Производные серосодержащих гетероциклов – антиоксиданты и блокаторы неферментативного гликозилирования белков – для коррекции экспериментального сахарного диабета САВАТЕЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биохимические механизмы развития сахарного диабета и его осложнений

1.1.1. Метаболические нарушения при сахарном диабете и подходы к их фармакологической коррекции

1.1.2. Биохимические механизмы развития осложнений сахарного диабета

1.1.2.1. Неферментативное гликозилирование белков

1.1.2.2. Оксидативный стресс

1.2. Серосодержащие природные и синтетические соединения с потенциальной противодиабетической активностью

1.2.1. Природные тиолы: структура, метаболизм, биологическая роль

1.2.2. Соединения класса 1,3,4-тиадиазинов: химия и биологическая активность 1.2.3. Замещённые производные гуанидина и тиазола: химия и биологическая активность 48

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Общая характеристика исследуемых веществ

2.2. Метод исследования способности химических соединений ингибировать реакцию НГБ по накоплению ФА

2.3. Метод исследования антиоксидантной активности производных 1,3,4-тиадиазина по ингибированию окисления АК кислородом воздуха

2.4. Определение коэффициента распределения веществ в системе «н-октанол-вода» методом медленного перемешивания

2.5. Методы моделирования аллоксанового СД у крыс и его экспериментальной коррекции

2.6. Метод определения концентрации глюкозы в плазме крови

2.7. Метод определения концентрации гликозилированного гемоглобина в крови

2.8. Метод определения концентрации МДА в плазме крови

2.9. Метод определения активности каталазы в цельной крови

2.10. Метод определения содержания общего белка в плазме крови и гомогенатах органов

2.11. Метод определения содержания гемоглобина в крови

2.12. Методы статистической обработки результатов исследования 74

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Противогликозилирующая и антиоксидантная активность производных 1,3,4-тиадиазина 3.1.1. Исследование способности производных 1,3,4-ТД блокировать реакцию неферментативного гликозилирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой in vitro 3.1.2. Исследование антиоксидантных свойств производных 1,3,4-ТД на модели окисления аскорбиновой кислоты кислородом воздуха

3.1.3. Исследование соотношения липо- и гидрофильных свойств производных 1,3,4-ТД с антиоксидантной и противогликозилирующей активностью в системе «н-октанол – вода»

3.2. Исследование способности блокировать реакцию неферментативного гликозилирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой in vitro в рядах 2,4-замещенных тиазолов

3.3. Биохимические показатели крови и органов крыс при развитии аллоксанового СД на фоне введения серосодержащих гетероциклических соединений

3.4. Кинетический анализ реакции неферментативного гликозилирования генноинженерного инсулина человека и ее ингибирования глутатионом 99

Заключение 123

Выводы 129

Список используемых сокращений 131

Список литературы 133

• Метаболические нарушения при сахарном диабете и подходы к их фармакологической коррекции
• Серосодержащие природные и синтетические соединения с потенциальной противодиабетической активностью
• Определение коэффициента распределения веществ в системе «н-октанол-вода» методом медленного перемешивания
• Исследование способности блокировать реакцию неферментативного гликозилирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой in vitro в рядах 2,4-замещенных тиазолов

Введение к работе

Актуальность работы. Современная медицина испытывает потребность в новых лекарственных средствах для лечения сахарного диабета (СД) - распространенного социально значимого заболевания (Дедов ИИ. Инновационные технологии в лечении и профилактике сахарного диабета и его осложнений // Сахарный диабет. 2013. № 3. С. 4 - 10). В поиске новых противодиабетических средств широко применяется экспериментальное моделирование заболевания на животных. С целью оптимизации данного этапа поиска противодиабетических средств необходимо четко представлять, на какие механизмы развития экспериментального и клинического СД способно повлиять новое соединение.

