Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор
2.1. Протеолитические ферменты - общая характеристика . 8
2.2. Протеолитические ферменты растений. 12
2.3. Протеазы семян растений. 14
2.4. Протеазы семян бобовых. 18
2.5. Протеолитические ферменты соевых бобов. 26
2.6. Белковые ингибиторы протеаз в растениях. 30
2.7. Белковые ингибиторы семян растений как регуляторы активности собственных протеаз 35
3. Материалы и методы исследования
3.1. Характеристика объекта исследования 42
3.2. Обезжиривание измельченного материала 42
3.3. Проращивание семян сои 43
3.4. Определение белка по методу Лоури 43
3.5. Определение активности протеаз по методу Ансона 43
3.6. Определение начальной скорости реакции, протеолиза сывороточного альбумина 45
3.7. Выделение .протеаз сои
3.7.1. Выбор.экстрагента для извлечения, протеаз сои 47
3.7.2. Выбор оптимального времени извлечения ферментов 47
3.8. Лиофилизация препаратов протеаз и белковых ингибиторов . 47
3.9. Гель-хроматография препаратов протеаз и ингибиторов 50
3.10. Ионообменная хроматография. 50
3.11. Изоэлектрическое .фокусирование 51
3.12. Аффинная хроматография 52
3.13. Электрофорез в ПААГ 53
3.14. Получение зимограмм протеаз после диск-электрофореза в ПААГ 54
4. Характеристика протеолитйчкскйх ферментов сой
4.1. Определение оптимума рН действия протеаз 55
4.2. Осаждение протеаз сои при изменении рН 58
4.3. Стабильность протеаз при хранении измельченного материала и препаратов ферментов 63
4.4. Влияние температуры на активность протеаз сои 69
4.5. Влияние активаторов и ингибиторов на протеазы сои 71
4.5.1. Влияние активаторов и ингибиторов тиоловых протеаз 71
4.5.2. Влияние ингибиторов сериновых протеаз 73
4.5.3. Влияние ЭДТА на активность протеаз сои 76
4.5.4. Влияние"триптофана и тирозина на активность протеаз 78
4.5.5. Влияние Nace на активность протеаз 80
5. Очистка протеаз сои
5.1. Выделение и очистка нейтральных протеаз сои 83
5.1.1. Фракционирование протеаз сульфатом аммония 83
5.1.2. Осаждение нейтральных протеаз при подкислении 85
5.1.3. Ионообменная хроматография нейтральных протеаз 85
5.1.4. Схема очистки нейтральных протеаз 87
5.2. Выделение и очистка щелочных протеаз сои 89
5.2.1. Осаждение щелочных протеаз при подкислении 89
5.2.2. Ионообменная хроматография щелочных протеаз , 89
5.2.3. Аффинная хроматография щелочной протеазы I 95
5.2.4. Схема очистки щелочных протеаз сои 99
6. Характеристика очищенных препаратов протеаз сои
6.1. Характеристика очищенного препарата нейтральных протеаз 102
6.1.1. Определение оптимума рН 102
6.1.2. Влияние активаторов и ингибиторов 102
6.1.3. Определение молекулярной массы 104
6.1.4. Определение однородности препаратов нейтральных протеаз методом электрофореза в ПААГ 105
6.2. Характеристика очищенного препарата щелочных протеаз сои 108
6.2.1. Определение оптимума рН 108
6.2.2. Влияние активаторов и ингибиторов 108
6.2.3. Определение молекулярной массы. НО
6.2.4. Определение однородности препаратов щелочных протеаз методом электрофореза в ПААГ 112
6.2.5. Определение изоэлектрической точки щелочной протеазы 112
7. Белковые протеаз сои и их взаимодействие с ферментами сои .
