Реакции изотопного обмена кислорода в АТФазных системах различного функционального назначения : Na + , K +-АТФаза, Ca2+-АТФаза, нитрогеназа Скворцевич, Евгений Георгиевич

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Центральными биохимическими процессами в живой клетке, обеспечивающими трансформацию конвертируемых форм энергии, являются синтез и распад аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Реакционные последовательности этих процессов, связанные с превращением энергии, представляют собой реакции переноса фосфорила от доноров фосфорильных групп на акцептор - аденозиндифосфорную кислоту (АДФ) в случае синтеза АТФ и воду - в случае гдролитического распада. Таким образом, понимание молекулярных механизмов трансформации энергии в живых организмах связано с расшифровкой механизма реакций фосфорила в ферментативных системах, связанных с превращением АТФ.

Превращение АТФ в таких системах осуществляется молекулярным блоком, содержащим АТФазный центр. Особенностью каталитического механизма биологических трансформаторов энергии является образование ферментных фосфорилированных интермедиатов, отличающихся структурой переходного состояния, лигандным окружением фосфорила и способом связи с эффекторной частью молекулярной системы.

Тестировать'реакции с участием фосфорила в активном центре фермента необычайно трудно в виду малого времени жизни фосфорилированных интермедиатов. В этой ситуации практически единственным подходом, позволяющим наблюдать реакции фосфорила в активном центре ферментов, являются методы, основанные на регистрации изотопного обмена, происходящего в продуктах и субстратах ферментативной реакции.

В биохимических реакциях фосфор редко меняет свое лигандное окружение, чаще всего это атомы кислорода, которые претерпевают обмен с кислородными атомами, входящими в состав молекулярных групп активного центра. Этот вид обмена тестируется с помощью изотопной метки - ¹⁸0, включающейся в продукт АТФазной реакции - неорганический фосфат (Р„).

4 Таким образом по включению изотопной метки в продукты и субстраты ферментативной реакции можно получить информацию о каталитическом механизме гидролиза АТФ в активном центре АТФазных систем.

Цель исследования. Основной целью данного исследования явилось обнаружение с помощью реакций изотопного обмена кислорода ферментных интермедиатов в АТФазных системах различного происхождения и исследование их свойств. Выяснение роли компонентов АТФазных систем в катализе изотопного обмена кислорода. Исследование связи реакций фосфорила в сопряжении пиролиза АТФ с функциями аденозинтрифосфатаз. Задачи исследования. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать распределение ¹⁸0 в продуктах ферментативного гидролиза АТФ.

2. Идентифицировать реакции изотопного обмена кислорода между Р„и Н₂0 в АТФазных системах различного функционального назначения.

3. Изучить ферментативные свойства изотопного обмена кислорода в различных
АТФазных системах.

4. Изучить роль компонентов АТФаз в катализе изотопного обмена кислорода.

5. Исследовать роль реакций переноса фосфорила в сопряжении гидролиза АТФ с функциями АТФаз.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 .Изотопный обмен кислорода между водой и неорганическим фосфатом происходит в

ферментативной системе фосфогидролазы, осуществляющей отрыв фосфорильного

остатка.

2.Активный центр, осуществляющий изотопный обмен кислорода в неорганическом

фосфате, локализован в центре гидролиза АТФ. " "

3.Механизм гидролиза АТФ в АТФазных системах контролируется компонентами

АТФазного центра и эффекторной частью АТФазного комплекса.

5 4.Агенты, разобщающие структурно-функциональную связь в АТФазной системе между АТФазным центром и эффекторным компонентом, вызывают несопряженный гидролиз АТФ.

Научная новизна. Впервые исследованы с применением ^sO ряд АТФазных систем. В АТФазных системах различного функционального назначения и происхождения (№*,К⁺-АТФаза, Са²⁺-АТФаза и Нитрогеназа) обнаружены реакции изотопного обмена кислорода, протекающие на промежуточных стадиях гидролиза АТФ. Изучена позиционная специфичность АТФаз. Показано, что все изученные АТФазные системы катализируют расщепление Р-0 связи у у-фосфата АТФ с отщеплением фосфорильного остатка. Позиция разрыва Р-0 связи коррелировала с наличием реакций изотопного обмена кислорода в неорганическом фосфате. Для транспортных АТФаз Р-типа и нитрогеназы впервые показана зависимость реакций изотопного обмена кислорода от компонентов реакционной системы, обеспечивающих ферментативную реакцию.

Изучена локализация активного центра изотопного обмена кислорода. Показано, что последний идентичен гидролазному центру. Изотопный обмен кислорода связан с обратимым фосфорилированием активного центра и отражает промежуточные этапы гидролиза АТФ. Показано разобщение АТФазной реакции и изотопного обмена кислорода. Это свойство может быть использовано для тестирования АТФазного центра в неполной системе в огсутсгвиие АТФазной реакции.

Исследована роль структурных компонентов АТФаз в модификации механизма гидролиза.

Изучена связь реакций изотопного обмена кислорода с функциональными параметрами АТФаз. Впервые показана зависимость ^,80-обмена от степени сопряжения гидролиза АТФ с транспортом ионов для ионтранспортирующих АТФаз и с транспортом электронов - для нитрогеназы.

Сравнительно-биохимические исследования АТФаз различной структурной организации и биологической функции позволили выдвинуть концепцию единого

энергетического блока в АТФазных системах. Сформулировано представление о механизме разобщения гидролиза АТФ с функцией АТФазной системы. Практическая значимость работы.

Исследования механизмов гидролиза АТФ в системах трансформации энергии вносят вклад в понимание принципов генерации и использовании химической энергии на биологическую работу в живых организмах. Результаты по изучению ферментных интермедиатов с помощью реакций изотопного обмена расширяют представления о функциональной организации биологических трансформаторов энергии. Изотопный обмен кислорода позволяет исследовать состояние активного центра АТФаз, не вызывая модификацию ферментативной системы. В работе разработаны подходы для адаптации аналитических и препаративных методов этимологического исследования, включая масс-спетрометрию, для решения задач применения реакций изотопного обмена кислорода в биохимических исследованиях.

Результаты работ использованы в курсах лекций Биохимия и Энзимология, осуществляемых на Биолого-почвенном факультете Санкт-Петербургского университета и при реализации магистерской программы «Функциональная биохимия». Результаты разработок были использованы при выполнении выпускных студенческих работ и диссертаций.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзных конференциях по транспортным АТФазам (Алма-Ата 1979, Тарту 1980, Коктебель 1981), на Всесоюзных биохимических съездах (Рига 1974, Ленинград 1979, Киев 1986), на Всесоюзных биофизических съездах (Москва 1982, Москва 1999), на Всесоюзных конференциях по биологической подвижности (Ленинград 1978, Тбилиси 1987), на IX международном биохимическом съезде, (Тронто 1979), на съездах Федерации биохимических обществ Европы (Будапешт 1974, Париж 1975, Копенгаген 1977, Эдинбург 1981, Москва 1984), на IV международном симпозиуме по гомогенному катализу, (Ленинград 1984), на Советско-американских симпозиумах по метаболизму миокарда (Вирджиния 1977, Ташкент 1979 .Бетезда 1980, Баку 1984).

7 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения.обзора литературы, экспериментальной части ( методы и материалы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы (ссылок). В работе представлено 57 рисунков и 46 таблиц, Объем работы составляет 207 страниц машинописного текста. Методы исследования.