К числу потенциальных мишеней противодиабетических средств можно отнести два патохимических процесса, реализующихся в условиях хронической гипергликемии, -неферментативное гликозилирование белков (НГБ) и оксидативный стресс (Балаболкин М.И. Диабетология // М.: Медицина, 2000. 672 с; Мопшег V.M., Sell D.R. Prevention and repair of protein damage by the Maillard reaction in vivo II Rejuvenation Res. 2006. V. 9, № 2. P. 264 - 273; Aldini G., Vistoli G., Stefek M. et al. Molecular strategies to prevent, inhibit, and degrade advanced glycoxidation and advanced lipoxidation end products II Free Radical Research. 2013. V.47, (Suppl. 1). P. 93 - 137). НГБ - спонтанная химическая реакция между аминогруппами молекулы белка и карбонильными группами моносахаридов и последующие превращения образовавшегося соединения, протекающие без участия ферментов. Происходящие изменения нарушают ионные взаимодействия в белковой молекуле, изменяют конформацию, растворимость, а вследствие этого - функциональные свойства и чувствительность к действию протеаз. Так, показано, что инсулин, неферментативно гликозилированный in vitro, частично утрачивает способность снижать уровень глюкозы в крови и стимулировать транспорт глюкозы в клетки при введении животным (Hunter S. J., Boyd А. С, O'Harte F. P.M. et al. Demonstration of glycated insulin in human diabetic plasma and decreased biological activity assessed by euglycemic-hyperinsulinemic clamp technique in humans II Diabetes. 2003. V. 52. P. 492 - 498; McKillop A.M., Mooney M.H, Harriott P. et al. Evaluation of glycated insulin in diabetic animals using immunocytochemistry and radioimmunoassay //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011. V. 286. P. 524 - 528).

Комплекс метаболических нарушений, характерных для СД, приводит к оксидативному стрессу - дисбалансу между про- и антиоксидантами, с накоплением продуктов свободнорадикального окисления (СРО) липидов, белков, нуклеиновых кислот (Evans J.L., Maddux В. A., Goldfine ID. et al. The molecular basis for oxidative stress-induced insulin resistances II Antioxid. Redox Signal. 2005. V. 7, № 7-8. P. 1040 - 1052; Меньшикова Н.Б., Зенков H.K., Ланкин В.З. и соавт. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания // Новосибирск: АРТА, 2008. 284 с; Шумаев К.Б., Губкина С.А., Кумскова Е.М. и соавт. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии L-лизина с дикарбонильными соединениями // Биохимия. 2009. Т. 74, №4. С. 568 - 574). Имеются весомые доказательства эффективности серосодержащего антиоксиданта и блокатора НГБ - липоевой кислоты (ЛК) - в терапии СД и его осложнений (Стаховская Л.В., Гусева О.И. а-липоевая кислота: фармакологические свойства и клиническое применение. Обзор литературы // М., РГМУ, 2003. 63 с; Ziegler D., Tritschler H.-J., Строков И.А., Аметов А.С. et al. Лечение диабетической полиневропатии тиоктовой кислотой (обзор литературы) // Фарматека. 2008. Т. 17, №171. С. 28 - 35; Shay К.Р., Moreau R.F., Smith E.J. et al. Alpha-lipoic acid as a dietary supplement: molecular mechanisms and therapeutic potential II Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1790. P. 1149 - 1160). Однако остается открытым вопрос, можно ли улучшить результаты лечения СД путем применения синтетических серосодержащих соединений, обладающих свойствами антиоксидантов и блокаторов НГБ.

В связи с этим привлекают внимание синтетические серосодержащие соединения ряда 1,3,4-тиадиазина (1,3,4-ТД) и 2,4-замещенных тиазолов. Имеются сведения об антиоксидантной и радиозащитной активности представителей этих классов соединений (Pfeiffer W.-D.

1,3,4-Oxadiazines and 1,3,4-Thiadiazines II Compr. Heterocycl. Chemistry III. 2008. V. 9. P. 401 -455; Расина Л.Н., Перова H.M., Новикова А.П., Чупахин О.Н. Структура, поведение в организме и биологическая активность производных тиазола // Материалы Первой Международной конференции «Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов»; под ред. В.Г. Карцева и Г.А. Толстикова. - М., 2001. - Т. 2. - С. 246). Производные 2-аминотиазола и тиазолидиндиона обладают противодиабетической активностью (De S., Adhikari S., Tilak-Jain J. et al. Antioxidant activity of an aminothiazole compound: possible mechanisms II Chem. Biol. Interact. 2008. V. 173. P. 215 - 223; Спасов A.A., Петров В.И., Чепляева Н.И., Ленская К.В. и соавт. Фундаментальные основы поиска лекарственных средств для терапии сахарного диабета 2-го типа // Вестник РАМН. 2013. № 2. С. 43 - 49). Показано, что производные 1,3,4-ТД способны в водных растворах трансформироваться в тиольные производные, которые, согласно нашей гипотезе, могут связывать глюкозу и карбонильные интермедиаты НГБ, а также обладать антиоксидантными свойствами. Однако, противодиабетическая активность производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов ранее не изучалась. Вышеизложенное определило цель и задачи данной работы.

