных и трехмерных условиях роста и охарактеризовать цитотоксичность РНКазы B. pumulus (биназы) по отношению к клеткам рака яичника SKOV3 и OVCAR5 в сравнении с нормальными клетками эпителия яичника.
Научная новизна. В данной работе был впервые исследован механизм регуляции экспрессии гена EZH2. Показано, что за гиперэкспрессию EZH2 отвечает не амплификация гена, а регуляция транскрипционным фактором NF-Y. Установлено, что в ЭРЯ NF-YA связывается с двумя ССААТ сайтами в проксимальной части промотора EZH2. Впервые показана положительная корреляция экспрессии NFYA и EZH2, а также установлено, что высокий уровень NFYA прогнозирует низкую выживаемость среди пациентов с ЭРЯ. При этом было впервые описано, что подавление экспрессии NF-YA снижает экспрессию
EZH2 и вызывает апоптоз клеток ЭРЯ in vitro и в ксенографтах мышей. Было установлено, что ингибирование триметилирования лизина 27 гистона H3 вызывает апоптоз в клетках ЭРЯ, но не в двумерной, а только в трёхмерной структуре (матригеле), что имеет принципиальное значение для тестирования новых препаратов на основе ингибиторов EZH2 и перспектив разработки эффективных терапевтических агентов. Также впервые показано селективное действие РНКазы Bacillus pumilus (биназы) в отношении клеток ЭРЯ в сравнении с нормальными клетками эпителия яичника.
Теоритическая и практическая значимость работы. Полученные
результаты вносят значительный вклад в дальнейшее исследование
гистонметилтрансферазы EZH2 и ее роли в онкогенезе. Новая информация о механизме регуляции EZH2 делает возможным разработку альтернативных методов ингибирования активности EZH2. Показанная корреляция между EZH2 и NF-YA предоставляет возможность разработки новых терапевтических средств для лечения эпителиального рака яичников.
Установленная впервые разница в эффективности действия ингибитора активности EZH2 в двумерных и трёхмерных условиях роста обуславливает необходимость пересмотра постановки множества существующих экспериментов на культурах клеток. Продемонстрированная эффективность действия селективного ингибитора активности гистонметилтрансферазы EZH2 (GSK343) и РНКазы Bacillus pumilus в отношении клеток ЭРЯ открывает новые горизонты для дальнейшего исследования данных препаратов и внедрения в лечебную практику.
Методология и методы исследования. Поставленные задачи были решены с применением биохимических, микробиологических, молекулярно-биологических и генетических методов исследования (полимеразная цепная реакция, электрофорез, проточная цитометрия, иммуноблоттинг, к сенографты, иммунофлуоресценция и другие методы). Результаты исследования обработаны общеизвестными математическими методами статистики.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В промоторной области гена гистонметилтрансферазы EZH2, экспрессия которого повышена в клетках эпителиального рака яичников, выявлены сайты, ответственные за связывание с транскрипционным активатором NF-Y, необходимым для активации экспрессии гена EZH2.
-
В нормальных и опухолевых эпителиальных тканях яичника методами иммуногистохимии, молекулярной биологии и биоинформационными методами установлена прямая корреляция экспрессии регуляторной субъединицы А транскрипционного активатора NF-Y (NF-YA) и гистонметилтрансферазы EZH2.
-
Апоптоз клеток эпителиального рака яичников индуцируется при нокдауне регуляторной субъединицы NF-YA, подавлении активности метилирования лизина 27 гистона Н3 белком EZH2, а также при обработке клеток экзогенной РНКазой Bacillus pumilus (биназой).
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается
значительным объемом многократных лабораторных экспериментов,
выполненных и проанализированных с использованием современных
высокоточных приборов , а также опубликованием полученных результатов в международных журналах с рецензированием ведущими учеными в данной области.
Полученные в рамках диссертационной работы результаты и сформулированные на их основе заключение и положения, выносимые на защиту, являются новым крупным научным достижением в области биохимии; в диссертационной работе также решена научная проблема, имеющая важное значение в лечении онкологических заболеваний.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на следующих конференциях: ежегодные конференции студентов и аспирантов онкологического научно-исследовательского центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2010-2012); на ежеквартальных конференциях аспирантов института Wistar
(Филадельфия, США, 2012-2013); а также на ежегодных отчетных сессиях спонсорского комитета (Филадельфия, США, 2010-2013).
Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Работа выполнена на кафедре микробиологии и в лаборатории Биосинтеза и биоинженерии ферментов Казанского федерального университета в рамках Программы Министерства образования и науки Российской федерации по повышению конкурентоспособности Казанского федерального университета. Часть экспериментов поставлена на базе онкологического научно-исследовательского центра Fox Chase Cancer Center и института Wistar (Филадельфия, США) в рамках грантов NIH RO1CA1633777 и DOD OC093420. Соискателем самостоятельно осуществлена постановка всех экспериментальных исследований, написан обзор литературы и выполнен анализ собственных результатов. Обсуждение результатов, касающихся медицинских аспектов ингибирования EZH2 для со здания перспективных методов терапии рака яичников, проведено при участии доктора Rugang Zhang и док тора Maureen Murphy, являющихся кураторами стажировки соискателя в онкологическом научно-исследовательском центре Fox Chase и институте Wistar.
Связь работы с научными программами. Исследования поддержаны Программой Министерства образования и науки Российской федерации по повышению конкурентоспособности Казанского федерального университета и грантами Российского научного фонда №14-14-00522 и Российского Фонда Фундаментальных исследований № 12-04-01226-a.
Часть экспериментальной работы осуществлена при грантовом финансировании стажировки соискателя в онкологическом научно-исследовательском центре Fox Chase Cancer Center и институте Wistar (гранты NIH RO1CA1633777 и DOD OC093420).
Публикация результатов исследования. По теме работы опубликовано 4 статьи в международных журналах (суммарный импакт-фактор 39,1), включенных в базы Scopus и WOS, и 2 тезиса докладов научных конференций.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включает 36 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает 143 наименований.
Гистонметилтрансфераза EZH2 и белки группы поликомб
Модификация гистонов – это эпигенетические изменения отвечающие за ремоделирование структуры хроматина, изменяющие доступность сопряженной ДНК. Модификации аминотерминальных «хвостов» гистонов, такие как метилирование, ацетилирование и фосфорилирование могут менять статус хроматина от транскрипционно доступного до недоступного. Таким образом, экспрессия генов частично определяется, так называемым, «гистонным кодом» [Jenuwein, Allis, 2001]. Также известно, что метилирование гистонов может быть связано с метилированием ДНК и, как следствие, абберантной экспрессии генов в раковых клетках [Asadollahi et al., 2010]. Многие предпологаемые гены-супрессоры опухолей, включая RASSF1, DLEC1, CDKN1A, CKN2A и MLH1, подавляются не только метилированием промотера, но также модификаций гистонов. Было показано, что репрессивное метилирование лизина 27 на гистоне H3 (H3K27me3) отвечает за подавление экспрессии RASSF1 в клетках эпителиального рака яичников [Abbosh et al., 2006]. Триметилирование H3K27 происходит с помощью гистонметилтрансферазы EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2). Деметилирование H3K27 ресенсибилизировало резистентные к цисплатину клетки ЭРЯ путем увеличения доступа лекарственного агента к целевым последовательностям ДНК. Повышенный доступ к ДНК обусловлен релаксацией конденсированного хроматина [Wei et al., 2008].
Критическая роль EZH2 была описана в эмбриогенезе мышей. После делеции гена EZH2 наблюдалась высокая смертность эмбрионов на ранней стадии [O Carroll et al., 2001]. EZH2 является каталитической субъединицей Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), в который также входят субъединицы EED, SUZ12 и RbAp46/48, необходимые для гистонметилтрансферазной активности комлпекса in vitro [Simon, Kingston, 2009]. PRC2 подавляет экспрессию целевых генов путем модификации структуры хром атина. Было показано, что PRC2 взаимодействует с рядом других белков обладающих эпигенетической активностью, такими как ДНК-метилтрансферазы (ДНМТ), гистон деацитилаза 1 (HDAC1) и SIRT1 [Vire et al., 2006; Van der Vlag, Otte, 1999; Kuzmichev et al., 2005].