7.1. Взаимодействие протеаз сои с ингибиторами надосадочной жидкости 118
7.2. Выделение белковых ингибиторов из надосадочной жидкости 122
7.3. Гель-фильтрация препарата белковых ингибиторов на сефадексе в -75 124
7.4. Электрофорез в ПААГ препаратов белковых ингибиторов 128
7.5. Изоэлектрическое фокусирование препарата ингибиторов 128
7.6. Схема выделения препаратов ингибиторов 130
7.7. Аффинная хроматография протеаз сои на иммобилизованных белковых ингибиторах 133
8. Действие протеаз сои на собственные белки . 140
9. Изменение активности протеаз и их ингибиторов при прорастании семян сои. 143
10. Выводы. 149
11. Список литературы, 151
- Протеолитические ферменты - общая характеристика
- Лиофилизация препаратов протеаз и белковых ингибиторов
- Стабильность протеаз при хранении измельченного материала и препаратов ферментов
- Ионообменная хроматография нейтральных протеаз
Введение к работе
В решениях ХХУІ съезда КПСС большое внимание уделяется проблеме кормового белка, преимущественно за счет увеличения производства зернобобовых культур и, в частности, сои.
Соя отличается богатым химическим составом. В ее семенах содержится до 45% белка, довольно высокое количество масла /19-2496/, большое разнообразие зольных элементов, витаминов, ферментов и других ценных веществ. Белок сои по составу аминокислот и усвояемости близок к белкам животных.
Являясь одновременно кормовой, технической и продовольственной культурой, соя не имеет себе равных по многообразию и универсальности использования. Из ее зерна можно изготовить более 300 видов продукции - от авиационного масла и пластмасс до соевого молока и конфет. Сою используют в кондитерской, хлебопекарной, мясной и других областях пищевой промышленности. Добавляя, например, соевые обогатители к мясным изделиям, получают вкусные и питательные продукты, пользующиеся большим спросом во всем мире.
В фармакологической промышленности сою используют как сырье для приготовления препаратов, которые улучшают деятельность головного мозга, а также при лечении диабета. Употребление в пищу соевого масла предупреждает гипертонию и атеросклероз.
Соевый шрот в качестве белковых добавок является наиболее экономичным и доступным источником белка в кормах для скота и птицы. По данным Министерства сельского хозяйства СССР себестоимость белка из шрота сои ниже по сравнению с себестоимостью белка из других культур. Так, І т белка из соевого шрота стоит 50 руб, а из семян гороха - 260 руб.
За последние 50 лет мировое производство сои возросло в б раз и достигло в настоящее время более 80 млн.т , что составляет половину мирового производства зернобобовых культур.
По динамике роста производства соя превосходит не только распространенные масличные и зернобобовые, но и зерновые культуры. Так, валовой сбор урожая зерна еще в 1974 году / в % к среднему за 1952-1956 гг/ составил для сои - 244, кукурузы - 210, пшеницы -175.
Характерный для сои большой видовой полиморфизм и относительная пластичность в приспособлении к условиям внешней среды являются предпосылкой дальнейшего расширения ее ареала в разных странах.
Несмотря на все достоинства этой культуры, ее громадное народно-хозяйственное значение, до настоящего времени она не получила дальнейшего распространения в нашей стране.
Продовольственной программой, одобренной .майским /1982г./ \ Пленумом ЦК КПСС, предусматривается обеспечить производство зернобобовых культур в 1985 г. в количестве 12 - ,14 млн.т и в 1990 г. -18 - 20 млн.т. Среднегодовое производство соевых бобов к 1985 г. намечено довести до 1,4 млн.т , а к 1990 г. до 2,2 - 2,3 млн.т , т.е. с ростом в 1,6 раза.
ЦК КПСС и Совет Министров СССР обязали местные партийные и советские органы усилить работу не только по расширению площадей под соей, но и создания материальной базы по переработке ее зерна и зеленой массы. В нашей стране на I98I-I985 гг. принята программа по созданию и внедрению высокопродуктивных сортов сои интенсивного типа для возделывания, разработке технологических приемов возделывания, уборки и послеуборочной переработки зерна сои. В ней предусмотрен ряд крупных заданий, успешное решение которых, должно обеспечить увеличение производства семян этой культуры, повышение качества получаемой из них продукции. В выполнении программы участвуют свыше 50 научно-исследовательских и проектно конструкторских организаций.
