Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время известно, что лечебный эффект наиболее распространенных нитровазодилятатороз -таких как нитроглицерин, нитросорбид, нитронг, нитропруссид нат~-рия и др. - связан со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы (ГЦ ), катализирующей биосинтез циклического 3',5'- гуанозинмонофосфата С цГМФ ) и накоплением этого мощного регулятора функциональной активности клетки. Активирующее влияние перечисленных лекарственных препаратов обусловлено взаимодействием свободнорадикальной группы N0 этих соединений с железом гема, являющегося простети-ческой группой ГЦ. Образующийся комплекс-нитрозилгем-представляет. собой истинный активатор фермента. Этот молекулярный механизм терапевтического действия приобрел особое значение после установления Копсаба < в 1987 году эндогенной природы оксида азота. Было показано,что эндотелиальный фактор релаксации,.синтезируемый клетками'сосудистого эндотелия и участвующий в расширении сосудов, представляет собой оксид азота. Оксид азота образуется из L -аргинина при'участии L- аргинин-N0 -синтазы. Этот фермент оказался широко распространенным.. Эндогенное образование N0 из L-.аргинина показано, в разных органах, и 'тканях. Обнаружена важная роль оксида азота- в. процессах: цитотоксичноати, в осуществлении межклеточных ' коммуникаций в.нервной: системе, в поддержании сосудистого тонуса. -Эндогенный НО является мощным фактором: гемостаза.11В настоящее время оксид, азота рассматривается: как, эндогенный вазодилятатор. Его антигипертензивіше и антиагрегационные свойства непосредственно связаны- с- прямой стимуляцией растворимой ГЦ по гемзависимому механизму и: накэшгением цГШ>. .. - ^.
Таким образом, гему ГЦ принадлежит важная: роль в. механизме сосудорасширяющего действия no- содержащих соединений. Известно, что гем. лабильно связан .с- бедково,* молекулой. ГЦ и может- отщепляться при повішений рН, хранении,, некоторых способах очистки и т.д. Прочность связи гема с ферментом зависит от источника фермента. Данных о возглояности существования, растворимой.ГЦ изначально в гем-дефицитной форме в тканях в литер'туре нет. В то ке время очевидно, что гемдефицитность будет приводить к царупению эндогенной регуля-. иди ГЦ, процессов поддержания тонуса сосудистой стенки и регуляции просвета сосудов, нарушению процессов агрегации тромбоцитов, снияе-
нию эффективности действия сосудорасширяющих и антиагрегационных препаратов. В связи с этим изучение роли гема в функционировании ГЦ является актуальным не только в теоретическом плане, но и для решения задач практической медицины.
Цели и задачи исследований,-
Объектом исследования била выбрана ГЦ тромбоцитов человека, так как этот фермент на 95-98$ находится в растворимой форме, обладает высокой активностью, содержит гем y потому высоко чувствителен к действию но- содержащих соединений, и в том числе нитро-пруссида натрия. Ранее нами было показано, что ГЦ тромбоцитов крысы не активируется нитропруссидом,- что, в отличие от общепринятых представлений, могло указывать на возможную гемдефицитность этого фермента. В литературе мы не обнаружили сведений о растворимой ГЦ тромбоцитов крысы. Все это обусловило наш интерес к ферменту из этого источника. Целью настоящей работы явилось изучение ро„л гема в функционировании растворимой ГЦ тромбоцитов человека и крысы, в проявлении гипотензивных свойств N0- содержащими соединениями на примере нитрозокомплексов переходных металлов,, а также изучение образования оксида азота в тромбоцитах челов.ка с целью разработки новых подходов к поиску эффективных антигипертензивных ."екарствев-ных препаратов на основе изучения растворимой ГЦ.
В связи с этим-необходимо было репгтгь следующие задачи:
-
Получить в гевдефицитной форме растворимую ГЦ тромбоцитов человека и красы и провести сравнительное исследование свойств этих ферментов до и после удаления гема.
-
Исследовать влияние водорастворимого антиоксданта р-аланин-Ь-гистидина (карнозина) н. активность и активацию нитропрусспом натрия ГЦ тромбоцитов человека.
-
На примере нитрзокомлексов переходных металлов Ро, Со, Сг изучить связь мевду механизмом активации ГЦ тромбоцитов' человека
и крысы этими соединениями и их способностью проявлять гипотензивные свойства.
4. Выявить возможность эндогенного образования оксида азота в тром
боцитах человека и применить полученные данные для.разработки но
вых подходов к созданию эффективных сосудорасширяющих лекарствен
ных средств на основе изучения растворимой ГЦ и КО -сичтазы, ис
пользуя соединения, содержащие в своей молекуле одновременно гуанЕ
липовые и тиоловые группы.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые описаны некоторые основные свойства растворимой ГЦ тромбоцитов крысы и сделан вывод, что гем не является, в отличие от общепринятых представлений, простетической группой этого фермента. В связи с этим ГЦ из этого источника не может служить моделью для изучения действия no-содержащих соединений на тромбоцитарный фермент.
Впервые показано, что растворимая ГЦ тромбоцитов человека
также может существовать изначально в гемдефицитной форме, что мо
жет привести к нарушению гемостаза, обусловить недостаточную эф
фективность действия антиаг'регационных препаратов и потребовать
разработки новой стратегии в применении лекарственных средств в
подобных случаях. ^;
Установлено, что водорастворимый антиоксидант jJ-аланин -L гистидин (карнг,зин) тормозит только специфическую гемзависимую активацию ГЦ нитропруссидом натрия и может быть использован з качестве теста на гемдефицитность фермента и для выявления гемзави-симого характера активации ГЦ.
