Введение к работе
Актуальность проблемы. Точковые мутации - это изменения первичной структуры генома на уровне отдельных составляющих его нуклеотидов. Фенотипические проявления точковых мутаций могут быть весьма разнообразными. Наиболее значительны из них с практической точки зрения различные патологические состояния организма человека, животных и растений [McKusik, 1991]. В том случае, если точковая мутация возникает в геноме клеток зародышевой линии, все клетки развившегося из них организма-потомка будут содержать эту мутацию, которая в данном случае может быть причиной наследственного заболевания. Даже гетерозиготное состояние доминантной мутации сопровождается формированием мутантного фенотипа. В отличие от этого рецессивные мутации проявляются фенотипически лишь в гомозиготном состоянии. В связи с наследственными заболеваниями человека гетерозиготное состояние рецессивных мутаций рассматривается как носительство, и их присутствие в геноме является серьезным фактором риска в отношении развития соответствующего заболевания. Для организмов-носителей характерна высокая вероятность возникновения мутантного фенотипа вследствие независимого появления аналогичной мутации в гомологичных хромосомах соматических клеток в онтогенезе или в результате участия в акте размножения двух мутантних особей, геном которых содержит одинаковые рецессивные мутации. С учетом сказанного особую важность приобретает разработка эффективных методов молекулярной диагностики у человека точковых мутаций, ассоциированных с наследственными или приобретенными заболеваниями, которые бы позволяли диффереіщировать гомозиготное и гетерозиготное состояние этих мутаций.
Венозные тромбозы, которые являются причиной смерти 1 из 1000 людей ежегодно, нередко бывают семейными. Недавно было установлено, что наиболее распространенным генетическим дефектом, ассоциированным с венозными тромбозами у больных европейской популяции, является точковая мутация в
гене фактора V (мутация Leiden), которая сопровождается появлением устойчи вости фактора V к активированному белку С и резко снижает эффективност функционирования антикоагулянтной системы [Bertina, 1994]. К началу работі единственный метод обнаружения этой мутации предполагал использовани дорогостоящей рестриктазы Mnll, что делало его многоэтапным и ограничивал широкое клиническое использование. В этой связи представлялась весьм актуальной разработка нового эффективного метода обнаружения этой мутацш Одновременно предполагалось, что разработка нового эффективного метод обнаружения точковых мутаций может иметь большое фундаментальне значение для популяционной генетики в целом и для клинической практики.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание і основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) универсальной системы поио точковых мутаций в геномной ДНК человека и ее использование для обнаруж ния мутации Leiden у больных тромбофилиями.
Задачами исследования являлись:
-
Разработка и создание принципиально новых аллель-специфических прайм ров, пригодных для обнаружения точковых мутаций в геномной ДНК, позв ляющих дифференцировать гомозиготное к гетерозиготное состояние муі ций.
-
Использование разработанных праймеров для идентификации мутации Leia в геномной ДНК больных тромбофилиями.
Научная новизна и практическая значимость исследования. Разра( тана новая, универсальная тест-система, позволяющая обнаруживать и дифс ренцировать известные гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации также проводить поиск новых точковых мутаций в гомозиготном состоян: Система успешно апробирована на клиническом материале, полученном больных с венозными тромбозами, и может быть рекомендована для широкі использования в клиниках с целью диагностики мутации Leiden. Прині
предложенного метода может быть использован для поиска других точковых мутаций, представляющих клинический интерес, а также для анализа неизвестных точковых мутаций у гаплоидных организмов (например, бактерий и вирусов) в фундаментальных и прикладных исследованиях.
Апробация работы. Научные результаты, представленные в диссертации были доложены на II научной конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром: современное состояние проблемы» (Москва, 1995), на I Всероссийской научно-практической конференции «Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения» (Сочи, 1996), на 10 Международной конференции Дунайской лиги против тромбозов и геморрагических заболеваний (Познань, Польша, 1996), на Ш Всероссийской конференции «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения» (Москва, 1997), на XVI Международном конгрессе Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза (Флоренция, Италия, 1997).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, а также выводов. Диссертация изложена на стр., содержит рис., и таблиц. Список литературы состоит из названий, в том числе русских и иностранных.