Выполняемые в нашей стране исследования по культуре сои в основном посвящены вопросам селекции и агротехники новых .сортов, высокоурожайных и приспособленных к климатическим условиям страны.
За рубежом значительную часть исследований сои составляют как теоретические, так и прикладные работы по изучению биохимии запасных белков, белковых ингибиторов протеаз и других биологически активных соединений, а также изучению свойств компонентов сои, определяющих возможности использования ее для производства широкого спектра пищевых, кормовых, медицинских, технических -продуктов.
Проведение исследований с отечественными сортами сои не может ограничиться простым переносом методологии, а требует оригинальных разработок из-за отличия химического состава и разных технологических целей.
До сих пор протеазы сои не были объектом детальных .исследований и остаются малоизученными. Не ясен вопрос о механизмах регуляции активности протеолитических ферментов в семенах сои и роли в этом процессе ингибиторов протеаз белковой природы, которыми особенно богаты соевые бобы.
Исследование протеаз сои важно также с технологической точки зрения, поскольку соевые бобы находят широкое применение и состояние белкового комплекса во многом определяется состоянием протеолитических ферментов.
Целью настоящей работы являлось выделение и исследование протеолитических ферментов соевых бобов, а также изучение регуляции их активности при покое и прорастании.
Протеолитические ферменты - общая характеристика
Протеолитические ферменты играют важную роль,в обмене веществ всех живых организмов, начиная от бактерий и низших грибов, кончая высшими растениями, животными и человеком. Исключительно важен при этом внутриклеточный протеолиз, являющийся составной частью обмена белков, интерес к которому в последние годы быстро растет.
Все возрастающее число данных о роли протеаз в разнообразных физиологических процессах свидетельствует о том, что протеазы играют во многих из них ключевую роль, выполняя самые различные ре-гуляторные функции, характерной особенностью которых являются однонаправленность и необратимость действия /Антонов,1983/.
Регуляторная функция протеолитических ферментов связана с протеолизом двух.типов - полной деградацией белковых молекул и ограниченным протеолизом /Локшина,1979/.
В первом случае протеазы определяют скорость распада белков в.организме и участвуют в регуляции их кругооборота. Путем полной деградации осуществляется и удаление из организма "ненормальных" белков, образующихся в результате мутаций или ошибок биосинтеза.
Содержание дефектных белков, по мнению некоторых авторов, может составлять до 15% /Дин,1981/.
В ходе ограниченного протеолиза происходит специфическое расщепление в белке пептидных связей, приводящее к перестройке его структуры и изменению функций /Степанов,1979/.
Приведенные в обзоре данные /Локшина,1979/ показывают, что протеазы, во-первых, участвуют в процессинге белка, удаляя сигнальную аминокислоту и сигнальный пептид, т.е. биосинтетические "излишки" трансляции и транспорта полипептидной цепи /Ленинджер, 1976 ; Стент, Кэлиндар,1981/ ; во-вторых, активируют неактивные предшественники - своего рода резервную форму физиологически активных белков и пептидов, что зачастую служит началом физиологических процессов /Кретович,19б7 ;/Veurath ,Watsh ,1976 ;Фершт,І980/ ; в-третьих, вызывают модификацию и инактивацию биологически активных белков, что может приводить к выключению и переключению физиологических процессов и перестройкам обмена /Шульц,Ширмер,1982 ; Локшина,1977,1979/.
Протеолитические ферменты привлекают внимание исследователей, занимающихся вопросами белковой химии, поскольку они являются рабочим инструментом при изучении первичной структуры белков и пептидов. Ввиду доступности в чистом виде и в сравнительно больших количествах протеазы являются также удобным объектом для изучения первичной, вторичной и третичной структуры белков, изучения строения активных центров ферментов, регуляции ферментативной активности и решения других актуальных проблем современной энзимологии и молекулярной биологии.
