Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одной из важных задач современной биохимии и биотехнологии является разработка подходов к подавлению белковой агрегации, а также поиск путей разрушения уже сформировавшихся белковых агрегатов различных типов. Необходимость перевода белка в растворимую ренатурированную форму из агрегатов приобрела особое значение в последнее время, поскольку многие рекомбинантные белки, продуцируемые в бактериальных клетках, образуют нерастворимые тельца включения (Carrio and Villaverde, 2002). Не меньший интерес представляют подходы к растворению амилоидных агрегатов, образующихся в нервных тканях при нейродегенеративных заболеваниях (Ashe and Aguzzi, 2013; Kalia et al, 2013; Kazantsev and Kolchinsky, 2008).
Существующие методы разрушения телец включения и подавления их образования недостаточно эффективны и требуют индивидуального подхода к каждому белку (Burgess, 2009; Singh and Panda, 2005). Так, введение в последовательность белка точечных мутаций, приводит к некоторому увеличению доли растворимой формы, но не решает проблему в целом (Ventura, 2005). Еще одним перспективным подходом для решения обоих типов задач считалось использование шаперонов (Swietnicki, 2006; Ben-Zvi and Goloubinoff, 2001). Однако существование большого числа разных шаперонов, обладающих различным, а иногда и противоположно направленным действием, и сложность одновременной экспрессии в клетках шаперонов и целевых белков не позволили разработать эффективные подходы для растворения телец включения.
Следует также отметить, что изучение белок-полиэлектролитных взаимодействий становится в последнее время все более актуальным. Это обусловлено большим потенциалом полиэлектролитных комплексов для решения целого ряда задач, таких как создание функциональных
нанокомплексов и иммобилизация белков. Одним из возможных приложений может стать как раз борьба с белковой агрегацией (Shalova et al., 2005; Stogovetal., 2010).
Цель работы. Установление механизма растворения белковых агрегатов с помощью полиэлектролитов.
Были поставлены следующие задачи:
исследование механизмов взаимодействия полианионов со свободными белками и факторов, влияющих на этот процесс;
сравнение особенностей взаимодействия с белками полианионов, содержащих различные заряженные группы, а также их влияния на тепловую агрегацию связанного белка;
тестирование ряда синтетических полиэлектролитов на способность к растворению различных типов белковых агрегатов -аморфных и амилоидных телец включения, а также агрегатов, образованных в результате термоиндуцированной денатурации;
Научная новизна. Все полученные в работе результаты являются принципиально новыми либо расширяют уже имеющиеся представления. Так, впервые показано, что полифосфаты менее прочно связываются с белком, чем полисульфоанионы, и вследствие этого не оказывают, в отличие от полисульфоанионов, денатурирующего воздействия на его структуру. Тем не менее, они способны практически полностью подавлять белковую агрегацию, хотя и менее эффективно, чем сульфосодержащие полианионы.
Детально исследован механизм взаимодействия полианионов с белком. Обнаружено, в частности, что связывание полисульфоанионов происходит в два этапа. При небольших величинах молярного соотношения полианион/белок не наблюдается значительных изменений в
структуре белка, но при большом избытке полисульфоанионов начинается дополнительное взаимодействие, приводящее к денатурации связанного белка.
Впервые показана возможность растворения белковых агрегатов различных типов (как аморфных, так и амилоидных телец включения и агрегатов, образующихся в результате тепловой денатурации) синтетическими полисульфоанионами. Изучено влияние степени полимеризации полианиона и его гидрофильности на эффективность растворения агрегатов. Предложен возможный механизм исследуемого процесса. Предложенный способ позволил значительно снизить амилоидные свойства агрегатов овечьего приона, а в случае агрегатов, образованных в результате термоиндуцированной агрегации, удалось добиться не только растворения, но и значительного восстановления активности белка.
Научно-практическая значимость работы. Разрабатываемый в работе подход к борьбе с агрегацией может быть применен как в биохимии, так и в биотехнологии. Отдельно стоит отметить возможность применения предложенного подхода для растворения уже сформированных агрегатов, поскольку по сей день не существует универсального метода решения этой проблемы. Кроме того, полученные результаты могут быть в перспективе использованы в медицине, в частности, для профилактики и лечения нейро дегенеративных заболеваний, связанных с образованием телец включения в нервных тканях. Наконец, выявленные закономерности взаимодействия полиэлектролитов с белками, помимо прикладного значения (к примеру, для создания белок-полиэлектролитных нанокомплексов), имеют чисто научное значение, в частности, для понимания механизмов функционирования клетки и ее систем регуляции.
Апробация работы проведена на совместном заседании лаборатории молекулярной организации биологических структур, лаборатории ферментных систем, лаборатории инженерной энзимологии, лаборатории молекулярной инженерии и лаборатории молекулярной генетики Института биохимии им. А.Н. Баха РАН 3 октября 2013 года. Кроме того, результаты работы были представлены на следующих конференциях: The EMBO Meeting (Амстердам, Нидерланды, 2013), Biocatalysis-2013 (Москва, 2013), 22nd ШВМВ & 37th FEBS Congress (Севилья, Испания, 2012) и X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2011). Результаты работы отмечены стипендией Президента Российской Федерации молодым ученым, осуществляющим перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики (2013 - 2015), стипендиями МГУ имени М.В.Ломоносова молодым преподавателям и научным сотрудникам, добившимся значительных результатов в преподавательской и научной деятельности (2012, 2011) и премией им. А.Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова (2012).
Публикации. По материалам работы опубликовано 7 печатных работ, включая 2 статьи в рецензируемых научных журналах и 5 тезисов докладов на международных конференциях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 106 страниц машинописного текста, в том числе 27 рисунков. Список литературы включает 145 источников.
Список используемых в тексте сокращений, не являющихся общепринятыми: GFP - зеленый флуоресцентный белок, РгР - прионный белок,
ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ДС - полисульфат декстрана, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, ДСР - динамическое светорассеивание, ИТК - изотермическая титрационная калориметрия, КД -круговой дихроизм, ПВС - поли(винилсульфат), ПСС - поли(стиролсульфонат), индекс около аббревиатуры полимера означает количество заряженных групп в цепи, ПФ - полифосфат, ТВ - тельца включения.