Несмотря на сложное строение комплекса PRC2 и взаимодействие с другими белками, EZH2 является главной каталитической субъединицей, имеющей критическое значение в структуре и активности всего комплекса. Когда PRC2 рекрутируется на хроматин, EZH2 индуцирует триметилирование лизина 27 на гистоне H3 (H3K27me3). Триметилированный H3K27 часто ассоциирован с репрессией гена. Кроме H3K27me3, репрессивный эффект PRC2 достигается путем вовлечения ДНМТ, и гомологичного комплекса PRC1, в котором EZH2 играет основную роль. ДНМТ метилируют ДНК, а PRC1 обладает гистон-модифицирующей активностью путем убиквитилирования лизина 119 гистона H2A. PRC1 вызывает конденсацию хроматина и препятстувует транскрипционной элонгации РНК-полимеразой (Pol II) [Vire et al, 2006].
Ген EZH2 человека локализован в хромосоме 7q35, состоит из 20 экзонов кодирующих 746 аминокислотных остатков. EZH2 в основном находится в ядре клетки, но описаны случаи нахождения в цитоплазме [Su et al., 2005]. Сиквенирование показало, что семейство генов EZH имеет 4 гомологичных домена: H1, H2, цистеин-богатый домен и С-концевой SET домен [Margueron et al, 2008].
Для гистонметилтрансферазной активности необходимы цистеин-богатый и SET домены [Tschiersch et al, 1994]. Несмотря на то, что EZH2 содержит эти домены, было показано, что рекомбинантная EHZ2 не обладает гистонметилтрансферазной активностью, следуя из чего можно предположить, что EZH2 должна находиться в составе функционального комплекса для проявления гистонметилтрансферазной активности. Выделение и очистка комплекса содержащего EZH2 показали, что для триметилирования H3K27 необходимо наличие субъединиц EED и SUZ12 [Cao, Zhang, 2004]. Также домен SET может связываться с длинными некодирующими РНК (long ncRNA) HOTAIR и XIST [Zhao et al., 2008; Tsai et al., 2010].
EZH2 и EZH1 являются EZ (Enhancer of Zeste) гомологами у позвоночных. Несмотря на то, что оба гомолога формируют комплексы с белками группы поликомб (PcG), у них разные паттерны экспрессии и функции. EZH1 обнаруживается как в делящихся, так и в дифференцированных клетках, а EZH2 обнаруживается толь ко в активно делящихся клетках [Margueron et al., 2008]. EZH1, как и EZH2, состоит из четырёх гомологичных доменов, и также взаимодействует с основными субъединицами PRC2 – EED, SUZ12, RbAP46/48, и другими белками PRC, которые взаимодействуют с PRC2 комплексом, содержащим EZH2 [Zeng et al., 2011; Margueron et al., 2008]. Несмотря на схожесть между EZH1 и EZH2, считается, что именно EZH2 является основным ферментом триметилирующим H3K27, так как комплекс PRC2 содержащий в себе EZH1 обладает намного меньшей активностью, в сравнении с комлексом PRC2 c EZH2 [Margueron et al., 2008]. Хотя EZH1 на 65% идентичен EZH2 и имеет SET домен, у EZH1 отсутствуют все треониновые остатки имеющиеся у EZH2, которые фосфорилированы циклин-зависимыми киназами и p38. Данные аминокислотные остатки важны для связывания с PRC2 и дальнейшего связывания либо с некодирующими РНК либо с YY1. Таким образом, функциональное различие между EZH2 и EZH1 может быть обусловлено наличием треониновых остатков [Zeng et al., 2011]. N-концевые домены H1 и H2 являются структурными доменами белок белкового взаимодействия, которые необходимы для связывания со вспомогательными субъединицами для полноценного функционирования PRC2. EZH2 связывается с доменами WD40 субъединицы EED через домены H1 и H2. EZH2 также связывается через домены H1 и H2 с различными факторами, такими как ДНМТ и гистон деацитилаза, важными для регуляции экспрессии генов [Margueron et al., 2008].