Существенным стимулом изучения протеолитических ферментов, являются растущие перспективы их использования в народном хозяйстве /Кретович,1967/. Протеолитические ферменты по современной классификации отно 10 сятся к классу гидролаз, в составе которого образуют особый подкласс пептидгидролаз / Н.Ф.З.4./ /Номенклатура ферментов,1979/. Классификация протеолитических ферментов отличается от принятой для других групп ферментов /Диксон, Уэбб,1982/. По классификации Бергмана протеазы разделяются на две группы: экзопептида-зы, действующие на концевых участках полипептидной цепи, и эндо-пептидазы, действующие на центральных участках. Если экзопептида-зы разделяются на подподклассы /3.4.II - 3.4.17/ на основании их специфичности, то эндопептидазы разделены на 4 подподкласса /3.4.21 - 3.4.24/ в .первую очередь на основании особенностей строения каталитического центра. Полные данные об этом имеются лишь для немногих ферментов, однако обычно оказывается достаточной идентификация функциональных групп, образующих активный центр, что достигается применением специфических ингибиторов /Дин,1981/. Такие признаки, как рН-зависимость активности, субстратная специфичность имеют подчиненное значение. Протеазы, о механизме действия которых ничего не известно, относятся к подподклассу 3.4.99. Большинство протеаз представляют собой небольшие мономерные ферменты с молекулярной массой от 15000 до 35000. Однако, встречаются протеазы с молекулярной массой 60000-70000. Исключение составляет лейцинаминопептидаза, молекулярная масса которой составляет 250000. Благодаря этому они являются наиболее изученными ферментами, поскольку легко поддаются кинетическим и структурным исследованиям. Сериновые протеазы /Н.Ф.3.4.2І/ составляют обширную и наиболее изученную группу ферментов /Степанов,1973/. Для всех этих ферментов характерно наличие цепи переноса заряда /"эстафета заряда"/, в которой участвует "триада" - остатки аспарагиновой кислоты, гистидина и серина. Другая общая черта -"оксианионная впадина" - важный элемент, стабилизирующий переходное II состояние. Важны .участки пептидной цепи, участвующие в связывании субстрата /3 ершт,1980/. Активность ферментов подавляется эфирами фосфорной кислоты типа диизопропилфторфосфата, арилсульфогалогени-дами, а также субстратоподобными галоидметилкетонами /Антонов,1983/. Большинство тиоловых протеаз /Н.Ф.3.4.22/ относится к семейству папаина /Степанов,1973/. В активном центре этих ферментов содержится остаток цистеина и имидазольная группа гистидина. Интересно, что для них характерен сходный тип специфичности, зависящий от аминокислотного остатка, удаленного на один остаток от атакуемой связи, и аналогичный способ активации, основанный на расщеплении несимметричного дисульфида, которое освобождает сульфгидриль-ную группу активного центра /Фершт,І980/. В силу указанного, ферменты характеризуются общими свойствами /Мосолов,1971/. Во-первых, активность ферментов повышается в присутствии восстанавливающих веществ, к числу которых относятся различные соединения, содержащие сульфгидрильную группу /цистеин, глютатион, 2-меркаптоэтанол, 2,3-димеркаптопропанол/, борогидриды, сульфиды, бисульфит и др. Многие ферменты активируются солями синильной кислоты. Во-вторых, активность тиоловых протеаз подавляется тремя различными группами веществ - веществами, специфически блокирующими сульфгидрильные группы в белках /алкиляторы, ртутьорганические соединения/, окислителями и солями тяжелых металлов. Большинство ферментов, относящихся к этому подподклассу, имеют растительное происхождение. Каталитический центр кислых протеаз / Н.Ф.3.4.23/ содержит как минимум две карбоксильные группы /Фершт,1980/. Одна из них специфически блокируется ингибиторами, содержащими диазоацетильную группу, другая, вероятно, избирательно реагирует с эпоксисоедине-ниями /Антонов,1983/. Применение обоих типов ингибиторов существенно облегчает идентификацию кислых протеаз. Имеются лишь разрозненные сведения о кислых протеазах,растений /Степанов,1979/. Металлрпротеазы /Н..2.4.24/ являются наименее изученным;, подподклассом ферментов /Степанов,1973/. Имеют черты сходства с механизмом действия других протеаз, но обладают характерным механизмом действия, существенную роль в котором играет ион металла /Фершт,1980/.