Целью настоящей работы является оценка способности производных серосодержащих гетероциклов проявлять антиоксидантную активность, блокировать НГБ и корригировать метаболические нарушения при экспериментальном СД.

Задачи:

1. Провести скрининг способности блокировать реакцию неферментативного гликозилирования бычьего сывороточного альбумина (БСА) глюкозой in vitro в рядах производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов.

2. Исследовать антиоксидантную активность производных 1,3,4-ТД на модели ингибирования окисления аскорбиновой кислоты (АК) кислородом воздуха.

3. Оценить соотношение липо- и гидрофильных свойств производных 1,3,4-ТД с антиоксидантной и противогликозилирующей активностью в системе «н-октанол -вода».

4. Изучить влияние производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов на биохимические показатели крови и внутренних органов крыс при аллоксановом СД.

5. Выяснить взаимосвязь между структурой, липофильностью, антиоксидантными, противогликозилирующими свойствами производных 1,3,4-ТД и их способностью корригировать метаболические нарушения при экспериментальном СД.

6. Провести кинетический анализ реакции НГБ и ее ингибирования восстановленным глутатионом (G-SH) на примере генноинженерного инсулина человека.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ № 12-04-31852_мол_а и РФФИ-«Урал» № 10-04-96097) и «Программы развития УрФУ на 2010 - 2020 гг.».

Научная новизна. Впервые показано, что производные 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов способны ингибировать накопление продуктов НГБ при инкубации БСА с глюкозой. Установлено, что наилучшими противогликозилирующими свойствами обладают производные 5-фенил-1,3,4-ТД, имеющие кислородсодержащий гетерил- или алкиламиновый заместитель в положении 2.

Произведена оценка липофильности потенциальных ингибиторов реакции НГБ -производных 1,3,4-ТД в системе «н-октанол - вода». Установлено, что коэффициент распределения \gK_ow для активных ингибиторов НГБ составлял 2,90 - 3,19, а для менее активных ингибиторов 3,14 - 4,02.

Впервые показана способность производных 1,3,4-ТД ингибировать окисление аскорбиновой кислоты кислородом воздуха. Наибольшую активность проявляют соединения Н-32, ТД-79, L-92, L-17, L-34.

Впервые на модели аллоксанового СД у крыс обнаружена противодиабетическая активность производных 1,3,4-ТД (L-17, L-14, Н-32, L-31, L-91) и 2-гуанидин-4-пиридинтиазола (2-Г-4-ПТ). Исследованные производные 1,3,4-ТД обладают способностью корригировать гипергликемию, накопление продуктов НГБ в крови и внутренних органах, а также обладают антиоксидантной активностью. 2-Г-4ПТ снижает накопление продуктов НГБ и СРО липидов в крови и внутренних органах, не влияя на уровень гликемии.

Предложена и экспериментально подтверждена кинетическая модель процесса неферментативного гликозилирования генноинженерного человеческого инсулина in vitro. Найдены константы скоростей прямой и обратной элементарных реакций в стадии 2, отношение констант скоростей прямой и обратной элементарных реакций в стадии 1, а также термодинамические константы равновесия обеих стадий.

Установлено, что в диапазоне физиологических концентраций природный тиол G-SH обладает дозозависимой способностью ингибировать гликозилирование инсулина глюкозой in vitro, проведен кинетический анализ процесса.

На защиту выносятся следующие положения:

Производные 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов способны блокировать реакцию НГБ. Наилучшими противогликозилирующими свойствами обладают производные 5-фенил-1,3,4-ТД, с кислородсодержащим гетерил- или алкиламиновым заместителем в положении 2, и имеющие коэффициент распределения \gK_owB системе «н-октанол - вода» в пределах 2,90 - 3,19.

