Регуляция активности первого компонента комплемента эффекторами из прострела раскрытого PULSATILLA PATENS Кальченко, Вячеслав Владимирович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Одной из важных проблем современной физико-химической биологии является выяснение молекулярных механизмов инициации каскада ферментативных протеолитических реакций в процессах функционирования сложных биологических систем. Примером такой системы является совокупность белков комплемента, представляющая собой часть иммунной системы организма и играющая важную роль как на ранних стадиях иммунного ответа, так и на завершающих этапах борьбы организма с чужеродными и патологическими клетками, вирусами и токсинами. Исследования последних лет все больше убеждают в участии этой системы, а иногда и в ответственности ее за развитие патологических процессов, при аутоиммунных заболеваниях (Frank, Fries, 1991; Asghar , 1995; Baldwin , 1995; Uszewski et al., 1996). Как оказалось, не только дефициты отдельных компонентов комплемента, но в ряде случаев и гиперфункция системы входят в перечень причин развития как аутоиммунного, так и опухолеродного процессов (Morgan , 1995; Weizer et al., 1996; Nishikawa et al., 1996). Система комплемента активируется в результате каскада реакций ограниченного протеолиза. В последнее время в число участников системы включают также клеточные рецепторы фрагментов компонентов и мембранные белки-регуляторы. К функциям системы комплемента в настоящее время относят не только литическую (открытую первой и представляющую собой атаку клеточной стенки с последующим лизисом клетки), но и медиаторную, поскольку фрагменты отдельных компонентов комплемента, освобождающиеся в ходе ферментативного каскада активации, являются медиаторами многих реакций организма (Ross, Medof , 1985;' Barel et al., 1995; Bjarne et al., 1995; Gustavsson et al, 1995; Takabayashi et al., 1995; Croix et al., 1996).

Ключевым моментом инициации классического пути комплемента является активация его первого компонента -О. Знание механизмов и специфичности "узнавания", лежащих в основе "запуска" комплемента, позволит осуществлять контроль за функционированием системы на самых ранних этапах нормальных и патологических процессов (Silvestri et al., 1981; Cjjper , 1985; Schumaker, 1987; Davis , 1988; Gregorek et al, 1991).

Перспективным направлением в изучении системы комплемента являются поиск и создание искусственных регуляторов системы, могущих, по видимому, играть не последнюю роль в терапии ряда иммунных, опухолевых и инфекционных заболеваний (Rubin et al., 1990; Weisman et al., 1990; Sugita , Masuho , 1995; Amsterdam et al., 1995; Chavez-Cartaya et al., 1995). В последние годы значительный интерес иммунологов, медиков и фармакологов направлен на изучение эффекторов растений, обладающих противовоспалительным, противоопухолевым эффектами. Показано, что в

таких растениях содержатся эффекторы, оказывающие воздействия н систему комплемента (Yamada et al., 1986; Kloareg , Quartrano , 198i Mabeau et al., 1990; Chaubet et al., 1992; Patankar et al, 1993).

Цель и задачи исследования. Настоящая работа является часты исследований химии системы комплемента человека, проводимых на кафедр биологической химии Читинской государственной медицинской академиї Целью работы являлось изучение механизмов воздействия эффекторов v прострела раскрытого Pulsatilla Patens на систему комплемента. В связи этим решались следующие задачи:

1. Исследование механизма воздействия настойки прострела раскрытого н систему комплемента.

2. Разработка метода выделения эффекторов из прострела раскрытого н аффинном сорбенте.

3. Установление химической природы эффекторов комплемента из прострел раскрытого.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы бы впервые исследован механизм воздействия эффекторов из прострел раскрытого на систему комплемента, разработан оригинальный микромето исследования связывания и диссоциации ингибиторов субкомпонента Clq составе комплекса EAClq, разработан аффинный метод выделени эффекторов субкомпонента Clq с использованием принципиально новог подхода - двойного аффинного сорбента - естественно связанное субкомпонента Clq первого компонента на сорбенте - lgG-стекле, изучен физико-химические свойства ингибитора.

Разработанные методы создают научные и методические предпосылк для дальнейшего исследования системы комплемента и ее эффекторов. Новы пептидные специфические эффекторы комплемента из препарато растительного происхождения представляют удобные^ь инструменты дл исследований в области комплементологии для регуляции ключевой стадии инициации каскада активации системы комплемента. Материалі диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры биохими ЧГМА, лаборатории иммунологии МНИИ эпидемиологии и микробиологии ик Г. Н. Габричевского. По результатам представленных исследований подані заявка на изобретение: 'Способ получения вещества, регулирующей активность компонента С1 комплемента*.

Основные положения, выносимые на защиту.

4. Эффекторы из прострела раскрытого Pulsatilla Patens влияют на стадию инициации активации системы комплемента в зависимости от функционального состояния субкомпонента Clq.

5. Разработанный микрометод исследования связывания и диссоциации ингибиторов субкомпонента Clq в составе комплекса EAClq позволяет подобрать оптимальные условия для фракционирования эффекторов аффинной хроматографией.

3. Использована в целях препаративной биохимии естественно иммобилизованная молекула Clq на аффинном сорбенте lgG-стекло. Отработаны оптимальные условия элюции Clq-ингибитора из прострела раскрытого.

4. Получен в гомогенном состоянии Clq-ингибитор из препарата прострела раскрытого. Исследованы физико-химические свойства препарата.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции "Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника* (Чита, 1996), на I региональной конференции "Сохранение биологического разнообразия в Байкальском регионе: проблемы, подходы, практика* (Улан-Удэ, 1996), на Втором научном конгрессе "Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты" (Чебоксары, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы.

Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 8 таблицами. Список цитированной литературы включает 215 наименований, из них 37 - отечественных и 178 -зарубежных источников.