Лиофилизация препаратов протеаз и белковых ингибиторов
В работах Шаненко /1980/ отмечалась ингибирующая роль ионов СІ" при действии на протеазы пшеницы. Подобные результаты были отмечены в работе ,/Laafer et a .,1944/ в отношении протеаз сои. Наши данные подтвердили ингибирующее действие л/aCt на изучаемые протеазы. В работе использовали хлорид натрия марки х.ч. В ходе опыта проводили прединкубацию ферментов с datl в течение 20 минут, в концентрациях /JoS& от 0 до 1%, затем вносили субстрат. Данные представлены на рис.22. Активность щелочных протеаз угнетается л/aGC в.большей степени, чем нейтральных. Так, при концентрации tJoSZ 1% в реакционной смеси, активность нейтральных протеаз составляет 50 от исходной, а щелочных - лишь 2095. Ингибирование fJoSl носит обратимый характер. Например, если исходная активность щелочных протеаз равна 0,210 единиц, то при внесении 1% iJcSl на мл реакционной смеси она подавляется на 65# и составляет 0,070 единиц. При снижении концентрации VaC6 в реакционной смеси активность протеаз восстанавливается до исходного значения. Суммируя изложенное в данной главе следует еще раз подчеркнуть, что в семенах сои содержатся две .ранее не описанные группы протеолитических ферментов, которые различаются оптимумами рН действия, отношением к температуре, активаторам и ингибиторам. Одни из них, гидролизующие .бычий сывороточный альбумин при рН 6,8-7,0, были названы нами нейтральными протеазами, другие, гидролизующие альбумин при рН 8,4-8,5 - щелочными протеазами. На основании проведенных опытов нейтральные протеазы сои можно отнести к тиоловым протеазам, .поскольку их активность полностью подавляется, аналогично папаину, в присутствии 0,56 мМ/мл -ХМБ и увеличивается.в 2-2,2 раза в присутствии глютатиона /10 мМ/мл/ и цистеина /8 мМ/мл/. Полученные результаты не позволяют(отнести щелочные протеазы к какой-либо определенной группе протеолитических ферментов по современной номенклатуре. Активность щелочных протеаз угнетается на 25-ЗСЖ в присутствии диизопропилфторфосфата /0,54 мМ/мл/ и фенилметилсульфонилфторида /1,82 мМ/мл/. Нейтральные протеазы не изменяют своей активности в присутствии этих реагентов. Нашими опытами впервые показано, что ингибитор Кунитца /коммерческий/ является эффективным ингибитором собственных протеолитических ферментов. В концентрации I мг/мл, достаточной для подавления трипсина, ингибитор Кунитца угнетает активность нейтральных протеаз на ЗСРА и активность щелочных протеаз на 100 . По-видимому, данные ферменты не являются металлоэнзимами, так как ЭДТА не оказывает влияния на их активность. Щелочные протеазы ингибируются полностью тирозином и триптофаном в концентрации 0,25 мг аминокислоты на мл. Активность нейтральных протеаз при тех же условиях подавляется на 50 тирозином и на 70 триптофаном. Результаты, полученные с аминокислотами тирозином и триптофаном, хорошо сопоставимы с результатами Шаненко /1980/, что позволяет делать аналогичные выводы о возможности расщепления белков исследуемыми протеазами по связям, образованным тирозином и триптофаном. Так же, ,как и в случае .нейтральных .протеаз пшеницы, активность исследуемых;нами протеаз сои угнетается в присутствии ионов С1 . Причем это ингибирование ,носит обратимый характер. Полученные результаты требуют уточнения на более очищенных препаратах протеаз сои., Поэтому следующий раздел посвящен изложению разработки схем очистки исследуемых ферментов. Как показали наши исследования нейтральные и щелочные протеази сои извлекаются из измельченного материала водой. При такой экстракции извлекается значительное количество балластных белков, большую часть из которых составляют запасные белки. Исследования, проведенные рядом авторов /Шутов, Вайнтрауб, 1966 ; и др./, по фракционированию запасных белков бобовых культур сульфатом аммония показали, что значительная часть запасных белков бобовых осаждается из растворов при 50-85% насыщении сульфатом аммония. Поэтому представляла определенный интерес возможность разделить исследуемые нами ферменты и запасные белки. Мы применили ступенчатое фракционирование сульфатом аммония. В исходный водный экстракт последовательно вносили сухой сульфат аммония. Раствор тщательно перемешивали, после каждой стадии выдерживали в течение I часа для формирования осадка на холоду. Затем центрифугировали в течение 20 минут при 6000 об/мин. Полученные осадки перерастворяли в 0,35% растворе соды. В перерастворенных осадках определяли активность по Ансону и белок по Лоури.
