Разработка технологии получения нового поколения иммуноглобулинов для терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний человека Анастасиев, Валентин Васильевич

Введение к работе

Актуальность проблемы Опыт клинического применения иммуноглобулинов позволил определить наиболее веро-.ятные причины побочных реакций при их'внутривенном введении. Большинство исследователей полагают, что факторами непереноси-мости является присутствие в препаратах полимеров, некоторых белков, изоагглютинннов и биологически активных примесей.

Обсуждается механизм действия этих примесей. Полагают, что полимеры по своеыу биологическому действию подобны комплексу антиген-антитело. Они активируют комплемент и способны вызывать высвобождение из иммунокомнетентных клеток гранул и других веществ, включая вазоактивные амины. Вероятно, такое же действие, как. комплекс антиген-антитело могут оказывать и гомологичные белки Ig-A, бета-линопротеины. Эти белки, ведут себя как антигены и при введении IgA, бета-лшюпротеинов с препаратом могут образовываться антитела; причем к IgA, наряду с антителами ]gS класса, синтезируются Ig-E антитела. Повторное введение препаратов .с примесями, таких .белков в исключительных случаях приводило к анафилактическим реакциям, индуцируемым иммунными комплексами ( Е. Branigar» et al.,1983, N. Day et al., 1984, S.Barandun, H. Isliker, 1986 et al., G. Lucas et al., 1987).

Ответственными за тяжелые анемии, а в отдельных случаях и гемолиз, считают изогеммагглютинины. Среди биологически активных примесей препаратов гипотензивный эффект оказывал активатор прекадликреина, действие которого через систему биохимических реакций могло приводить к формированию вещества понижающего кровяное давление - брадикинина (В. Alving et al., 1979, 1980, A. Burks, -1985). Проводятся исследования по очистке от этих примесей для получения ареактогенных иммуноглобулинов при внутривенном введении.

-В.России исследования по получении иммуноглобулинов для внутривенного ^введения были начаты в конце 60-х, начале 70-х годов одновременно в трех научно-исследовательских, центрах: в Нижегородском НИИЭЛ нод руководством И.Н. Блохиной и И.А. Кисе-

левой, в Московском НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского - Н.В. Холче-вым, в ЦНИИ гематологии и переливания крови-под руководством А.А. Фрома. Экспериментальные научные работы в этих учреждениях объединил принцип использования пепсина, предложенный S. Barun-dun et al.(^62) и Н. Schultze and Н. Sdwick (1962), для получения . не обладающих спонтанной антикомплеыенгарной активностью дезагрегированных иммуноглобулинов. В середине 70-х годов исследования завершились созданием лабораторных методов. Особенности технологических схем заключались в количествах вносимого пепсина для кислотно-ферментативного гидролиза, его форме (растворимый или иммобилизованный фермент) и методах удаления фермента.

По технологической схеме, предложенной Нижегородским НИНЭЛ было организовано производство препарата на Нижегородском предприятии по производству бактерийных препаратов. На иммуноглобулин для внутривенного введения били разработаны технические условия и регламент производства. Новый препарат хорош переносился больными и позволил значительно повысить эффективность .лечения тяжелых форм бактериально-токсических и вирусных инфекций.

Вместе с тем, внедренный в производство технологический вариант кислотно-ферментативного гидролиза был рассчитан только на приготовление небольших объемов препарата. Производство иммуноглобулина для внутривенного введения имело длительный технологический цикл и сопровождалось большими потерями основного белка.

Полученные по данной технологии препараты были частично расщеплены до F(ab')2 - фрагментов. Отсутствие Fc-участка. в молекуле IgG лишало эти фрагменты возможности выполнять необходимые эффекторяые функции, сокращало время, циркуляции иммуноглобулинов в организме и снижало эффективность препарата при заместительной терапии и ряде аутоиммунных заболеваний. Все это потребовало усовершенствования существующего ,и разработки принципиально новых методов получения внутривенных иммуноглобулинов. Минздрав РФ, Российская Академия медицинских наук в программе научных разработок до 2005 года признали эти исследования

приоритетными.