Производные 1,3,4-ТД способны ингибировать окисление аскорбиновой кислоты кислородом воздуха. Наибольшую активность проявляют производные 1,3,4-ТД, имеющие морфолиновый заместитель в положении 2 и тиофен, фенил или и-фторфенил в положении 5.

Антиоксидантные и противогликозилирующие свойства производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов позволяют частично корригировать метаболические нарушения при развитии аллоксанового СД у крыс.

В результате кинетического исследования реакции неферментативного гликозилирования генноинженерного инсулина человека (ГИЧ) и её ингибирования G-SH, предложена математическая модель этой реакции, проверено её соответствие результатам эксперимента in vitro, рассчитаны константы скоростей и константы равновесия стадий образования ФА в отсутствии и в присутствии G-SH.

Практическая значимость. В ходе скрининга были найдены вещества, способные снижать накопление первичного продукта реакции НГБ фруктозамина (ФА), ингибировать окисление АК кислородом воздуха. Выявлены некоторые аспекты зависимости «структура-активность», что позволит вести целенаправленный поиск и синтез веществ с противогликозилирующей и антиоксидантной активностью. Применение веществ, сочетающих свойства антиоксиданта и блокатора НГБ, представляется перспективным подходом к фармакологической коррекции СД в эксперименте.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 3 - в журналах, входящих в перечень ВАК. Подана 1 заявка на изобретение, № 2014151103 (приоритет от 16.12.2014 г.). Результаты работы доложены (с опубликованием тезисов) на международных и Российских конференциях: Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009); Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); XX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2010); I Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в

физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); II Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодёжной научной школой по органической химии (Уфа, 2013); I научно-практической конференции аспирантов и студентов России «Химия в федеральных университетах» (Екатеринбург, 2013); Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (Казань, 2013); Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014); II Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, 2014); Российском научном форуме на Урале «Актуальные вопросы фундаментальной медицины» (Екатеринбург, 2014).

Личный вклад автора. Автор принимал участие в планировании диссертационного исследования, проводил литературный поиск, непосредственно осуществлял эксперименты in vitro, проводил биохимические исследования крови и органов экспериментальных животных, проводил расчёты и экспериментальную проверку кинетической модели реакции гликозилирования. Материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа содержит 25 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 225 источников, в том числе 141 работу на иностранных языках.

Метаболические нарушения при сахарном диабете и подходы к их фармакологической коррекции

Большая часть КПГ содержит флюорофоры и хромофоры и обладает специфическими спектральными характеристиками, имеет желтовато-коричневую окраску, в связи с чем они получили название «меланоидинов», а каскад реакций НГБ называют также «реакциями побурения», «реакциями образования коричневой окраски» (browning-reactions) или «реакциями меланоидинообразования».

Дегидратация продукта Амадори приводит к образованию связанного с белком 5-гидроксиметилфурфурола (для гексоз) или фурфурола (для пентоз). Модификация свободных остатков лизина ППГ приводит к пирралину, N--карбоксиметиллизину и N--карбоксиэтиллизину. Присоединение двух молекул 3-дезоксиглюкозона к аминогруппе белка с последующей дегидратацией приводит к 1-алкил-2-формил-3,4-дигликозилпирролу. При взаимодействии ППГ с аргинином образуются аргпиримидин, имидазолоны А и В. ППГ могут играть роль «сшивок» как между разными молекулами белка, так и между фрагментами одной молекулы. Так, два продукта Амадори могут «сшиваться» друг с другом при участии глюкозы, образуя структуру 2-(2-фуроил)-4(5)-(2-фуранил)-1Н-имидазола. Остатки лизина могут «сшиваться» друг с другом посредством карбонильных ППГ с образованием соответствующих димеров и весперлизина, при связывании остатков лизина и аргинина образуются пентозидин, глюкозепан и другие производные имидазола. Закономерно, что наибольшее количество подобных КПГ накапливается в белках, имеющих близко расположенные радикалы лизина и аргинина (Singh R., Barden A., Mori T., Beilin L., 2001; De Groot J., 2004; Monnier V.M., Sun W., Sell D.R. et al., 2014).

