Введение к работе
Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач теоретической медицины и практического здравоохранения. Это объясняется весьма широким распространением стрептококкового носительства и стрептококковых заболеваний практически во всех странах мира как в форме первичных инфекций, так и их осложнений токсической, септической, аллергической и иммунологической природы.
Стрептококки разных серогрупп занимают лидирующее положение в инфекционной патологии, вызываемой бактериями. Они вызывают такие распространенные заболевания, как ангины, фарингиты, скарлатина, сепсис, стрептодер-мии, ревматическая лихорадка, ревматическое заболевание сердца, острый гломерулонефрит, менингит, хорея, а также гнойные поражения органов и тканей. Клиническое разнообразие форм стрептококковых заболеваний варьирует в зависимости от биологических особенностей возбудителя, условий формирования очага инфекции и состояния организма инфицированного хозяина. Распространеяносгь перечисленных заболеваний в большинстве стран и связанная с ними хроническая цатологая и инвалидизация части населения представляют не только медицинский, но и экономический интерес.
В настоящее время накоплена значительная информация о структуре клеток стрептококка, о биологических свойствах их антигенов, токсинов и энзимов. Большое развитие получили исследования по идентификации клеточных компонентов данных микроорганизмов, по клинической и эпидемиологической иммунологии и иммунопатологии стрептококковых заболеваний. Однако, наши знания относительно механизмов патогенности и вирулентности стрептококков нуждаются в дальнейшем накоплении и развитии, так как прогресс в понимании молекулярных основ их патогешюсти, безусловно отстает по сравнению с большинством других бактериальных систем. В связи с изложенным актуальность углубленного изучения стрептококков не может вызывать сомнений.
Как и в случае всех инфекционных заболеваний, патогенез стрептококковых инфекций является итогом взаимодействия биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секре-тируемые микробной клеткой или входящие в состав ее клеточной стенки.
Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А, С и G коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности ряд белков. Однако, роль всех стрептококковых белков в патогенезе, не исключая таких хорошо известных белков, как М белки стрептококков групп А, С, и G, до сих пор недостаточно хорошо изучена. Более того, знания о стрептококках и механизмах их вирулентности, которые казались совсем недавно очевидными, сейчас подвергаются сомнению.
Еще совсем недавно считалось, что поверхностные фибриллы вирулентных штаммов стрептококков представлены исключительно М белком, однако в составе клеточной стенки уже сейчас обнаружены разнообразные структуры белков и ферментов. С самим же М белком, входящим в состав группы М подобных белков, наиболее вероятно связана способность связывать фибриноген организма хозяина. При этом уменьшаегся деспозиция СЗЬ компонента комплемента на бактериальной поверхности. Это свойство помогает стрептококку избежать фагоцитоза.
Кроме классического М белка большая группа белков, гомологичных по своей структуре М белкам, в частности, IgG-связывающне белки, относятся к семейству М подобных белков. Штаммы стрептококков группы А могут экспресси-ровать один, два или три М подобных белка, гены которых локализованы последовательно на стрептококковой хромосоме. На настоящий момент принято разделение всех штаммов стрептококков группы А (СГА) на два класса. Фенотипически эти классы различаются по способности экспрессировать OF белок ( фактор опа-лесценцни сыворотки, гидролизующий липидсодержащие компоненты крови), 0F-штаммы обычно имеют только один cram (ген М белка) подобный ген, и для этих штаммов продукт этого гена имеет антифагоцитарные свойства. OF* штаммы экспрессируют два или три М подобных белка и разделение антифагоцитарной функции между ними не всегда является легкой задачей. Практически все исследования, связанные с клонированием генов М белков СГА, выполнены на OF- штаммах. В силу того, что OF* и OF- штаммы стрептококка различаются по структуре клеточной стенки, антигенности М белка, по количеству егот подобных генов, очевидно, что данные, полученные для OF" штаммов, не могут быть автоматически распространены на группу OF* штаммов,
IgG Fc-связывание известно не только для СГА, но и для стрептококков групп С и G. Большинство штаммов стрептококков групп С и G экспрессируют белок G - IgG-связывающий белок. Он связывает, в отличие от стафилококкового белка А, все подклассы человеческого IgG, IgG многих видов млекопитающих и
человеческий альбумин (ЧСА). Роль IgG Fc-связывающих рецепторных белков в патогенезе стрептококковых инфекций еще не очень понятна. Однако, благодаря своей способности связывать плазменные белки человека, как Fc-рецепторные белки СГА, так и G белок, имеют большое прикладное значение.