Для лечения целого ряда инфекционных заболеваний признано
необходимым создание специфических внутривенных '.иммуноглобули
нов (Материалы ВСБ, 1982, 1983, 1988, 1992).
Цель исследования. Теоретическое и эксперимен
тальное обоснование путей повышения эффективности, специфичнос
ти и снижения реактогенносги препаратов иммуноглобулинов, разра
ботка принципов и методов получения препаратов нового поколения
для профилактики и лечения инфекционных и аутоиммунных заболева
ний. ... . . * -

В ходе исследования предстояло решить следущие задачи:

1. Исследовать, состав препаратов иммуноглобулинов.

2. Изучить взаимодействие белков сыворотки крови в процессе фракционирования.

3. Разработать новый вариант кислотно-ферментативной тех
нологии получения иммуноглобулинов для внутривенного введения.

4. Создать ряд иммуноглобулинов для внутривенного введения направленного действия.

5. Разработать методы получения высокоочищенной мономерной формы иммуноглобулинов" для внутривенного введения" и' установить требования к препарату.

Научная новизна. На основании комплексного изучения состава известных препаратов обоснованы пути повышения эффективности новых лекарственных форм иммуноглобулинов. Разработаны новые принципы конструирования мономеряой формы препаратов иммуноглобулинов.

Впервые показано молекулярное взаимодействие белков в процессе фракционирования плазмы (сыворотки) крови человека.

Разработаны оригинальные технологические приемы удаления нестабильных крупвошлекулярннх комплексов, полимеров, димеров и биологически, активных примесей, позволяющие дифференцированно проводить очистку иммуноглобулинов из различных видов сырья. '- Получены авторские "свидетельства N 1381774 " Способ' получения' иммуноглобулина" "15 ноября 1987 г.; N 1403414 " Способ получения иммуноглобулина из сывороток плацентарной и абортной крови", 15 февраля 1988 г:

- б -

Разработан новый вариант кислотно-ферментативного метода получения иммуноглобулинов для внутривенного введения. .

Впервые разработаны иммуноглобулины для внутривенного ввет дения противооотулинический и антистафилококковый. Получено авторское СБгдетельство М 1510156 на "Способ получения противобо-" тулинического иммуноглобулина человека" 22 ыая*1989 г. Установлены и сформулированы требования к препаратам.

Получены новые данные об уровнях антител в исходном сырье и препаратах иммуноглобулинов, позволяющие дифференцировать подходы к созданию специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения. Показана возможность" формирования серий специфических иммуноглобулинов = для внутривенного введения против вирусов краснухи и простого герпеса посредством целенаправленного отбора' сырья.

Практическая значимость.

Результаты исследований легли в основу 9 утвержденных фармакопейных статей, регламентов, дополнений к регламентам и методических рекомендаций. Разработаны два метода получения ыоно-мерной формы иммуноглобулинов для внутривенного введения из центрифугата Б1 и пасты фракции 11; позволяющие полностью сохранить иктактность и функциональную активность антител. Определены требования к препарату. Усовершенствован кислотно-ферментативный метод получения иммуноглобулинов для внутривенного введения: оформлена и утверждена нормативно-техническая документация на производство препарата: фармакопейная статья ФС 42-3153-S5 от 3.10.95г.; регламент производства от 28.12.94 г.; изменение N 1 к регламенту производства иммуноглобулина человека нормального для внутривенного введения "Дополнительная очистка иммуноглобулинов от денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей. Удаление остаточного спирта ультра-фальтрацией" от 12.03.97 г.

Применение препарата _;в медицинской практике показало его ..високу» эффективность, при лечении тяжелых бактериально-токсических и вирусных инфекций, послеоперационных осложнений, соп-ровоядавдихся бактериемией и септическим состоянием. Производственный выпуск иммуноглобулинов для внутривенного, введения осу-

ществляется на Нижегородском и Хабаровском предприятиях по производству бактерийных препаратов и в Нижегородском областном гематологическом центре.

