Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1 Проблема недорепликации ДНК на физических концах хромосом 10
2 Теломерная и свободнорадикальная теории старения 11
3 Теломеры: структура и функции 16
3.1 Нуклеотидная последовательность и структура теломер 16
3.2 Длина теломер 19
3.3 Белки, связанные с теломерами 23
3.3.1 Теломераза 23
3.3.2 Белок POT1, связывающийся с одноцепочечной теломерной ДНК 24
3.3.3 Белок TRF2, связывающийся с двуцепочечной теломерной ДНК 4 A. thaliana как модельное растение для изучения длины теломер 30
5 Факторы, влияющие на установление и поддержание видоспецифичной длины теломер 35
5.1 Регуляция длины теломер с помощью биохимической активности теломер-связывающих белков 35
5.2 Регуляция длины теломер с помощью факторов окружающей среды, окислительного стресса и стиля жизни 36
5.3 Регуляция длины теломер между популяциями одного вида за счет генетических факторов 37
6. Рекомбинантные инбредные линии с множественными родительскими экотипами 39
Экспериментальная часть 48
Материалы и методы 48
1 Экотипы растений A. thaliana, условия их роста 48
2 Клонирование генов POT1 из A. cepa и TRFL1 из A. officinalis 49
3 Трансформация клеток E. coli 50
4 Экспрессия белка 50 5 Электрофорез в полиакриламидном геле 51
6 Вестерн блот 52
7 Очистка белка 53
8 Изучение ДНК-связывающей активности белков POT1 и TRFL1 c одноцепочечными и двухцепочечными теломерными ДНК-субстратами 53
9 Анализ влияния абиотических факторов среды на изменение длины теломер 55
9.1 Изучение влияния засухи на длину теломер в растениях 55
9.2 Изучение влияния недостатка фосфора на длину теломер в растениях 10 Выделение геномной ДНК растений 56
11 Электрофорез ДНК 57
12 Анализ длины теломер методом рестрикции концевых фрагментов хромосом (TRF) 60
12.1 Нерадиоактивный метод визуализации теломерного сигнала 60
12.2 Радиоактивный метод визуализации теломерного сигнала 61
13 Анализ длины теломер с помощью амплификации теломерных повторов ПЦР-методом PETRA 61
14 Биоинформатический метод обработки данных, полученных при помощи метода рестрикции концевых участков хромосом 63
15 Картирование локусов количественных признаков, отвечающих за контроль длины теломер 64
16 Метод анализа генов-кандидатов 64
17 Генотипирование 65
18 Полимеразная цепная реакция 67
19 Скрещивание растений и получение двойных мутантов 67
20 Анализ изменения длины теломер в разных поколениях мутантных растений 68
21 Статистическая обработка данных 68
Результаты 69
1 Изучение биохимических свойств и субстратной специфичности белка POT1 из лука 69
2 Изучение биохимических свойств и субстратной специфичности белка TRFL1 из спаржи (A. officinalis) 80
3 Анализ внутривидового полиморфизма длины теломер A. thaliana 85
3.1 Сравнительный анализ длины теломер 19 родительских экотипов рекомбинантных инбредных линий MAGIC 85
3.2 Вариабельность длины теломер у различных растений одного экотипа 86
4 Влияние факторов роста на длину теломер растений A. thaliana 88
4.1 Влияние засухи на длину теломер A. thaliana 89
4.2 Влияние различных источников фосфора на длину теломер 90
5 Картирование в рекомбинантных инбредных линиях MAGIC локусов количественных признаков, влияющих на длину теломер 95
6 Биоинформатический анализ, выбор генов-кандидатов 100
7 Генотипирование Т-ДНК мутантов для идентификации гомозиготных растений 103
8 Анализ длины теломер в мутантных растениях 105
9 Дополнительное подтверждение укорочения длины теломер в мутантах по гену nop2a 109
10 Анализ изменения длины теломер в разных поколениях мутантных растений по гену nop2a 112
Обсуждение результатов 114
1 Биохимическая активность теломер-связывающих белков POT1 и TRF1 114
2 Факторы окружающей среды и условия роста 118
3 Идентификация нового генетического фактора, влияющего на внутривидовую вариацию в длине теломер 120
Заключение 126
Список литературы 128
- Белок POT1, связывающийся с одноцепочечной теломерной ДНК
- Изучение биохимических свойств и субстратной специфичности белка POT1 из лука
- Картирование в рекомбинантных инбредных линиях MAGIC локусов количественных признаков, влияющих на длину теломер
- Идентификация нового генетического фактора, влияющего на внутривидовую вариацию в длине теломер
Введение к работе
Цель работы - идентифицировать и охарактеризовать биохимические и генетические факторы, а также факторы окружающей среды, контролирующие полиморфизм длины теломер в модельных растениях.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Определить особенности субстратной специфичности и биохимической активности ДНК-связывающих белков растений на примере теломерных белков POT1 Allium cepa и TRFL Asparagus officinalis.
