Введение к работе
Актуальность темы. Зос.форорганические ингибиторы (ЙОИ) холинэсте-раз (ХЭ) широко используют, в качестве сельскохозяйственных инсектицидов, благодаря их еысокой эффективности, широкому спектру действия и быстрой деградации во вкешней среде. Важнейшим условием безопасного применения ФОИ является надёжный контроль их остаточных количеств в природных объектах и пищевых продуктах. Как правило, его осуществляют с помощью компьютеризованных газо-жидкостных хроматографов, ко сложность и Еысокая стоимость анализа ограничивает применение этого метода.
Другой принцип детектирования 0И основан на использовании биоэк-внваленткых систем (биосенсоров), содержащих биологическую мишень СОИ - энзимы группы ХЭ. Для сложных природных и лицевых объектов предпочтительно применение ^мобилизованных на носителе ХЭ, что обеспечивает получение накопительного токсического эффекта и может упростить пробоподготовку.
Фиксацию ХЭ на твёрдой фазе осуществили многие исследователи с
ПОМОЩЬЮ КОВаЛеНТНОГО і ( Тар Minh et al,, 1973; Yao et n 1 . , 1985; Ліспу et al., 1Э89)5 сорбЦИОННОГО (Goodson S Jacobs, 1973; Morclis 4 Coulet, 1990), аффИННОГО (Oundarsta 4 Wilson, 1990) СВЯЗЫВаНИЯ И
физической ОККЛЮЗИИ (Degany 5 Miron, 1970; Louis et al., 19D0) ,
а также комбинацией этих методов (Н.А.Платэ и соавт. 1985; 1992). Хотя энзим сохранял зстеразную активность, его чувствительность к действию ФОИ обычно снижалась. Лишь в немногих случаях удалось создать ТвёрДОфаЗНЫе Детекторные СИСТемЦ ДЛЯ ИНДИКаЦИИ ФОИ (Coodson t, al. ^976: Leon-Gonzales & raunahend, 1990; Kinderwater et al., 1990; Quln-
tero.s ai. ,199оуно их техническая сложность препятствовала широкому применений для природоохранных и санитарно-гигиенических целей.
Диссоциация функциональных свойств при иммобилизации ХЭ, по-видимому, зависит от особенностей молекулярного механизма гидролиза субстратов и инактивации активного центра энзима при действии ФОИ
(А.С.Сацыков и соавг., 1976; Л.П.Кузнецова и соавт., 1990). В каталитическом акте участвуют несколько поверхностных сайтов (анионный и гидрофобные) молекулы ХЭ, которые ориентируют субстрат перед его транспортом в эстеразный центр, расположенный в складчатой структуре. Поэтому маскирование каталитической области, а также ограничение пространственной подвижности или искажение конформации молекулы ХЭ при иммобилизации приводит как к падению эстеразной активности, так я к снижению чувствительности к действию ФОИ. При этом второй показатель снижается особенно ощутимо, поскольку структура 00И неполностью соответствует структуре природных субстратов ХЭ, что затрудняет взаимодействие с активными сайтами каталитического региона энзима.
Отмеченные выше особенности строения и функции ХЭ предъявляют особо высокие требования к методике их иммобилизации.
Цель работы. Сопоставление эффективности различных подходов при иммобилизации ХЭ в твердофазных системах для получения оптимальной формы биооквивалентного сенсора 50И, обеспечивающего широкий экологический и санитарно-гигиенический мониторинг.
Задачи исследования. ^
-
Разработка детекторной системы достаточной чувствительности;
-
Обеспечение стабильности биосенсора при/хранении и в процессе анализа;
-
Получение целевого продукта приемлемой стоимости за счет использования доступных реагентов и технологий при изготовлении;
-
Максимальное упрощение стадии пробоотбора и обеспечение возможности применения метода в полевых условиях;
-
Обеспечение возможности исследования сложных пищевых и природных объектов.
Научная новизна. Показано, что при ковалентной фиксации ХЭ целесообразно использовать протяженные и высоко гидрофильные вставочные молекулы (спейсеры), разобщающие лиганд и поверхность носителя. Впервые получены и использованы спейсеры полиоксидиальдегид ("Пол-
диаль") и активированные производные олигосахарида бета-циклодекстри-на, снижающие вероятность внутримолекулярных сшивок биолиганда.
Улучшены методы инкапсулирования белков в губчатом слое анизотропных полых волокон за счет минимизации активного объема и его защиты от внешних воздействий путем покрытия двойной мембраной, что улучшило операционные свойства ФОИ-детектора на основе инкапсулированной ХЭ.
Сопоставлены характеристики различных носителей и показано, что по операционным свойствам оптимальны "керновые" композиции с размещением биолиганда на поверхности носителя для обеспечения улучшенного массопереноса низкомолекулярных эффекторов - субстратов и ФОИ. Специфическая активность "керновые" композиций повышена путем иммобилизации лиганда в форме надмолекулярных ассоциатов.
Использование ферромагнитных дисперсий (ФМД) в качестве носителя ХЭ расширяет возможности метода и позволяет исследовать сложные природные и пищевые объекты. Разработан оригинальный способ пассивирования частиц ФВД в высокочастотном электрическом поле, что позволяет сохранить высокую дисперсность и однородность носителя. Предложена новая композиция "Магносорб", позволяющая иммобилизовать различные белки на гидрате окиси алюминия (ГОА), мицеллы которого удерживаются сложным комплексантом на основе 8-оксихинолина, ковалентно связанного с пассивированной ФВД.
Впервые разработана бинарная форма биосенсора, состоящая из яиофи-лизированной ХЭ и "Магносорба", что повышает надежность индикации ФОИ в экспедиционных условиях.
Научно-практическая значимость. Предложена комплектация тест-набора, состоящего из бинарного биосенсора и вспомогательных реагентов, а также специально разработанных устройств для проведения анализа -магнитных дозатора и сепаратора. Простая техника анализа адаптирована к полевым условиям, что позволяет идентифицировать пораженные зоны для последующего исследования более точными методами.
Разработанные технологические приемы могут быть использованы для широкого круга биотехнологических процессов. Положения, выносимые на защиту:
-
Стерическая свобода молекулы холинэстераэы необходима для сохранения чувствительности иммобилизованного энзима к действию фосфор-органических ингибиторов. Этот принцип реализуется при фиксации ХЭ через протяженные гидрофильные спейсеры, пространственно раэобщащие биолиганд и носитель и реагирующие с ограниченным числом функциональных групп молекулы энзима.
-
Инкапсулирование ХЭ в полых волокнах полностью исключает неблагоприятные воздействия на биолиганд, что позволяет использовать поло-волоконные детекторы для индикации фосфорорганических ингибиторов с накопительным эффектом.
-
Ферромагнитные композиции при сорбционной фиксации ХЭ наиболее удобны при ислледовании сложных природных и пищевых объектов. Бинарная форма детектора повышает его стабильность в экспедиционных условиях.
Внедрение. Результаты исследования внедрены в практические курсы ВТМЗ на военной кафедре Башкирского Государственного медицинского института.
Апробация работы.Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологии" Шуцино, 1994 г.); на итоговой научной конференции Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН (Уфа, 1995 г.). По теме диссертации опубликовано б печатных работ, подано 3 заявки на патент РФ, из них по двум проведена формальная экспертиза с положительным решением.
Структура и объем работы.Работа изложена на страницах машинописи,