Иммуногистохимимический анализ
Соответствующие фрагменты проксимального региона промотера человеческого гена ezh2 клонировали в люциферазную репортерную плазмиду pGL2–Basic (Promega, США) используя сайты рестрикции XhoI и HindIII. После лигации соответствующего фрагмента и вектора, производилась трансформация в компетентные клетки E.coli Stbl2 методом теплового шока при 42С в течение 25 секунд. После теплового шока, содержимое реакции переносили в 1 мл S.O.C. среды и инкубировали в течение 90 минут. Затем от 10 до 100 мкл инкубированной среды переносили на чашки со средой LB-агар (2%), содержащей 50 м г/мл ампициллина. После инкубации при 37С в термостате в течение 14 часов, отдельные колонии переносили в 4 мл жидкой среды LB с 50 мг/мл ампициллина, и выращивали при 225 об/мин, 37С в течение 14 часов. После инкубации из 3 мл культуры клеток выделяли п лазмидную ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit. Концентрация полученной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000. Полученную ДНК подвергали рестрикции XhoI и HindIII в реакционном буфере производителя (New England Biolabs, США) при 37С, 30 минут. Содержимое реакции рестрикции смешивали с флуоресцентным красителем ДНК SYBR Safe и анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле на присутствие лигированного фрагмента. Полученные конструкции секвенировали в отделении секвенирования Fox Chase Cancer Center (Филадельфия, США) для исключения ошибок на этапах клонирования. Для получения больших объемов плазмидной ДНК, выращивали культуру в жидкой среде LB содержащей 50 мг/мл ампициллина объемом 250мл в течение 14 часов при 37С, 225 об/мин. Плазмидную ДНК выделяли набором QIAprep Spin Maxiprep Kit согласно рекомендациям производителя (Qiagen, США). Концентрация полученной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000. Используя реагент Lipofectamine 2000 производилась трансфекция 1 мкг полученных плазмид и контрольной PGL2-Basic в исследуемые клеточные линии ЭРЯ согласно рекомендациям производителя (Life Technologies, США). Для контроля эффективности трансфекции исследуемых плазмид параллельно с ними трансфецировали плазмиду pCMV-beta-gal (Clontech, США). Трансфекция производилась при конфлюентности клеток около 30% в 6-луночных чашках. Измерение люциферазной и -галактозидазной активности производили через 48 часов согласно протоколу производителя (Promega, США). Люциферазную активность измеряли на люминометре GloMax (Promega, США), -галактозидазная активность измерялась на спектрофотометре SmartSpec Plus (Bio Rad, США) при длине волны 420 нм. Конечные значения люциферазной активности корректировали относительно -галактозидазной активности.
Иммунопреципитацию хроматина проводили с использованием набора ChIP Assay Kit (Millipore, США) на основе агарозных частиц, согласно рекомендациям производителя. Для ChIP метода использовали клеточные линии ЭРЯ SKOV3, PEO1, OVCAR-5, и нормальные клетки HOSE. Клетки фиксировали в 1% растворе формальдегида, далее подвергали лизису и выделяли геномную ДНК. Полученную ДНК резали ультразвуковым аппаратом (Hielscher, Германия) н а участки размером 300-600 пар оснований, что проверялось методом электрофореза. Разрезанный хроматин инкубировали с антителами anti-NFYA (Santa Cruz, США), anti-p300 (Santa Cruz, США), anti-EZH2 (BD Biosciences, США), anti-histone H3 (Millipore, США), anti-acetylated histone H3 (Millipore, США) в течение 14 часов при 4С. Экстракцию ДНК проводили методом фенол хлороформной экстракции. Далее иммунопреципицированную ДНК амплифицировали путем ПЦР. Для ПЦР амплификации использовали следующие праймеры: для дистального региона промотера ezh2 5 -GTCGGGAGTTCGAGAC 3 и 5 -GTCGGCTCAGCTGTG-3 ; для проксимального региона промотера ezh2 5 CTGTGATTGGACGGGC-3 и 5 -ACTCGCGTTGTTCCC-3 . Результаты визуализировали методом ДНК электрофореза с флуоресцентным красителем SYBR Safe (Life Technologies, США). 2.2.6 Индуцируемая гиперэкспрессия, малые шпильковые РНК, продукция лентивируса и ретровируса. Индуцируемая гиперэкспрессия EZH2 была достигнута с использованием системы Retro-X Tet-On Advanced Inducible Expression System (Clontech, США), и упаковочного вектора pVSVG (Clontech, США), кодирующего белки для сборки вируса, согласно инструкциям производителя. Для продуцирования лентивируса использовали набор Virapower (Life Technologies, США), согласно инструкциям производителя. Клетки ЭРЯ и HOSE, при конфлюентности 40-50 %, инфицировали лентивирусом, кодирующим малые шпильковые РНК (shRNA) к человеческому гену NFYA или вектор-контролем. Инфицированные клетки селекционировались 3 мкг/мл пуромицина. Три shRNA к гену NFYA имели следующую последовательность: 5 -CCATCATGCAAGTACCTGTTT-3 ,