-
Оценить влияние абиотических факторов и условий роста на длину теломер модельных растений Arabidopsis thaliana.
-
Выяснить особенности распределения длины теломер в рекомбинантной инбредной популяции A. thaliana.
-
Определить количественные локусы признаков, отвечающие за регулирование длины теломер в растениях.
-
Выявить гены, регулирующие длину теломер в растениях.
Научная новизна.
Научная новизна работы заключается в том, что обнаружены различия в
субстратной специфичности белка POT1 из A. cepa. Показано, что минимальным
сайтом связывания белка POT1 с субстратом теломер растительного типа является
олигонуклеотид TTTAGGG. При изменении теломерного субстрата на
человеческий тип, минимальным сайтом связывания становится субстрат,
состоящий из 18 нуклеотидов. Общим свойством для обоих типов субстратов для
успешного связывания с POT1 из A. cepa является наличие не менее двух G на 3’-
конце субстрата. Субстратная специфичность белка TRFL1 из A. officinalis
меняется в зависимости от нуклеотидного состава теломерного субстрата.
Минимальным сайтом связывания для растительного субстрата является
последовательность нуклеотидов TAGGGTTTA, а для человеческого субстрата –
ТTAGGGТTAGGG. Впервые показано, что стрессовые условия, такие как
дефицит влаги и фосфора, не оказывают значимого эффекта на изменение длины
теломер A. thaliana. Впервые охарактеризована длина теломер рекомбинантной
инбредной популяции MAGIC, для которой характерно нормальное
распределение данного признака. Впервые обнаружено участие гена nop2a в регуляции длины теломер A.thaliana.
Практическая значимость работы
Практическая значимость работы заключается в том, что получены новые знания о взаимосвязи изменений теломерной последовательности и свойств теломерных белков, а также длины теломер и факторов окружающей среды. Выяснение этих закономерностей позволит разработать новые подходы для адаптации организмов к стрессам, актуальные для решения практических задач в медицине и сельском хозяйстве.
Положения, выносимые на защиту:
1. Белки клонированных генов pot1 и trfl1 A. cepa и A. officinalis обладают
способностью связываться с теломерной ДНК как растительного, так и
человеческого типа.
-
Абиотические факторы окружающей среды не оказывают значимого влияния на длину теломер растений A. thaliana.
-
Инактивация эволюционно-консервативного гена nop2a A. thaliana вызывает у растений уменьшение длины теломер.
Степень достоверности результатов исследований подтверждается
многократными экспериментами, проведенными с соблюдением методик, имеющих мировые стандарты; анализ результатов проводили на современном высокоточном оборудовании и с использованием методов статистической обработки данных; результаты обсуждались на многочисленных научных
конференциях с ведущими специалистами в данной области; результаты опубликованы в зарубежных научных изданиях, рецензируемых ведущими учеными в данной области. Эксперименты проводились и подтверждались в России (Казанский Федеральный Университет) и в Америке (Техасский институт сельского хозяйства и механики, Техасский университет) во время зарубежных стажировок в рамках программы повышения конкурентоспособности КФУ.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на
Международных, Всероссийских и региональных конференциях: V Съезде
биохимиков России (Дагомыс, 2016), Конгрессе Федерации европейских
биохимических обществ (FEBS, Турция, 2016), Всероссийском научном форуме
«Наука будущего – наука молодых» (Казань, 2016), Молодежной научной
конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и
ветеринарии», РАСН, Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии» (Иркутск, 2015), Всемирном съезде ученых в области теломерной биологии Telomeres and Telomerase (США, CSHL, 2015).
Связь с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности «Казанского (Приволжского) федерального университета» среди ведущих мировых научно–исследовательских центров, на базе Open Lab «Микробные биотехнологии». Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ №15-04-01645а и РФФИ № 16-08-00583а, а также за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект №14-83 0211/02.11.10083.001).
Личный вклад автора заключается в разработке, планировании, организации и реализации экспериментального решения поставленной проблемы, а также в интерпретации результатов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 4 статьи, 2 тезиса в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов диссертации, 1 публикация перечня РИНЦ.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение и список литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 33 рисунка. Библиография содержит 213 наименования статей российских и зарубежных авторов.