Таким образом, помимо изучения структуры и функции конкретных генов, изучения их роли в патогенезе стрептококков той или иной группы, большую роль приобретает получение биологически активных белков, кодируемых данными генами, которые являются высоко актуальными для клиники и диагностики, для целей иммунологии, иммунохимии и биотехнологии.
Все выше сказанное определило цепи и задачи настоящего исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение разных типов рецепторных белков патогенных стрептококков, как относящихся к вирулентности штаммов разных серогрупп, так и актуальных для клинико-лабораторпой практики и биотехнологии.
Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
1. Осуществить клонирование генов двух поверхностных рецепторных бел
ков, М белка и Fc-рецептора, стрептококка группы А, потенциально прини
мающих участие в реализации вирулентного фенотипа.
-осуществить клонирование гена М белка 12 серотипа в конъюгативной плазмидерУПОІ.
-создать двурепликонные плазмидные векторы, позволяющие клонировать стрептококковые гены в Е.coli и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов показать экспрессию гена М белка 12 серотипа в стрептококке группы Н.
-осуществить клонирование emm подобных генов, М белка и Fc-рецептора, стрептококка группы А М48 OF+ штамма в фаговом и плазмидном векторах.
2. Осуществить клонирование гена G белка стрептококка группы G в фаго
вом и плазмидном векторах.
-осуществить клонирование гена, кодирующего двуфункциональный G белок, способный реагировать с IgG и с альбумином человека; осуществить клонирование фрагмента гена, кодирующего монофункциональный IgG-связывающий G белок;
-осуществить клонирование фрагмента гена, кодирующего монофункциональный белок, способный связывать сывороточный альбумин человека.
б
-
Создать высокоактивные штаммы-продуценты перечислеиных рецепторних белков. Выделить и очистить рецепторные белки, охарактеризовать их физи-ко-химиеские и специфические свойства.
-
Создать на основе рецепторных белков новые реагенты для аффинной хроматографии.
5. Создать на основе альбуминового рецептора диагностические тест-
системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях
человека,
Научная новизна исследоваиия
Научная новизна работы состоит в том, что:
-
Впервые проклонированы emm подобные гены, гены М белка и Fc-рецептора, стрептококка группы А М 48 серотипа OF+ штамма в гетерологичной системе E.coli и показано, что проклонированный ген М белка кодирует антифагоцитарные детерминанты.
-
Создана группа двурепликонных плазмид, позволяющих клонировать стрептококковые гены В клетках E.colj и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторор впервые показана экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А в стрептококке группы Н. Благодаря трансмиссибель-ности гибридных плазмид впервые осуществлен конъюгативный перенос гена М белка стрептококка группы А в стрептококк группы D и показана его экспрессия в стрептококке группы D.
-
Впервые осуществлено клонирование полноразмерного гена G белка, обладающего двумя функциональными активностями в гетерологичной системе E.coli, в результате чего получен и проанализирован G белок, оказавшийся слитым с Р-галактозидазой.
-
Впервые в нашей стране осуществлено клонирование отдельных фрагментов гена G белка в гетерологичной системе E.coli, в результате чего получены и проанализированы IgG-связывающий и альбумин-связывающий белки.
-
Впервые созданы штаммы-прдуценты IgG-связывающего белка и альбуминового рецептора.
-
Впервые в нашей стране выделены высокоочищенные препараты альбумина и IgG человека аффинной хроматографией с использованием полученных рекомбинантных белков в качестве лигаидов.
7, Впервые созданы диагностические тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях человека на основе рекомби-нантного альбуминового рецептора,
Теорегическай цениосгь работы.
Работа носит теоретический характер. В части работы, посвященной изучению генов вирулентности стрептококков группы А осуществлено клонирование и анализ генов М подобных белков, М белка и Fc-рецептора, в фаговом и плазмид-пом векторах. Это исследование является важным с теоретической точки зрения, так как оно касается генов, принадлежащих к OF позитивным штаммам стрептококков, которые пока недостаточно изучены. Детальное изучение различных поверхностных белков - потенциальных факторов патогенности и накопление сравнигепьных данных о генетических и биологических характеристиках различных поверхностных белков, выделенных из разных штаммов, поможет понять всю сложность действия факторов патогенности стрептококков. Анализ свойств различных поверхностных белков стрептококков в сопоставлении с вызываемыми ими заболеваниями должен помочь в определении путей, по которым бактерия атакует организм хозяина.