При ступенчатом осаждении протеаз из водного экстракта сульфатом аммония около половины белков, находящихся в растворе, переходит в осадок при внесении сульфата аммония до 40% от полного насыщения /таблица &/. При этом осаждается до 70% нейтральных и до 90% щелочных протеаз. При дальнейшем внесении сульфата аммония до 70% насыщения в осадок переходит лишь 18% нейтральных и 18% щелочных протеаз.
Стабильность протеаз при хранении измельченного материала и препаратов ферментов
Известно, что в семенах сои содержится большое количество различных белковых ингибиторов протеаз. К настоящему времени их описано более 12 /Саянова и др.,1982/. Большинство этих ингибиторов, как было показано рядом исследователей, подавляет активность протеолитических ферментов животного и микробного происхождения. Это, в свою очередь, служило объяснением физиологической роли ингибиторов как веществ, обуславливающих защиту растений от инфекций. В литературе отсутствуют сведения о взаимодействии белковых ингибиторов сои с собственными протеолитическими ферментами. Некоторые авторы /Loafer et a .,1944 ; CatsLmpooas et at.,I97I/ отмечали, что ингибитор Кунитца /как наиболее исследованный/ из бобов сои не оказывает влияния на активность собственных ферментов.
Наши исследования показали, что коммерческий ингибитор Кунитца является эффективным ингибитором как щелочных, так и нейтральных протеаз /раздел 4.5.2./. Исходя из вышесказанного, мы провели работы по выделению белковых ингибиторов из семян сои, специфичных в отношении нейтральных и щелочных протеаз, а также изучению их взаимодействия с исследуемыми ферментами.
В работах Шаненко /1980/ и Тер-Мовсесян /1981/ было показано, что протеолитические ферменты семян злаковых осаждаются из содовых экстрактов при подкислении до рН 5,0 лимонной кислотой. При этом в надосадочной жидкости остаются ингибиторы, проявляющие активность в отношении как собственных протеолитических ферментов, так и протеаз другого происхождения /трипсина, папаина/. Аналогичные результаты,были получены нами.
Из водных экстрактов выделяли протеазы по принятой методике /раздел 4.2./. Полученную надосадочную жидкость нейтрализовали 0,1 н раствором МаОНдо рН 7,0 и определяли активность ингибиторов следующим образом. В предварительно термостатированные пробирки, содержащие по I мл препарата протеаз или трипсина /5 мг/мл /, вносили в нарастающих количествах надосадочную жидкость и доводили до объема 5 мл соответствующим буфером. Полученные смеси термоста-тировали в течение 20 минут при 40С Затем вносили субстрат. Результаты опытов выражали в % остаточной активности протеаз. При внесении надосадочной жидкости активность протеаз подавляется пропорционально количеству внесенного супернатанта /рис.42 /. Причем, активнорть щелочных; протеаз уменьшается в большей степени, чем активность трипсина и нейтральных протеаз..Так, I мл надосадочной жидкости /0,56 мг белка по Лоури/ подавляет активность щелочных протеаз на 50 , нейтральных .протеаз - на 30?6, трипсина -на 17#. Очевидно, что в надосадочной жидкости присутствует комплекс факторов, обуславливающих такое изменение активности. Мы разделяли этот комплекс гель-фильтрацией на сефадексе & -75.