Белок POT1, связывающийся с одноцепочечной теломерной ДНК
У большинства эукариот белок POT1 (protection of telomeres 1) является основным белком, связывающимся с одноцепочечным участком теломерной ДНК. POT1 участвует в контролировании длины теломер, защите концевых участков хромосом и в передаче сигнала о повреждении ДНК [Xin et al., 2008]. Структурно POT1 обладает двумя N-концевыми олигонуклеотид/олигосахарид связывающими складчатостями (OB-складчатостями) [Mitton-Fry et al., 2002]. Согласно кристаллической структуре POT1 человека и дрожжей, консервативные участки OB-складчатостей контактируют с 3 -концом теломерной ДНК [Lei et al., 2004]. С-конец POT1 при этом должен взаимодействовать с TPP1, другим компонентом шелтериновой системы. POT1 также играет важную роль в регуляции длины теломер [Nergadze et al., 2009].
Члены семейства POT1 белков широко распространены среди высших и низших эукариот [Baumann et al., 2002]. Несмотря на высокую консервативность последовательности, их функции могут сильно различаться. Например, если у большинства позвоночных существует единственный pot1 ген, то у мышей существует два разных гена pot1а и pot1b, которые выполняют частично перекрывающиеся функции [Hockemeyer et al., 2006]. Caenorhabitis elegans, Euplotes crassus и Tetrahymena thermophilus также обладают по меньшей мере двумя POT1-подобными белками, у которых функции и количество связывающихся с ними белков отличается от ситуации с POT1 млекопитающих [Raices et al., 2008]. Так, например, белок CeOB-2 из C. elegans связывается с одноцепочечным теломерным субстратом, богатым цитозином, а не гуанином [Raices et al., 2008].
POT1-подобные белки были идентифицированы в Arabidopsis и других растениях [Baumann et al., 2002, Kuchar and Fajkus 2004, Shakirov et al., 2005]. В A. thaliana обнаружены 2 высоко дивергентных паралога, AtPOT1a и AtPOT1b, которые обладают на 50% схожим аминокислотным составом [Shakirov et al., 2005]. В растениях со сверхэкспрессией Atpot1b наблюдается эрозия теломерных концов и слипание хромосом [Shakirov et al., 2005]. Инактивация гена Atpot1a приводит к уменьшению активности теломеразы in vivo, а также к прогрессирующему укорочению теломер с каждым последующим поколением растений [Surovtseva et al., 2007]. AtPOT1a физически связывается с теломеразой [Surovtseva et al., 2007].
Для связывания ДНК некоторым POT1 белкам необходимо, чтобы теломерная последовательность находилась на 3 - конце ДНК субстрата [Azzalin et al., 2007]. Некоторые другие белки POT1, наоборот, предпочитают связываться с теломерной последовательностью, если она расположена на 5 -конце или даже в середине ДНК олигонуклеотида [Caslini et al., 2009; Cusanelli et al., 2013]. Предположительно, в условиях in vivo такие белки способны взаимодействовать с теломерной последовательностью в контексте Т-петли. У большинства известных к настоящему времени белков POT1 минимально необходимой для связывания длиной теломерной ДНК (minimum binding site, MBS) является последовательность из 10-12 нуклеотидов, что приблизительно соответствует длине двух теломерных повторов [Yehezkel et al., 2008; Arnoult et al., 2012].
Биохимические сходства и различия между ДНК-связывающими свойствами POT1 белков из кукурузы (Zea mays) и спаржи (A. officinalis) могут служить ключом к разгадке удивительного феномена – ко-эволюции нуклеотидной последовательности теломерной ДНК и биохимических свойств теломер-связывающих белков в растениях отряда Asparagales. Так, например, для успешного связывания теломерной ДНК белок POT1b из кукурузы требует наличия одного полного теломерного повтора TTTAGGG, в то время как для POT1 белка из спаржи необходимо наличие сходной, но более длинной последовательности из 9 нуклеотидов GG(G/T)TAGGG, в которой третий с 5 -конца нуклеотид может быть как G, так и Т [Shakirov et al., 2009]. Поскольку естественной последовательностью теломерной ДНК в спарже является именно повтор TTAGGG (а не ТTTAGGG, как у кукурузы и большинства других растений), эти данные позволяют предположить, что наличие двух дополнительных нуклеотидов в MBS POT1 белка из спаржи позволяет ему связываться одинаково эффективно как со стандартной растительной теломерной последовательностью GGТTTAGGG, так и с изменившейся в процессе эволюции растений отряда Asparagales последовательстью GGGTTAGGG [Shakirov et al., 2009].
