Введение к работе
Актуальность темы.
Развитие молекулярной биологии во многом зависит от наличия качественных реактивов, а предлагаемая номенклатура реактивов для молекулярно-биологических исследований и прикладных целей в Российской федерации пока еще .крайне ограничена. Использование фаговых ДНК-зависимых РНК-полимераз открыло широкие возможности для синтеза РНК в системе in vitro. Для этой цели крайне важно применение целевых наборов высококачественных реагентов для синтеза РНК. Отечественные реагенты, выпускаемые отдельными лабораториями и кооперативами для этих нужд, во многих случаях не отвечают требуемому качеству, уступают зарубежным препаратам. Детали промышленного производства наборов за рубежом являются "ноу хау" и не могут быть использованы в отечественном производстве.
В настоящее время за рубежом широко используются наборы
реагентов для синтеза РНК в системе in vitro. Эти наборы содержат Т7 и
SP6 РНК-полнмеразы, ингибитор РНКаз из плаценты человека,
риботрифосфаты, плазмиду с Т7 и (или) SP6 промоторами, контрольную
матрицу и буферный раствор для проведения реакции транскрипции.
Этот комплекс обеспечивает гарантированное получение
высокомолекулярных РНК в требуемом количестве с заданными свойствами, что значительно облегчает решение задач по получению диагностических гибридизационных "зондов", синтезу белка in vitro и получение антисмысловых РНК. Отечественной промышленностью подобные наборы не выпускаются.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы является совершенствование промышленной технологии получения реагентов для синтеза РНК в системе in vitro и создание на их основе в транскрипционных наборов. Конкретными задачами исследования является: 1) разработка 'производственной методики выделения ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7; 2) совершенствование технологии производства ингибитора РНКаз из плаценты человека; 3) оптимизация методов получения РНК транскриптов в системе in vitro с использованием полученных реагентов; 4) разработка технических условий и производственной методики на получение транскрипционных наборов; 5) изучение условий длительной стабилизации ферментативной активндсти Т7 РНК-полимеразы.
Научная новизна работы.
Предложена новая технология производства наборов для транскрипции в системе in vitro с использованием отечественных реагентов. Разработана оригинальная технология выделения ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7, позволяющая получать в заводских условиях фермент гарантированного качества. Проведено совершенствование технологии производства ингибитора РНКаз из плаценты человека, заключающееся в сокращении стадий выделения ингибитора, что позволяет получать препарат высокой удельной активности. Представлены новые данные по оптимизации методов получения и контроля качества транскриптов в системе in vitro. Показана эффективность ингибитора РНКаз из плаценты человека в отношении увеличения стабильности при хранении и повышении активности РНК полимеразы фага Т7.
Практическое значение работы.
На основании проведенных исследований разработана
производственная методика и технология производства
транскрипционных наборов. Получены опытные образцы и опытные партии наборов. Созданы предпосылки для серийного выпуска транскрипционных наборов с целью получения высокомолекулярных РНК в требуемом количестве с заданными свойствами. Разработана необходимая нормативно-технологическая документация для выпуска транскрипционных наборов:
а) производственная методика на получение транскрипципционного
набора;
б) технические условия на транскрипционный набор;
в) дополнения и изменения к производственным методикам
выделения Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз из
плаценты
человека.
На защиту выносится.
Новые экспериментальные данные по совершенствование технологии выделения Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз из плаценты человека. Данные по оптимизации транскрипционных наборов с использованием полученных реагентов. Способы стабилизации и повышения активности Т7 РНК-полимеразы.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, в которых
рассмотрены основные аспекты применения транскрипционных наборов
ia основе бактериофаговых РНК-полимераз в практике молекулярно-
5иологических исследований, а также известные лабораторные методы
шделения РНК-полимеразы бактериофага Т7, белкового ингибитора
?НКаз из плаценты человека и их физико-химические свойства;
жспериментальной части, включающей материалы и методы
исследований; результатов и их обсуждения; выводов и практических
іредложений. Материалы изложены на 102 страницах машинописного
текста, содержат 18 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает
Л наименований. Приложения на 12 листах содержат перечень
утвержденной нормативно-технической документации и отзывы научных
учреждений-потребителей Т7 РНК-полимеразы и ингибитора РНКаз из
тлаценты человека о качестве препаратов. *"""
\пробация работы.
Материалы диссертации доложены на 2-ой отраслевой конференции -конкурса молодых ученых (Новосибирск, 1990), на :еминаре отдела функциональной биохимии ГНИЙ ПМ (Оболенск, 1992). Основные результаты работы изложены в трех публикациях.