Для работы использовали колонку с параметрами 485 х 20 мм. Общий объем колонки /выход тирозина/ V 0$ш = 156 мл, свободный объем /до выхода декстрана синего/ V а 46 мл, соответственно внутренний объем V вн = НО мл.
При фракционировании лиофилизированной надосадочной жидкости исходная смесь /образец 5 мл/ разделялась на 4 фракции /рис. 43/. В полученных фракциях определяли ингибирующую активность и содержание белка по Лоури.
Первые три пика выходили в объеме колонки: I и 2 пик объединяли белки, 3 пик - низкомолекулярные пептиды и аминокислоты. Четвертый пик представлял собой фракцию, выходящую за объемом колонки, и, возможно, представляет собой смесь соединений феноль-ной природы, поскольку известно, что фенолы могут взаимодействовать с матрицей сефадекса и задерживаться при элюции с колонки /Детерман,1977/.
Из опытов по определению ингибирующей активности, представленных в таблице II, следует, что около 60% исходной активности протеаз подавляется белковыми фракциями /I и П/, остальные 40% подавления обусловлены влиянием соединений иной природы. Характерно также, что I фракция в большей степени подавляет щелочные протеазы /38,5%/, П фракция - нейтральные /37,5% /.
Таким образом, при подкислении водного экстракта наблюдается разделение протеаз и их белковых ингибиторов. Протеолитические ферменты выпадают в осадок, в надосадочной жидкости остаются белковые ингибиторы.:
Из литературы, связанной с исследованием ингибиторов сои, /Мосолов,1971 ; Саянова и др.,1982/ известно, что большинство белковых ингибиторов имеют изоэлектрические точки в интервале 4,0 - 4,2. Исходя из,этого, мы попытались выделить ингибиторы при подкислении надосадочной жидкости, полученной после выделения протеаз.
Исходную водную вытяжку подкисляли до рН 5,0 для осаждения протеаз. Из полученной надосадочной жидкости последовательно осаждали белки подкислением до рН 4,0 ;3,5 ;3,0. Выделенные фракции белка растворяли в равных объемах 0,35% NazC03 . Ингибирующую активность оценивали по подавлению активности препарата протеаз. Результаты представлены на рис.44 . Наибольшей ингибирующей активностью обладали фракции, полученные осаждением в интервале рН 3,5 - 3,0. По щелочным протеазам она составляла 100%, по нейтральным - 75%.
Ионообменная хроматография нейтральных протеаз
Изменение активности протеаз при прорастании, участие протеаз в процессах мобилизации запасных белков, роль в этих процессах белковых ингибиторов протеаз вызывает большой интерес у исследователей по ряду причин как практического, так и физиологического порядка. И если в отношении участия протеаз в процессах прорастания сложились определенные представления и выявлены общие закономерности, то в отношении ингибиторов нет единства взглядов исследователей. Одни из них /Chrlspees et аС.,І977; МіКоба , Епагс ,1970/ считают, что тлеющиеся в семенах ингибиторы протеаз не связаны с регуляцией протеолиза запасных белков. Другие все же допускают участие ингибиторов в регуляции распада запасных белков /ShaLn ,Mayer ,1965 ; Аве et at .,1980/. Исследования, проводимые в течение ряда лет на кафедре "Биохимия и зерноведение" показали существование в семенах растений различных видов ингибиторов белковой природы, способных подавлять активность эндогенных протеолитических ферментов /Шаненко,І980 ; Тер-Мовсесян,1981/. Все эти данные указывают на участие ингибиторов в регуляции активности протеаз в метаболизме семян.
Исходя из изложенного, представляло определенный интерес исследовать изменение активности протеаз и их ингибиторов при прорастании сои.
Опыты по исследованию изменения активности протеаз и их белковых ингибиторов при прорастании проводили с семядолями семян сои, прораставших I - 9 суток.