В отличие от большинства других представителей отряда Asparagales, растения рода Allium обладают еще более необычной теломерной последовательностью. Она характеризуется очень длинными повторами CTCGGTTATGGG [Fajkus et al., 2016], включающими в себя необычные для теломерной ДНК цитозины. Таким образом, предок растений рода Allium очевидно претерпел еще одну мутацию, изменившую Asparagales-специфичную последовательность TTAGGG на Allium-специфичную последовательность CTCGGTTATGGG. Очевидно, что биохимические свойства POT1 белков в Allium должны были коренным образом измениться, чтобы позволить этим белкам связываться с такой необычной для растений теломерной последовательностью. Однако, в отличие от POT1 белков других представителей отряда Asparagales, биохимические свойства POT1 белков представителей рода Allium никогда раньше не изучались.
Связывание с нетипичными теломерными последовательностями не является уникальным свойством растительных POT1 белков. Так, теломерный белок OnTEBP из простейшего Oxytricha nova способен связываться с чужеродными теломерными последовательностями с помощью индуцированных конформационных изменений в ДНК олигонуклеотидах, при которых один или несколько нуклеотидов могут полностью исключаться из взаимодействия между белков и ДНК субстратом [Zhou et al., 2009]. POT1 белки человека, кур и S. pombe способны взаимодействовать с нетипичными теломерными последовательностями in vitro [Azzalin et al., 2007; Caslini et al., 2009; Shamovsky et al., 2006]. В целом, не очень строгая субстратная специфичность может являться широко распространенным свойством белков POT1. Такое слабое сродство к теломерному субстрату может оказаться весьма благоприятным признаком для организмов, в которых частые ошибки теломеразы приводят к синтезу большого количества неправильных теломерных повторов [Dai et al., 2007], а также как механизм выживаемости видов в случае мутаций в кодирующей РНК субъединице теломеразы, как это, предположительно, произошло в случае с предками отряда Asparagales .
Изучение биохимических свойств и субстратной специфичности белка POT1 из лука
Относительно недавнее по эволюционным меркам ( 90-100 миллионов лет назад) изменение теломерной последовательности у представителей отряда Asparagales с типичной для растений TTTAGGG на более характерную для позвоночных животных TTAGGG (рисунок 8) представляется очень интересным как с эволюционной точки зрения, так и с точки зрения адаптации растений к такой неожиданной мутации.
Поскольку теломеры играют чрезвычайно важную роль в росте и развитии всех эукариотических организмов, изменение теломерной последовательности у предка большинства растений отряда Asparagales наверняка должно было вызвать генотоксичный стресс и связанные с этим процессы разбалансировки репликации ДНК, поддержания стабильности генома и регуляции длины теломер. Однако тот факт, что отряд Asparagales представляет собой одну из наиболее успешных в эволюционном плане группу растений с очень богатым видовым разнообразием (более 25000 известных видов или около 10% всех видов цветковых растений), позволяет предположить, что предки растений этого отряда смогли достаточно быстро и эффективно приспособиться к изменению теломерной последовательности. Предположительно, такие адаптационные изменения в биологии растений должны были включать в себя изменения в биохимической активности теломер-связывающих белков, что позволило им успешно взаимодействовать с мутированной теломерной последовательностью. В связи с этим, представляется особенно важным изучить ДНК-связывающие свойства белков POT1 и TRFL, выделенных из растений этой группы, чтобы понять, как их биохимическая активность менялась с течением времени и какие эволюционные механизмы могут быть использованы растениями для адаптации к изменившимся условиям. Предположительно, такие адаптации включают в себя ко-эволюцию биохимических свойств этих теломер-связывающих белков, позволившую им эффективно взаимодействовать с нестандартной теломерной последовательностью.
Нуклеотидную последовательность гена pot1 из лука A. cepa идентифицировали с помощью поиска BLAST в банке данных NCBI, используя алгоритм поиска сходства последовательностей из A. cepa с нуклеотидной последовательностью гена pot1а из A. thaliana [Shakirov et al., 2005]. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности POT1 из A. cepa представлены на рисунке 9. кДНК получали, как описано в Материалах и Методах, и клонировали в вектор pET28a. Для изучения биохимических свойств POT1 из A. cepa этот белок экспрессировали в E. сoli. Экспрессию индуцировали добавлением имидазола. Клетки без добавления имидазола использовали как контроль. Как показано на рисунке 9, панель А, в контрольных клетках экспрессии не наблюдалось. При добавлении 250 и 500 микромолей имидазола экспрессия наблюдалась визуально при окрашивании Кумасси приблизительно на одном уровне. При этом большая часть рекомбинантного белка обнаруживалась в осадке (нерастворимая фракция), но часть белка была в растворимом виде и обнаруживалась в супернатанте. При этом увеличение концентрации имидазола до 1000 микромолей приводило к выпадению всего экспрессируемого белка в осадок. В связи с этим, для всех дальнейших экспериментов экспрессию проводили с добавлением 250 микромолей имидазола.