Экспрессия NF-YA положительно коррелирует с экспрессией EZH2 в клетках ЭРЯ человека и прогнозирует более короткую выживаемость у пациентов
Было решено определить связывание NF-YA c проксимальной частью промотора EZH2 в клетках ЭРЯ человека и сравнить с нормальными клетками HOSE. Для анализа был выбран метод иммунопреципитации хроматина (ChIP). В качестве отрицательного контроля использовали IgG. В качестве положительного контроля использовали антитело к гистону H3. Для уменьшения рисков, из-за потенциальных неспецифических эффектов, было решено использовать дистальный регион промотора EZH2, в котором нет NF-YA-связывающих сайтов, в качестве отрицательного контроля (Рисунок 11А). Существуют опубликованные данные, что NF-YA активирует экспрессию целевого гена рекрутируя гистонную ацетилтрансферазу p300 [Hughes et al., 2011; Salsi et al., 2003]. Поэтому было использовано антитело к р 300, чтобы определить наличие связывания р 300 c проксимальной частью промотора EZH2. Действительно, NF-YA и р300 связываются с дистальным участком промотора EZH2 в клетках ЭРЯ (PEO1, SKOV3, OVCAR-5), в отличие от нормальных клеток HOSE. При этом связывание NF-YA и р300 с дистальным участком промотора EZH2, где нет ССААТ сайтов, отсутствует (Рисунок 11Б). Как и ожидалось, связывание р 300 ассоциировано с ацетилированием гистона Н3 в проксимальном участке промотера (Рисунок 11В).
Для оценки специфичности антитела к NF-YA, при его использовании в методе ChIP, мы использовали праймеры к промотору известного целевого гена – CCNA2, который имеет NF-YA связывающие сайты (ССААТ) в своем промоторе, а в качестве отрицательного контроля использовались гены без CCAAT сайтов в промоторах (ubulin, RPS19, YBL1) (Рисунок 12). Для эксперимента использовалась клеточная линия ЭРЯ SKOV3. Результат продемонстрировал связывание NF-YA с целевым промотором CCNA2, но не с промоторами генов, использовавшихся в качестве отрицательного контроля.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что NF-YA и p300 связываются с проксимальным участком промотора EZH2, и это связывание коррелирует с увеличенным уровнем ацетилированного гистона Н3.
Нокдаун NF-YA подавляет экспрессию EZH2 и ингибирует рост клеток ЭРЯ человека in vitro и в ксенографтах Полученные результаты показали, что NF-YA связывается с промотором EZH2 и активирует его экспрессию в клетках ЭРЯ человека. Следовательно, подавление экспрессии NF-YA должно привести к снижению экспрессии EZH2. Чтобы проверить это предположение, были использованы лентивирусы кодирующие три индивидуальных коротких шпильковых РНК к человеческому гену NF-YA (shNF-YA). Оценка эффективности нокдауна NF-YA проводилась при помощи вестерн блота (Рисунок 13). Две из используемых shNF-YA (shNF-YA1, shNF-YA2) продемонстрировали эффективный нокдаун экспрессии NF-YA в клетках ЭРЯ человека (SKOV3, PEO1, OVCAR-5). shNF-YA3 не продемонстрировала нокдауна NF-YA и была использована как отрицательный контроль. При подавлении экспрессии NF-YA так же подавлялась экспрессия EZH2 и маркера ее активности – H3K27me3 (Рисунок 13). Кроме того, такие же результаты были получены и для других клеточных линий с использованием shNF-YA1 – H1299 (рак легких) и MCF7 (рак молочной железы) (Рисунок 14). Уровень триметилированного лизина 9 гистона H3 (H3K9me3), который метилируется другими метилтрансферазами, такими как Suv39H1 и SETDB1 [Jenuwein, 2006], не изменился после нокдауна NF-YA и снижения экспрессии EZH2 в клеточной линии ЭРЯ SKOV3 (Рисунок 13А).