В водных экстрактах, полученных из равных количеств семядолей семян, прораставших 1-4 суток, определяли активность протеаз по Ансону и белок по Лоури. Результаты приведены в таблице ІҐ4&. Содержание водорастворимых белков в экстрактах по мере прорастания семян увеличивается, что, очевидно, связано с дезагрегацией белковых комплексов при прорастании. Активность протеаз изменяется по-разному. Активность нейтральных протеаз почти вдвое увеличивается. Падение активности щелочных протеаз, приведенное в таблице, объясняется тем, что активность измерена в оптимуме для покоящихся семян /рН 8,2/. Наши дальнейшие исследования показали, что при прорастании сои наблвдается сдвиг оптимума рН действия щелочных протеаз от 8,2 до 8,5 /рис. 55 / и активность щелочных протеаз возрастает.
Важным показателем процессов прорастания является автолиз белков, поскольку активность протеолитических ферментов в данном случае непосредственно связана с расщеплением собственных белков, с интенсивностью этого процесса при прорастании.
Изменение .интенсивности автолитических процессов исследовали на препаратах, полученных из семядолей покоящейся и прораставшей 5-суток сои. Препараты получали осаждением.белков при подкислении до рН 5,0 водных экстрактов для отделения ингибиторов. Полученные осадки перерастворяли в равных количествах буферов с различными значениями рН. Длительность автолиза составляла 30 минут при 40С. Представленные на рис. 55 результаты опытов наглядно демонстрируют изменение характера автолиза белковых препаратов при покое и прррастании семян в интервале значений рН от 4,5 до 9,0.
Интенсивность автолитических процессов в кислой и нейтральной областях рН возрастает в 2,0 - 3,0 раза , в щелочной области возрастает лишь в 1,3 раза. Результаты проведенных .опытов указывают на участие как нейтральных, так и щелочных протеаз в процессах протеолиза при прорастании семян. Изменение активности ингибиторов протеаз при прорастании большинства бобовых культур исследовалось лишь в отношении ингибиторов экзогенных протеаз, таких как трипсин и химотрипсин, без взаимосвязи с изменением активности собственных протеаз. Лишь для чины /Бенкен,Кузнецова,1982/ была показана взаимосвязь автолити-ческих .процессов и активности ингибиторов трипсина и химотрипсина, Результаты изучения изменения активности ингибиторов.при прорастании приведены в таблице 146. Препараты протеаз .получали из семядолей покоящихся семян сои осаждением при -подкислении до рН 5,0. Препараты ингибиторов количественно, выделяли из равных количеств семядолей покоящихся и прораставших 3 и .9 суток семян сои осаждением в интервале рН .5,0-3,0 / рис. 50/. В реакционные смеси .вносили в нарастающих количествах препарат .ингибитора. Остаточную активность протеаз измеряли по принятой методике. Шла получена серия кривых для нейтральных и щелочных протеаз, где с увеличением количества ингибитора /в мг белка/ уменьшается активность фермента. Нами были выбраны значения остаточной активности при содержании белка 3 мг/мл. , Полученные итоговые данные наглядно представляют характер изменения ингибирующей .активности при .прорастании .семян сои. Если в отношении щелочных протеаз ингибирующая активность изменяется мало /на І5-2СК/, то в отношении нейтральных протеаз можно говорить о значительном падении ингибирующей активности. Разрушение ингибиторов нейтральных протеаз сопровождается увеличением активности протеаз и ростом интенсивности автолиза в нейт ральной области. 1. Показано наличие в семенах сои ранее не описанных протеолитическйх ферментов, различающихся оптимумом рН действия: нейтральных /рН 6,8/ и щелочных /рН 8,4/ протеаз. 2. Разработана схема выделения протеаз и их белковых ингибиторов, которая предусматривает получение очищенных нейтральных протеаз /комплексный препарат/, двух щелочных протеаз /щелочная протеаза I и щелочная протеаза її/ и двух типов белковых ингибиторов, специфичных для щелочных и для нейтральных протеаз.