Для подтверждения того, что наблюдаемый в растворимом виде белок действительно является POT1 из A. cepa, проводили вестерн-блоттинг с помощью антител к пептидному Т7-тагу, добавленному к N-концу рекомбинантного белка. Как показано на рисунке 9, панель Б, наблюдавшийся нами экспрессируемый белок действительно является POT1 из лука, поскольку специфически обнаруживается на вестерн блоттинге и обладает правильной молекулярной массой (42 кДа).
A. cepa связываться с одноцепочечной теломерной ДНК, мы проводили инкубирование разных концентраций экспрессированного белка с теломерным субстратом. Полученные нуклеопротеиновые комплексы разделяли на полиакриламидном геле в нативных условиях. На рисунке 10 показано связывание белка POT1 из лука с пятью повторами TTTAGGG. Связывание ДНК белком происходит при минимальной использованной концентрации белка 0.15 мкM (комплекс I). При увеличении концентрации белка наблюдается образование не одного, а двух связанных комплексов белок-ДНК, бегущих по гелю с разной скоростью. Предположительно, более быстро бегущий на геле комплекс белок-ДНК (в нижней части геля, комплекс I) представляет собой комплекс белок: ДНК в стехиометрии 1:1, в то время как более медленно бегущий по гелю, то есть более тяжелый комплекс (в верхней части геля, комплекс II) представляет собой комплекс белок: ДНК в стехиометрии 2:1. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что белок POT1 из A. cepa способен связывается с пятью повторами растительного типа TTTAGGG.
Далее был проведен конкурентный анализ связывания белка POT1 из A. cepa с другими ДНК и РНК олигонуклеотидами (рисунок 11), в частности, с теломерной последовательностью большинства позвоночных TTAGGG, с неспецифичной последовательностью ДНК (AATGGGAGAGTATCCGCCGCAAGATCTAGTGCAAT) и с имитирующей теломерную последовательностью РНК, (UUUAGGG)5. В данном эксперименте оценивалась специфичность связывания белка POT1 из A. cepa с последовательностью TTTAGGG по сравнению с другими теломерными или нетеломерными последовательностями. Поскольку настоящий сиквенс теломерной последовательности лука A. cepa был установлен после того, как нами были проведены описываемые здесь исследования [Fajkus et al., 2016], способность белка POT1 из A. cepa взаимодействовать с последовательностью CTCGGTTATGGG не изучалась.
На рисунке 11 показано, что белок POT1 из A. cepa, как и следовало ожидать, эффективно связывается с меченой теломерной ДНК растительного типа (TTTAGG)5, образуя два медленно мигрирующих на геле комплекса (дорожка 2 на рисунке). При добавлении к реакции 100-кратного избытка немеченой, т.е. «холодной», теломерной ДНК той же последовательности (TTTAGGG)5, интенсивность сигнала, соответствующего образованию обоих комплексов, уменьшается вдвое (дорожка 3 на рисунке). При добавлении в реакционную смесь 100-кратного избытка «холодной» неспецифической (т.е. нетеломерной по сиквенсу) ДНК, наблюдаемая интенсивность сигнала на геле практически не отличалась от без конкурентного контроля (дорожка 4 на рисунке). Таким образом, белок POT1 из A. cepa практически не связывается с нетеломерной ДНК. Для того, что бы установить, способен ли белок POT1 из A. cepa связываться с РНК-последовательностью теломерного типа, в реакционную смесь добавляли 100-кратный избыток «холодного» РНК-олигонуклеотида (UUUAGGG)5. При этом наблюдалось снижение интенсивности сигнала на геле на 20% по сравнению с безконкурентным контролем, что говорит о том, что исследуемый белок способен в некоторой степени связываться с имитирующей теломерную ДНК последовательностью РНК. Далее с помощью конкурентного анализа изучалась способность белка POT1 из A. cepa связываться с теломерной последовательностью большинства позвоночных TTAGGG. При добавлении в реакционную смесь 100-кратного избытка «холодного» ДНК олигонуклеотида (ТТAGGG)5 наблюдалось незначимое снижение сигнала, что свидетельствует о том, что изучаемый белок способен связываться с теломерными повторами человеческого типа ТТАGGG в гораздо меньшей степени, чем с повторами растительного типа TTTAGGG. Таким образом, показано, что из всех изучавшихся ДНК и РНК субстратов белок POT1 из A. cepa обладает наибольшим сродством к теломерной последовательности растительного типа TTTAGGG.
Следующей целью нашего исследования явилось определение минимального сайта связывания (MBS) белка POT1 из A. cepa с теломерным субстратом растительного типа. Для этого в эксперименте были использованы меченые ДНК олигонуклеотиды, состоящие как из двух полных повторов TTTAGGG, так и более короткие теломерные последовательности, уменьшенные последовательно на один нуклеотид с 3 - и 5 -концов (рисунок 12).