Вестерн блот клеточных линий рака легких (H1299) и рака молочной железы (MCF7) инфицированных лентивирусом продуцирующим shNF-YA1.
Экспрессия EZH2 коррелирует с экспрессией м аркеров клеточной пролиферации [Li et al., 2010]. Нокдаун NF-YA ингибирует экспрессию EZH2 (Рисунок 13, 14), поэтому было решено проверить влияние нокдауна NF-YA на рост клеток ЭРЯ. В сравнении с контролями, 2 shNF-YA, эффективно подавляющих экспрессию NF-YA, ингибировали поверхностно-зависимый и поверхностно -независимый рост клеток ЭРЯ человека (Рисунок 15). При этом shNF-YA3, которая не подавляет экспрессию NF-YA, не смогла супрессировать рост клеток ЭРЯ. Основываясь на полученных результатах, можно утверждать, что нокдаун NF-YA подавляет поверхностно-зависимый и поверхностно-независимый рост клеток ЭРЯ человека in vitro
Следующим этапом было решено проверить эффективность подавления роста опухоли , используя shNF-YA, in vivo в ксенографтной модели. Для ксенографтной модели использовались атимусные (голые) мыши и клеточная линия ЭРЯ SKOV3. Был получен результат, схожий с полученными результатами in vitro: shNF-YA, успешно подавляющие экспрессию NF-YA, ингибировали рост ксенографтных опухолей (Рисунок 16). Таким образом можно сделать вывод, что нокдаун NF-YA ингибирует пост ЭРЯ человека in vivo в ксенографтной модели.
Так как NF-YA регулирует экспрессию EZH2 (Рисунок 7), и нокдаун EZH2 вызывает апоптоз [Li et al., 2010], было решено оценить влияние NF-YA на апоптоз в клетках ЭРЯ человека. Результаты показали увеличение маркеров апоптоза в клетках ЭРЯ после нокдауна NF-YA. Один из таких маркеров – аннексин-V, который определяли с помощью метода Guava Nexin, был увеличен в клетках ЭРЯ с нокдауном NF-YA (Рисунок 17). Вестерн блот показал увеличение маркеров апоптоза – расщепленная каспаза 3 и PARP p85 (Рисунок 18). Проапоптозный ген HRK, который деактивируется при помощи H3K27Me3, играет важную роль в индуцировании апоптоза [Li et al., 2012]. Так как нокдаун NF-YA подавляет экспрессию EZH2 и снижает уровень H3K27Me3, было решено определить влияние нокдауна NF-YA на экспрессию HRK. Результаты показали, что при нокдауне NF-YA в клетках ЭРЯ SKOV3 уровень HRK значительно возрастает (Рисунок 19). Таким образом можно сделать вывод, что нокдаун NF-YA вызывает апоптоз клеток ЭРЯ человека. Рисунок 17. Анализ аннексин-V положительных клеток ЭРЯ SKOV3 после нокдауна NF-YA методом Guava Nexin. A – результаты сортировки и анализа аннексина-V-положительных клеток. Б – графическое отображение результатов.