Практическая иеняость.
Проведенные исследования позволили создать активные штаммы-продуценты IgG-связывающего белка и альбуминового рецепторного белка, актуальные для биотехнологии и клинико-лабораторной практики. Разработаны условия получения больших количеств рецепторных белков, которые могут быть использованы как лиганды в аффинной хроматографии. Получены два патента на изобретение: патент № 2056859 "Рекомбинантный IgG-связывающий G белок стрептококка группы G", зарегистрированный 27 марта 1996 г., патент № 2065746 "Рекомбинантный HSA-рецептор стрептококка группы G," зарегистрированный 27 августа 1996 г. Составлена и утверждена научно-техническая документация на производство рекомбинантного G белка от 13 июня 1997 г. На основании использования альбумин-связыватощего белка созданы два варианта тест-системы, позволяющие проводить раннюю диагностику диабетической нефропатии. Подготовлена документация для регистрации и сертифицирования в Государственном Научно-исследовательском Институте Стандартизации и Контроля медицинских я биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича иммуноферментной тест-системы для определения микроальбуминурии. Эффективность, высокая специфичность и чувствительность указанной тест-системы подтверждена положительными актами
апробации из рада практических клинических лабораторий различных регионов России. Получено положительное решение на изобретение "Способы определения альбумина в биологических жидкостях" от 19 ноября 1996 года. Основные положения, выносимые на запіиту:
-
Проююнированный ген М белка 48 OF+ серотипа кодирует антифагоцитарные детермшганаты, а соответствующий М белок содержит протективные эпи-гоны.
-
Проклонированный ген IgG Fc-рецеитора стрептококка М 48 в E.coli подтверждает наличие в OF* штаммйх. нескольких М подобных белков.
-
Создана группа двурепликонных плазмид, с помощью которых можно осуществлять клонирование генов стрептококков в клетках E.coli и в стрептококке группы Н. С использованием такого рода векторов показана экспрессия гена М белка 12 серотипа стрептококка группы А в стрептококках группы Н,
-
Проклонированные части гена G белка стрептококка группы G кодируют определенные функциональные белки, обладающие способностью связывать только IgG или альбумин-
-
G белок, способный связывать все четыре подкласса IgG человека и IgG большинства млекопитающих, в отличие от белка А, сможет заменить белок А в диагностических тест-системах, тем самым повышая их чувствительность.
-
Созданы высоко специфичные тест-системы для определения концентрации альбумина в биологических жидкостях на основе альбуминового рецептора.
Достоверность полученных результатов подтверждается высокой специфичностью использованных молекулярно-биологических методов исследования ( ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование ДНК, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные результаты.
Апробация работы.
Материалы диссертации опубликованы в 38 научных работах и многократно доложены и обсуждены на различных Российских и Международных конференциях и симпозиумах: II Международный конгресс по генетике стрептококков в США, Флорида, 1986; Всесоюзный симпозиум в Ленинграде "Стратегия возбудителя в организме хозяина", 1987. Новые направления в биотехнологии", Пущино-на-Оке, 1992; XII Ленсфильдовский Международный симпозиум по стрептококкам и Стрептококковым заболеваниям, Санкт-Петербург, Россия, 1993; "Биотехнология, Санкт-Петербург-94", Санкт-Петербург, 1994; "Российский съезд
специалистов по лабораторной диагностике", Москва, 1995; "Новые методы в микробиологии", Кошице, Словакия, 1995; III Нефрологический семинар, Санкт-Петербург, 1995; IY Нефрологический семинар, Санкт-Петрбург, 1996; XIII Ленсфильдовский Международный симпозиум по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Париж, 1996; "Новые направления в биотехнологии", Международная конференция, Пущино-па-Оке, 1996, Y Нефрологический семинар, Санкт-Петрбург, 1997; Результаты работы докладывались на заседаниях Отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН. Объем и струкгура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 251 странице, включающих введение, литературный обзор, материалы и методы, собственные исследования и их обсуждение, заключение, выводы и указатель литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 51 рисунком. Список литературы содержит 386 источников, в том числе 12 отечественных.