Картирование в рекомбинантных инбредных линиях MAGIC локусов количественных признаков, влияющих на длину теломер
Рекомбинантные инбредные линии MAGIC A. thaliana являются удобной модельной системой, с помощью которой можно провести картирование количественных признаков для определения участков хромосом, на которых располагаются гены, участвующие в регуляции длины теломер. Была проведена оценка наследуемости признака длины теломер в рекомбинантных инбдредных линиях MAGIC (рисунок 23). Длина теломер у нескольких растений (биологические повторы) одних и тех же MAGIС линий проанализирована с использованием Саузерн блот метода. Чтобы оценить техническую погрешность метода, проведен повторный гельэлектрофорез тех же образцов (технические повторы). Произведен расчет наследуемости. Наследуемость — доля фенотипической изменчивости в популяции, обусловленная генетической изменчивостью (в данном случае, в отношении к длине теломер). Поскольку различия между индивидуумами могут быть обусловлены генетическими факторами и/или окружающей средой, наследуемость анализирует примерное отношение влияния генетических и негенетических факторов на общее отклонение фенотипа в популяции. В частности, при наследуемости, равной 1, фенотипическая изменчивость обусловлена только генетическими различиями. Наследуемость высчитывали по формуле h2 = VG/VE+VG, где VG - – дисперсия признака, обусловленная генетическими факторами, и VE – дисперсия признака, обусловленная факторами окружающей среды. Согласно полученным данным, наследуемость признака длины теломер составляла 0.87. Таким образом, в подтверждение выводов о минимальном влиянии условий роста растений, генетические факторы играют наиболее существенную роль в формировании признака длины теломер в растениях A. thaliana.
Для картирования рекомбинантных инбредных линий MAGIC A. thaliana нами была выделена ДНК из 480 линий MAGIC и проведен Саузерн блот анализ для сравнительной характеристики длины теломерной ДНК (рисунок 23). Основная часть MAGIC линий обладали теломерами в диапазоне от 2.5 т.п.о. до 4.2 т.п.о. Теломерами в диапазоне выше 4.2-8 т.п.о. и ниже 2.5 т.п.о. обладает минимальная часть линий MAGIC (рисунок 23).
Данные Саузерн блот анализа были обработаны и переведены в числовые данные средних значений длины теломер для биоинформатического анализа с помощью программы TeloTool [Gohring et al., 2014]. QTL-анализ был проведен с помощью программного обеспечения R/qtl путем комбинации методов картирования интервалов и геномного сканирования, что позволило смоделировать хромосомы каждой индивидуальной рекомбинантной инбредной линии как мозаику из известных гаплотипов родительских экотипов и оценить ее вероятностно. Полногеномный критический порог значения ошибки первого рода был установлен в пределах =0.05 для тестирования статистической значимости результатов. При использовании доверительного интервала в 92.5% нам удалось обнаружить два QTL-пика: на хромосомах 5 и 1. Как показано на рисунке 24, QTL основного эффекта находится на хромосоме 5. Интервал этого участка на хромосоме 5 составляет примерно 848 кб.
QTL пик (содержащий локус количественных признаков основного эффекта), обнаруженный на хромосоме 5, объясняет 47.1% от общей вариабельности длины теломер, которая присутствует в популяции MAGIC. Обнаруженный нами участок хромосомы 5 не содержит ни одного из ранее известных генов, участвующих в теломерной биологии. Таким образом, нами было сделано предположение, что на этом участке хромосомы велика вероятность обнаружения нового, ранее не известного, гена, участвующего в регуляции длины теломер. С использованием биоинформатических методов было показано, что гаплотип внутри QTL пика на хромосоме 5, вызывающий увеличение длины теломер, наследуется от экотипа Sf-2 (рисунок 25). Таким образом, Sf-2 специфичный генотип на хромосоме 5 ответственен за значимое увеличение длины теломер в унаследовавших его линиях MAGIC (рисунок 25).
Рекомбинантные инбредные линии MAGIC, несущие Sf-2 аллель в QTL диапазоне на хромосоме 5, обладают на 50% более длинными теломерами по сравнению с остальными 18 аллелями. Kn-0, Col-0, Ler-0, Ct-1, Zu-0, Po-0, No-0, Tsu-0, Wu-0, Edi-0, Hi-0, Wil-2, Can-0 Bur-0, Ws-0, Rsch-4, Mt-0, Oy-0, Sf-2 – родительские экотипы популяции рекомбинантных инбредных линий MAGIC.