Ингибирование активности EZH2 в 2D и 3D условиях
В результатах исследований нами было показано, что эктопическая экспрессия NF-YA в нормальных клетках HOSE способна индуцировать экспрессию EZH2 (Рисунок 7). Эктопическая экспрессия NF-YA вызывала гибель клеток HOSE (данные не показаны), что препятствовало дальнейшему исследованию этих клеток. Соответственно нашим наблюдениям, опубликованные ранее результаты сообщают, что эктопическая экспрессия NF YA, вызывает p53-опосредованный апоптоз в нормальных мышиных фибробластах. При этом инактивация p53 частично подавляет апоптоз, вызванный эктопической экспрессией NF-YA [Gurtner et al., 2010]. Действительно, нами тоже была обнаружена активация р 53 (данные не показаны) при эктопической экспрессии NF-YA в нормальных клетках HOSE. Предположительно, инактивация р53 необходима для выживания клеток, экспрессирующих NF-YA. Интересно, что р53 очень часто инактивирован в клетках ЭРЯ [The Cancer Genome Atlas Research Network, 2011]. Исходя их этих данных, можно предположить, что процесс инактивация р53 взаимодействует с NF-YA в клетках ЭРЯ человека. Исходя из последних данных некоторая часть ЭРЯ высокой степени злокачественности может происходить от дистальных эпителиальных клеток фаллопиевых труб [Kurman, Shih, 2010; Levanon et al., 2008]. Поэтому в дальнейшем будет интересно и актуально определить влияние эктопической экспресии NF-YA на экспрессию EZH2 в эпителиальных клетках фаллопиевых труб.
Нами было продемонстрировано, что NF-YA высоко экспрессирован в клетках ЭРЯ (Рисунок 6, 8). Анализ базы данных TCGA (http://cancergenome.nih.gov/) показал, что амплификация гена NF-YA ( 4 копий) встречается очень редко ( 1%). Благодаря этим данным можно предположить, что существуют другие механизмы, отвечающие за гиперэкспрессию NF-YA в ЭРЯ. Кроме того, одной из критических задач является подтверждение эффективности NF-YA как прогностического маркера выживаемости пациентов. Для этого желательно провести анализ независимых когорт.
Мы обнаружили положительную корреляцию экспрессии NF-YA и EZH2 в образцах ЭРЯ человека (Рисунок 9), подтверждая предположение, что NF-YA играет основную роль в регуляции экспрессии EZH2. Однако, коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) был всего 0.56 в образцах ЭРЯ, и 0.64 в образцах ЭРЯ вместе с образцами HOSE. Действительно, исходя из данных литературы и полученных нами результатов люциферазного репортерного анализа, другие факторы, такие как E2F и Elk-1, также играют роль в экспрессии EZH2 [Bracken et al., 2003; Fujii et al., 2011].
В результатах нашего исследования было показано, что EZH2 является геном-мишенью NF-YA (Рисунок 11). Известно, что нокдаун EZH2 вызывает апоптоз в клетках ЭРЯ [Li et al., 2010]. Соответственно, нокдаун NF-YA также вызывает апоптоз в клетках ЭРЯ человека. Однако эктопическая экспрессия EZH2 лишь частично снижает апоптоз при нокдауне NF-YA в клетках ЭРЯ (Рисунок 20). Эти результаты указывают на то , что другие целевые мишени NF-YA участвуют в индуцированном нокдауном NF-YA апоптозе. Действительно, другие проапоптозные факторы, такие как Bcl-xl и Bcl2 регулируются транскрипционным фактором NF-Y [Benatti et al., 2008]. Дальнейшие исследования должны определить остальные гены, способствующие апоптозу при нокдауне NF-YA в клетках ЭРЯ. Благодаря результатам нашей работы можно предположить, что подавление активности NF-YA может являться альтернативной стратегией для ингибирования EZH2 в клетках ЭРЯ, и что NF-YA является перспективной мишенью для разработки терапевтических средств . Также будет интересно оценить эффект известных ингибиторов транскрипционного фактора NF-Y, например GWL-78 [Kotecha et al., 2008], на злокачественные фенотипы клеток ЭРЯ человека.
Как указывалось ранее, подавление экспрессии EZH2 вызывает снижение пролиферации и апоптоз клеток ЭРЯ, в том числе в двумерных (2D) условиях культивирования [Li et al., 2010]. При этом, основная функция EZH2 -триметилирование лизинового остатка 27 гистона H3 (H3K27me3) [Vire et al, 2006]. Несмотря на это, при подавлении активности EZH2 и эффективной супрессии триметилирования H3K27, при помощи специфического ингибитора GSK343, в клетках ЭРЯ в 2D условиях роста не проиходило практически никаких изменений пролиферативной активности или уровня апоптоза. Поэтому можно сделать вывод, что EZH2 обладает другими важными функциями, кроме гистонметилтрансферазной активности.