На примере изучения механизма активации ГЦ нитрозокомплексамн переходных металлов Fa, Со и Сг установлено, что для проявления гипотензивных свойств необходима активация только по гемзави-симому механизму.
Впервые показана активация ГЦ тромбоцитов человека соединениями, содержащими в молекуле одновременно гуаншшновые и тиоловые группы за счет образования внутримолекулярных нитрозотиолов.
Полученные данные позволяют предложить новый подход к разработке и созданию эффективных вазодилятаторов на основе изучена* гуанилатциклазной и NO-синтазной систем. Можно'ожидать, что при этом-не будет развиваться толерантность, возникающая при применении органических нитратов и связанная с истощением эндсге ных тио-лов..
Апробация работы состоялась на совместной научной конференции іаборатории экстремальных' состояний и лаборатории биохимии и патохи-таи гуанилатциклазной системы 18 мая 193г.
Основные положения диссертации, докладывались на VI Всесоюзном Симпозиуме "Роль циклических нуклсотидов" и вторичных посредников в зегуляции ферментативных реакций" (3-7 октября 1988г.), Петрозаводск. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, включая 15 рисунков и 17 таблиц. Состоит из введения и разделов: "Обзор литературы" ( главы "Свойства растворимой и мембранно-связанной форм гуанилатциклазы", "Оксид азота: биосинтез и биологическая роль" и "Биологическая роль циклического гуанозинмонофосфата'У, "Материалы и методы исследований", "Результаты исследований", "Обсуждение", "Выводы" и списка цитируемой литературы.
Объектом исследования служили тромбоциты крови человека и крысы. Донорскуо кровь получали в Гематологическом научном центре.
Выделение тромбоцитов из кропи человека и крысы. Тромбоциты человека выделяли из крови здоровых доноров в соответствии с описанной методикой (Чирков'и др., 1987), используя в качестве антикоагулянта 0.IM раствор ЭаТА в 0,9/. ДаС1, (рН 7,4 при 20С ). Для получения тромбоцитов высокой степени чистоты из обогащенной плазмы применяли Ficoii-Paq.ue. Полученный промытый осадок тромбоцитов ресуспендировали в 50мМ трис- неї, рН 7,6 при 0С, содержавшем 0,2 мМ дитиотрейтол (ДТТ).
Выделение тромбоцитов из крови крысы проводили аналогично выделению тромбоцитов человека, согласно методике ( Мирошниченко и др.,1988) с некоторыми модификациями: а/ в качестве антикоагулянта использовали 0,2М ЭДТА в 0,952 HaCl,' ( рН 7,4 при 20С ); б/ для получения богатой тромбоцитами плазмы гэльную кровь разводили 20мМ трис- неї буфером в 0,9$ НоС1( рН 7,4 при 20С ) в равном соотношении е.,буфером. Осадок промгтых тромбоцитов ресуспендировали в 20мМ трис- неї буфере, ( рН 7,6 при 0С ), содержащем или не содержащем ДТТ в зависимости от задач эксперимента.
Тромбоциты разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE 5-78 ( Великобритания) в течение 20 сек. при амплитуде Ібмкм на холоду и центрифугировали в течение I часа при 105000g на ультрацентрифуге Beokman L5-65( Австрия). Супернатант использовали в качестве препарата растворимой ГЦ.
Определение активности ГЦ тромбоцитов человека и крысы. Определение активности ГЦ проводили в соответствии с описанной методикой (Чирков Ю.Ю. и др., 1987). В состав реакционной смеси объемом 150мкл входили: 50мМ трис-НС1 ( рН 7,6 при 37С ), ІмМ ГТФ,
\
4мМ MnCl2 либо Mgci2 , 4мМ креатинфосфат, 20мкг (120-160 ед) креатинфосфокиназы, ЮмМ теофиллин, супернатант IOSOOOg или злюат после ионно-обменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в количестве 10-20 мкг или 2-2,5. мкг по белку, соответственно, и необходимые добавки. Инкубацию проводили в течение 10-20 мин. в зависимости от задач эксперимента. Реакцию останавливали нагреванием проб в течение 2 мин. при 90С с последующим,охлаждением во льду. Денатурированный белок отделяли центрифугированием при I500g в течение 15 мин. В полученном осадке определяли содержание образовавшегося цГМФ. Количество цГМФ в пробах определяли радиоимунным методом при помогти набора реактивов оСМР RIA Kit ("Aaeraham", Великобритания) по прилагаемой методике. Радиоактивность определяли на счетчике Rack-beta I2II (1KB, Швеция ).
Ионно-обменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 52.
Йоняо-обменную'хроматографию супернатанта I05000g проводили на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой 52 (« Whatman1} Великобритания). Колонку уравновешивали 50мМ тряс-"неї буфером, ( рН 7,6 при 4С), содержащим 0,2мМ ДТТ. Супернатант 105000s в количестве 2-4 мкг белка в объеме 1-2 мл наносили на колонку, Элюцию проводили тем яе бу-.фером, содержащим градиент UaCl 0Т0,.5 М или ступенчато, 0,22 Ш N8C1. Наличие белка во фракциях регистрировали, с помощью измерения
ПОГЛОЩеНИЯ При 280 НМ ( ОДНОЛучеВОЙ датчик иУ-І,пРЬагтас1а?ІІІВЄЦИЯ ')«
Фракции, содержавшие гуанилатциклазную. активность, объединяли и использовали для дальнейших исследований.
Другие методы. -
Содержание белка' определяла шэ, методу Лоури. ( Лоури et al»1955).
Спектры поглощения исследовали на спектрофотометре г>и-50(вВескшап"
Австрия )..* '