Идентификация нового генетического фактора, влияющего на внутривидовую вариацию в длине теломер
Структура теломер одинакова у большинства растений и состоит из множественных повторов короткой нуклеотидной последовательности TTTAGGG [Fuchs et al., 1995]. Согласно литературным данным длина теломер значимо отличается у разных видов растений. Так, например, в экотипе Col-0 растения A. thaliana длина теломер варьировала в пределах от 2 до 5 кб [Richards, Ausubel 1988], а в растениях табака теломеры намного длиннее и достигают 150 кб [Fajkus et al., 1995]. Факторы, влияющие на внутривидовую вариацию в длине теломер, могут быть идентифицированы с помощью различных геномных методов, включая определение фокусов количественных признаков (QTL-картирование) и полногеномный поиск ассоциаций.
Несколько более ранних полногеномных исследований позволили идентифицировать локусы в геноме человека, отвечающие за естественную вариабельность теломер. В частности, были определены гены terc, tert, naf1, obfg1 и rtel [Mangino et al., 2012, Codd et al., 2010, 2013, Levy et al., 2010]. Наиболее эффективно такие полногеномные методы зарекомендовали себя в растениях. В 2011 году сотрудники лаборатории профессора Hank Bass из государственного университета Флориды опубликовали статью в журнале Genes Genomes Genetics с описанием своих работ по определению QTL, контролирующих длину теломер в рекомбинантных инбредных линиях кукурузы [Brown et al., 2011]. Хотя авторам этого исследования и удалось указать на наличие нескольких предполагаемых QTL, дальнейший генетический анализ причинных факторов оказался затруднен тем, что идентификация индивидуальных генов-кандидатов в кукурузе требует все еще слишком больших усилий. В связи с этим, авторы прямо указали, что дальнейшее изучение гомологичных генов следует проводить в более подходящей модельной системе, в частности, в A. thaliana [Brown et al., 2011]. Несколько лет назад группа профессора Карла Рихи разработала программное обеспечение TeloTool, необходимое для качественного и количественного анализа длины теломер в A. thaliana [Gohring et al., 2014]. Используя этот метод, его группа в 2014 году провела полногеномный анализ ассоциаций в 229 экотипах A. thaliana [Fulcher et al., 2015]. Этот метод позволил идентифицировать два больших участка, которые влияют на длину теломер. На одном из таких участков расположен ген pot1а A. thaliana, [Surovtseva et al., 2007]. Кроме того, в той же опубликованной работе в случае RIL популяций Pro-0 х Col-0, Est1 х Col-0 и Cvi-0 х Ler-2 были найдены несколько новых QTL (рисунок 33). Два из этих локусов были в дальнейшем подтверждены с помощью сканирования изогенных линий NIL. Несмотря на то, что в этой работе авторам действительно удалось получить доказательства значимого влияния генетических факторов на признак длины теломер, мощность их метода анализа оказалась недостаточной для точного определения геномных участков, влияющих на теломерный фенотип, и для определения молекулярной идентичности предполагаемых локусов. По-видимому, такой недостаток работы был вызван использованием не совсем подходящей выборки популяций растений со слишком большим процентным соотношением близкородственных экотипов из Швеции, не обладающих достаточным генетическим разнообразием и существенной естественной вариацией в длине теломер [Fulcher et al., 2015].
Популяция MAGIC A. thaliana представляют собой гораздо более подходящую систему для идентифицирования причинных генов. Согласно полученным нами результатам, в растениях родительских экотипов линий MAGIC длина теломер составляла от 2.6 до 4.6 т.п.о. Большинство родительских экотипов линий MAGIC по длине теломер могут быть отнесены к двум популяциям: экотипы с относительно длинными теломерами (3,5-4 т.п.о.) (к таким экотипам относятся Edi-0, Hi-0, Wil-2, Can-0, Bur-0, WS-0, Rsch-4), и экотипы с относительно короткими теломерами (2.75-3 т.п.о., к таким экотипам относятся Kn-0, Ler-0, Ct-1, Zu-0, Po-0, No-0). Кроме того, если разница в длине теломер между экотипами могла достигать 2 т.п.о., то внутри одного и того же экотипа длина теломер индивидуальных растений варьировала на 100-500 п.о. В 2004 году в лаборатории Дороти Шиппен было проведено исследование, в рамках которого рассматривалась вариабельность длины теломер в различных экотипах A. thaliana [Shakirov et al., 2004]. Длина теломер в экотипах Col-0 колебалась от 2 до 5 т.п.о. Теломеры в экотипе Ws-0 были более длинными и более вариабельными, их длина колебалась от 3.5 до 8 т.п.о. Среди всех исследованных ранее экотипов [Shakirov et al., 2004] нижние и верхние границы длины теломер были 2 т.п.о. и 9 т.п.о. Например, длина теломер в экотипах Tsu-0, Ber и Kas была такой же, как и у Col-0, и составляла от 2 до 4 т.п.о. Теломеры в экотипах Be-0 (3-6 т.п.о.), Van-0 (2.7-8 т.п.о.) и Nd-0 (3.5-9 т.п.о.) были немного длиннее. При более детальном изучении исследователи [Shakirov et al., 2004] установили, что среди всех экотипов Col-0 обладает наиболее стабильными теломерами, и их длина колеблется в диапазоне от 2 до 4 т.п.о. Похожие результаты ранее были получены для экотипа Ler-0 [Richards et al., 1992].