В нескольких исследованиях влияния ингибиторов EZH2 на клетки крупноклеточной лимфомы была показана зависимость эффективности подавления пролиферации клеток от генетического статуса EZH2 – дикого или мутантного типа. Пролиферация клеток с EZH2 мутантного типа эффективно подавлялась ингибиторами EZH2, в отличие от клеток с EZH2 дикого типа. При этом снижение уровня H3K27me3 было одинаково эффективно, вне зависимости от наличия мутаций в EZH2 [Knutson et al., 2012; McCabe et al., 2012; Qi et al., 2012]. Но, согласно результатам базы данных TCGA (http://cancergenome.nih.gov/), EZH2 мутантного типа не встречается в ЭРЯ.
Наши результаты продемонстрировали, что ингибитор активности EZH2 GSK343 эффективно подавляет пролиферацию клеток и рост ацинусов ЭРЯ в трехмерных (3D) условиях (Рисунок 26, 27). Эти результаты подтверждают ранее описанное влияние EZH2 на внеклеточный матрикс (ВМ), путем подавления экспрессии ферментов, регулирующих состояние ВМ в клет ках рака предстательной железы [Shin et al., 2012; Varambally et al, 2002]. ВМ играет критически важную роль в регулировании опухолевого роста [Ulrich et al., 2009; Wozniak et al., 2003]. Это объясняет эффективность подавления 3D роста клеток ЭРЯ при ингибировании активности EZH2. Кроме того , GSK343 эффективно подавлял инвазивные характеристики клеток ЭРЯ, что было опеределено с помощью классического метода камеры Бойдена (Рисунок 26, 28, 29), При этом уровень миграции клеток остался на исходном уровне (Рисунок 28), что соответствует ранее опубликованным данным, в которых описывается, что при нокдауне EZH2 ингибируется инвазивность клеток ЭРЯ, но не их миграционная активность [Li et al., 2010]. Благодаря полученным результатам можно сделать вывод, что гистонметилтрансферазная активность EZH2 играет критическую роль во взаимодействии между опухолевыми клетками и ВМ, и формировании инвазивного фенотипа клеток ЭРЯ. При этом результаты демонстрируют, что GSK343 эффективно ингибирует активность EZH2 и подавляет инвазивные характеристики клеток ЭРЯ.
В фармокинетических исследованиях было показано, что GSK343 демонстрирует высокий уровень клиренса [Verma et al., 2012], из-за чего в данной работе было решено не исследовать влияние GSK343 in vivo на животных моделях. Поэтому было решено использовать 3D in vitro исследования, которые являются промежуточным вариантом между in vivo исследованиями на животных моделях и стандарным 2D монослойном росте клеток in vitro. Обнаруженная существенная разница в результатах влияния ингибитора активности EZH2, между 2D и 3D условиями роста, указывает на критическую роль выбора модели исследований опухолевого роста. Полученные данные демонстрируют, что ВМ является потенциальной мишенью для терапии опухолей. Они также указывают на то, что GSK343 может являться основой для разработки новых терапий ЭРЯ, которые являются крайне актуальными на сегодняшний день.
Кроме использования специфического ингибитора EZH2, в данной работе также было исследовано влияние биназы (РНКаза Bacillus intermedius) на рост клеток ЭРЯ. Из опубликованных данных известно, что EZH2 о бладает онкогенными свойствами [Karanikolas, 2009]. Также известно, что биназа селективно ингибирует рост опухолевых клеток, экспрессирующих онкогены, такие как RAS, AML-ETO, FLT-ITD и др. [Ilinskaya et al., 2001; Ilinskaya et al., 2007; Mitkevich et al., 2013; Mitkevich et al., 2011]. Поэтому в данной работе, кроме цитотоксического действия, мы также решили определить влияние биназы на уровень экспрессии EZH2.