Введение к работе
Актуальность темы. Протеолитнческке ферменты находят самое разнообразное применение з химии для анализа химического состава неизвестных белков, а также белковых гормонов, в процессинге рекомбннантных белков (Sanger, Thomson, 1953; Hire et a!., 1960; Вольф, Рансберг, 1976; Ткачук и сотр., 1997), в медицине как противовоспалительные агенты, фибринолитические, неполитические, канцеростзтические и цитотохсическне вещества, в заместительной терапии при нарушениях пищеварения (Вольф, Рансберг, 1976; Веремеенко, 1971), в про?,шшленности: в дубильных процессах, для обработки шса, для получения белковых гндролгоатоз и шггательных сред, вакцин (Вольф, Рансберг, 1976; Ратушиый, 1976).
Однако, серьезным тормозом в широком применении ферментных препаратов является их дефицит и высокая стоимость. Традиционным источником получения трипсина и химотрипсниз яшкется поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней, ресурсы которых ограничены, так как основная масса кх используется для выработки гормональных и ферментных медицинских препаратов . В связи с этим актуальным является поиск дополнительных источников ферментного сырья.
Известно, что птица обладает большей интенсивностью роста в сравнении с другими сельскохозяйственными животными, что обеспечивается наличием в организме системы биологически активных веществ. Содерзкание некоторых из них в расчете на единицу массы значительно выше, чем у других животных. Ц. Батоев (1993) отмечает необычайно высокую активность,амилазы, липазы и протеаз в панкреатическом соке у кур, уток и гусей в сравнении с млекопитающими. Кроме того, известные нам сведения о протенназзх поджелудочной железы кур, свидетельствует о том, что последняя содер-лдат несколько изоформ трипсина и химотрипсина. С.А. Ryan, JJ. Сіагу, Y.
Tomimatsu (1965) исследовали свойства одного химотрипсина. R. Zelicson, R. Eiliara, R. Kulka (1971) методом ионообменной хроматографии исследовал количество изоферментов. В 1990 году М.Н. Pubols используя также ионообменную хроматографию, определял соотношение пищеварительных ферментов, М.Т. Проскуряков (1973) исследовал главные формы трипсина и химотрипсина. Отмечая теоретическую и практическую ценность работ перечисленных авторов, а также принимая -во внимание данные о существовании нескольких изоформ трипсина и химотрипсина можно отметить, что необходимо их комплексное исследование. Кроме этого, изучение строения и свойств гомологичных ферментов, выделенных из разных источников, дает дополнительные сведения об их строении и эволюции (Колодзейская, Пивненко, 1988), и с этой точки зрения курица представляется нам интересным объектом исследования, как представитель класса птиц.
Анализ литературы по - выделению, свойствам и применению протеолитических ферментов различных животных показал, что родственные ферменты различались по специфической активности, стабильности и другим свойствам.
Следовательно, изучение свойств протеолитических ферментов является основой их рационального практического использования в промышленности и медицине.
А.С. Ратушный (1976) отметил высокую эффективность ферментов экстракта поджелудочной железы кур как размягчителей жесткого мяса по отношению к соединительнотканным белкам мяса.
Это, а также факт дефицита ферментного сырья побудили нас к данной работе.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось исследование физико-химических свойств всего спеггра изоформ протеолитических ферментов кур и изучение возможности получения ферментного препарата из поджелудочной железы.
5 Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделение и очистка протеолитических ферментов из поджелудочной
железы кур в гомогенном состоянии (трипсина, химотрипсина, коллагеназы и
эластазы);
-
Исследование физико-химических свойств этих протеолитических ферментов (молекулярная масса, количество изоформ и изоточки, оптимумы стабильности и активности, взаимодействие с ингибиторами);
-
Сравнение протеолитических ферментов кур с соответствующими ферментами других животных крупного рогатого скота и других животных;
-
Получение ферментного препарата и изучение его свойств в плане возможности практического применения.
Научная новизна. Впервые методом гооэлектрофокусирования проведено исследование всего спектра изоферментов трипсина и химотрипсина поджелудочной железы кур. Разработаны способы получения в гомогенном состоянии трех химотрипсинов и одного трипсина с использованием ионообменной и аффинной хроматографии. Изучены основные физшсо-химические свойства ферментов. Найдены значения молекулярных масс всех изучаемых ферментов, рассчитаны оптимумы рН стабильности и активности. Проведено сравнительное изучение специфической активности выделенных ферментов и соответствующих кристаллических ферментов быка. Дан сравнительный анализ взаимодействия с синтетическими и природными ингибиторами ферментов кур и кристаллических ферментов быка. Впервые установлено, что протеиназа кур с изоточкой 9,9 ± 0,05 помимо химотрипсиновой и эластолитической активности обладает и мощной коллагенолитической активностью.
Теоретическая и практическая ценность работы. В работе показано, что по ряду свойств протеолитические ферменты поджелудочной железы кур занимают промежуточное положение между аналогичными свойствами протеиназ млекопитающих и рыб. К этим свойствам относятся: оптимумы рН
активности и стабильности, удельная активность, характер взаимодействия с ингибиторами.
Разработана лабораторная схема получения комплексного ферментного препарата из поджелудочной железы кур.
Проведено сравнение препарата с кристаллическими трипсином и химотрипсином быка. Препарат обладает высокой химазной, протеолитической, эластолитической и коллагенолитической активностью. По химазной и протеолитической активности препарат превосходил бычий кристаллический химотрипсин.
Наличие высокой эластолитической и коллагенолитической активности поджелудочной железы является предпосылкой для использования в обработке жестких сортов мяса с целью повышения качества.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
По ряду физико-химических свойств протеолитические ферменты кур занимают промежуточное положение между ферментами рыб и млекопитающих; - .,
-
Трипсин и химотрипсин поджелудочной железы кур по данным ингибиторного анализа и при прямом сравнении обладают большей молярной активностью, чем ферменты млекопитающих;
-
Поджелудочная железа кур является перспективным сырьем для получения как ферментного препарата протеолитического действия, так и отдельных протеолитических ферментов;
-
Полученный препарат по ферментному составу является комплексным и обладает высокой протеолитической, химазной, эластолитической и коллагенолитической активностью.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, июль 1996 г.), на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем
7 южных и центральных регионов России" (Краснодар, 1997), на 4 симпозиуме "Химия протеолитнческих ферментов" (Москва, 21-23 апреля 1997 г.).
Публикация материалов. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания метериала и методоз исследования, результатов, irx обсуждения , заключения, выводов, списка литературы, включающего 251 наименование, в том числе 169 иностранных. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 31 рисунок.