В проведенных нами экспериментах было показано, что длина теломер в одном из родительских экотипов популяции MAGIC, Sf-2, в два раза длиннее, чем в экотипе Col-0 (эталонный экотип, используемый в большинстве молекулярно-генетических экспериментов для получения и анализа нокаутов и других мутаций). На основании проведённого нами QTL-анализа, мы предполагаем, что естественная вариация в последовательности гена nop2a во многом ответственна за возникновение той разницы в длине теломер, что наблюдалась между экотипами Sf-2 и Col-0. В соответствии с нашей гипотезой, наследование растениями популяции MAGIC редкого варианта (аллеля) гена nop2a, характерного только для экотипа Sf-2, приводит к увеличению длины теломер на 50%. Нами показано, что нокауты по гену nop2a (в геноме эталонного экотипа Col-0) обладают более короткими по сравнению с диким типом (Col-0) теломерами (уменьшение длины теломер на 30%). Таким образом, нами было обнаружено, что в регуляции длины теломер участвует ген nop2a, который принимает участие в контроле размера листовой пластины в A. thaliana [Fujikura et al., 2015]. В настоящее время известно несколько генов, контролирующих размер листьев, при морфогенезе листа данные гены участвуют в контроле генов пролиферации и/или постмитотического роста клетки. В A. thaliana к белкам или пептидам, усиливающим клеточное пролиферирование в листьях, относятся AINTEGUMENTA (ANT), ARGOS, коактиватор транскрипции ANGUSTIFOLIA3 (AN3), JAGGED (JAG), STRUWWELPETTER и KLUH [Mizukami, Fisher 2000, Ohno et al., 2004].
После окончания митоза клетки переходят к дифференциации, а в некоторых типах клеток происходит эндоредупликация ДНК. В мутантах, дефектных по клеточной пролиферации, таких как an3, ant, fugu, swp, количество клеток в листе снижается значительно, но размер таких клеток больше, чем в норме. Этот феномен называется «компенсационный синдром» [Mizukami, Fischer 2000, Autran et al., 2002, Ferjani et al., 2007]. Объяснение данного процесса заключается в том, что регулирование роста клетки и её деления разобщены. Так, мутанты по генам oligocellula 1-7 (oli1-oli7, включая oli2/nop2a) обладают меньшими листьями по сравнению с диким типом, однако величина клеток при этом не изменена [Horiguchi et al., 2005]
Проведенные нами эксперименты с нокаутами позволили однозначно установить, что, помимо существенного уменьшения клеточной пролиферации, инактивация гена nop2a/oli2 приводит к укорочению длины теломер, причем длина теломер резко стабилизируется на более коротком по сравнению с диким типом уровне. Как ранее было показано, гомологи гена nop2a в геномах человека и дрожжей являются жизненно важными генами, и их делеция несовместима с жизнью [Bourgeois et al., 2015]. Однако, в случае A. thaliana инактивация гена nop2a, хоть и сопровождается уменьшением общего количества клеток в листьях и проблемами с поддержанием правильной длины теломер, не приводит к немедленной смерти растений. Известно, что растения в целом отличаются удивительной пластичностью генома и уникальной способностью переносить инактивацию генов, чья делеция у животных приводит к неминуемой смерти [Vespa et al., 2005, Surovtseva et al., 2009]. Еще одной гипотезой, объясняющей жизнеспособность растений-нокаутов по nop2a, является наличие в геноме A. thaliana еще двух генов-паралогов nop2a. Эти гены в геноме аннотированы как nop2-like: nol1 (номер гена AT3G13180) и nop2b (номер гена At4g26600). Вероятно, жизненно важные функции гена nop2, присутствующего в единственной копии в геномах дрожжей, человека и других позвоночных, в геноме A. thaliana распределены между тремя генами-паралогами, так что инактивация одного гена nop2a не приводит к немедленной смерти растений. В связи с этим можно сделать вывод, что A. thaliana отличается от многих других эукариот тем, что в его геноме, по-видимому, произошло разделение функций изначально однокопийного гена nop2 между тремя генами-паралогами.