Совместно с НПО "Вирион" (г.Томск) разработан иммуноглобулин для внутривенного введения противоботулинический; Определены требования к препарату и производству во временной фармакопейной статье BOG 42-284 ВС-91 от 2.04.91 г. и экспериментально-производственном регламенте N 310-91 от 27.04.90 г.

Препарат предназначен для экстренного лечения средне-тяжелых и тяжелых фори ботулизма у детей и взрослых. Выпуск препарата организован в НПО "Вирион";

Для лечения заболевании стафилококковой этиологии совместно с Кировским НИИ гематологии и переливання крови, разработан иммуноглобулин человека для внутривенного введения антистафилококковый. На препарат утверждена временная Фармакопейная статья БФС 42-2854-97 от 11.03.97 г..и дополнение к регламенту. Препарат выпускается Кировской станцией переливания крови.

' Разработаны требования, технология получения,. завершены
доклинические испытания иммуноглобулинов для внутривенного вве
дения против вируса, краснухи и вируса, простого герпеса. . Имму
ноглобулин человека для внутривенного введения противокраснуш-
ный предполагается использовать для профилЪктики и лечения ин
фекций, вызванных вирусом краснухи, особенно у детей и верослых
с дефицитом протизокрасяуиных антител. Иммуноглобулин человека
для внутривенного введения протнвогерпетический предназначен
для лечения заболеваний детей и взрослых, "вызванных вирусом
простого герпеса, особенно полости рта, половых органов и гер
петических инфекций глаз. . -

. Для повышения качества исходного иммуноглобулина при производстве внутривенного препарата разработан и внедрен в производство метод очистки икмуноглобудиьа от денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей. Метод угвервдэн как изменение N-4 к регламенту производства юслуяоглобулина человека нормального 12.03:97 г.

Результаты работы вошли в методические рекомендации по определению шгиксмллементарной активности препаратов йымуногло-

булинов (1988 г.), разработанные совместно с Нижегородским ШША и ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Апробация работы. Основные результаты и положения
работы доложены на рабочем совещании начальников и технологов
гамма-глобулиновых цехов предприятий бакпрепаратов (г. Казань,
1983 г.), на проблемной комиссии "Научные основц вакцинно-сыво-
роточного дела, генетика и молекулярная биология бактерий." (г.
Горький 1985 г.), на заседании Научно-Технического Совета при
Управлении ШШШ и ПВС МЗ России (г. Ростов на Дону, 1986 г.)
на Всесоюзном совещании специалистов службы крови по вопросам
производства препаратов плазмы донорской крови (г. Москва, 1990
г.), на Пленуме проблемной комиссии " Стандартизация медицинс
ких биологических препаратов для профилактики и диагностики ин
фекционных болезней человека" (Н. Новгород, 1990 г.). на межре
гиональном симпозиуме "Актуальные проблемы практической аллер
гологии и клинической иммунологии" (г. Москва, 1995 г.), на на
учно-практической конференции "Препараты крови и кровезамените
ли - производство, контроль и клиническое применение" (г. Ки
ров, 1995), на 1Y Российском Национальном конгрессе "Человек и
лекарство" (г. Ыосква, 1997), на И Биохимическом съезде (г.
Москва, 1997).
Основные по, ложения выносимые на
' ⁷" защиту

1. Охарактеризован состав препаратов иммуноглобулинов.

2. Разработана технология удаления агрегированных форм иммуноглобулинов, белковых и биологически активных примесей.

3. Разработаны условия получения нового поколения*иммуноглобулинов для внутривенного введения с интактной структурой и сохранением функциональных характеристик антител.

4. Усовершенствована технология кислотно-ферментативного метода и разработаны требования к внутривенным иммуноглобулинам направленного-действия: прртгаоботулииическому, азтистафилокок-ковому, противркраснушному,- -против вируса простого герпеса', а также к нормальному иммуноглобулину человека.

Структурам объем работы . Диссертация изложена на 278 страницах и состоит из введе-

' ния, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Текст иллюстрирован 32' таблицами и 13 рисунками. В списке литературы приведен перечень 378 работ, в том.числе 90 отечественных и 288 зарубежных..