В литературе опубликованы данные о непосредственном участии в формировании КПГ -дикарбонильных соединений (глиоксаля, метилглиоксаля, 3-дезоксиглюкозона), образующихся in vivo как при деградации глюкозы, так и в результате превращений основания Шиффа при модификации лизина в составе белков с глюкозой. Реакции -дикарбонильных соединений с -аминогруппами остатков лизина или гуанидиновыми группировками остатков аргинина в белках приводит к образованию белковых сшивок, которые ответственны за осложнения, вызванные НГБ, при диабете и других заболеваниях. Кроме того, в результате последовательной дегидратации продукта Амадори при С4 и С5 образуются 1-амино-4-дезокси-2,2-дион и ендион, которые также могут участвовать в образовании внутримолекулярных и межмолекулярных белковых сшивок (Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Годовикова Т.С., 2009). Реакции неферментативного гликозилирования могут подвергаться аминогруппы не только белков, но и других биологически активных соединений, например, мембранных фосфолипидов и азотистых оснований нуклеиновых кислот (Thornalley P.J., 1990; Ahmed N., Thornalley P.J., 2009) При этом происходят существенные структурные и функциональные изменения клеточных мембран и молекул ДНК. Присоединение остатков моносахаридов нарушает ионные взаимодействия в белковой молекуле, изменяет конформацию, растворимость, а вследствие этого – функциональные свойства и чувствительность к действию протеаз (Емельянов В.В., Максимова Н.Е., Мочульская Н.Н., Черешнев В.А., 2010). Первым из неферментативно гликозилированных белков был обнаружен и подробно исследован в конце 50-х – начале 60-х гг. 20 в гликозилированный гемоглобин взрослых – HbA1c (Вельков В.В., 2010). Сегодня известны десятки белков, которые in vivo подвергаются неферментативному гликозилированию при непосредственном контакте с моносахаридами. Это различные гемоглобины A, F, S, С, D, альбумин и глобулины плазмы крови, иммуноглобулины, фибрин, белки мембран эритроцитов, интимы сосудов и стенок капилляров, коллагены, кератины, кристаллин, тубулин, миелин, некоторые ферменты (катепсин В, рибонуклеаза А, b-N-ацетил-О-глюкозаминидаза и др.), липопротеины низкой плотности, антитромбин III, инсулин и др. НГБ как правило приводит к резкому изменению их свойств (Dolhofer R., Wieland O.H., 1979; Takata I., Kawamura N., Myint T. et al., 1996; Kil I.S., Lee J.H., Shin A.H., Park J.W., 2004; Montes-Cortes D.H., Hicks J.J., Ceballos-Reyes G.M. et al., 2010; Rondeau P., Bourdon E., 2011; Vetter S.W., Indurthi V.S.K., 2011). Примеры некоторых изменений приведены в таблице 3. Таблица 3

Последствия гликозилирования для функций белков Гликозилированный белок Последствия

Структурные белки: Коллаген, ламинин, фибронектинБелки мембран эритроцитовБелки хрусталика глазаБелки базальной мембраны почечных клубочковБелки миелинаТубулинЯдерные гистоныТранспортные белки:ГемоглобинАльбумин Апопротеины В-100 и А-IРегуляторные белки:Гормоны (инсулин, пролактин, вазопрессин)Фибриноген, антитромбин IIIФерменты:Аспартатаминотрансфераза, СОД, параоксоназа, NO-синтаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, каталаза, глутатионпероксидаза, изоцитрат-дегидрогеназа;альдозоредуктазаИммуноглобулины Склерозирование тканейОсмотический гемолиз, нарушение микроциркуляцииРазвитие катарактыПотеря селективности почечного фильтраЗамедление проведения нервного импульсаНарушение транспорта веществ по аксонамНарушение транскрипцииПовышение сродства к кислороду, развитие гипоксии тканейНарушение осмотической регуляции и транспорта метаболитов, снижение антиоксидантных свойствАтерогенная модификацияОслабление гормонального действияГиперкоагуляция ИнактивацияАктивацияОслабление взаимодействия с антигеном

Так, гликозилированный гемоглобин HbА1с обладает более высоким сродством к кислороду (Галенок В.А., Боднар П.Н.,. Диккер В.Е, Ромашкан С.В., 1989). Содержание гликозилированного гемоглобина в крови больных СД достигает 8,5% и выше (референтный интервал 4,5 – 6,0%). В старых эритроцитах содержится больше HbA1c, чем в молодых. Обнаружена прямая зависимость между содержанием в крови HbA1c и выраженностью диабетических микроангиопатий и нейропатии (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М., 2005; Аметов А.С., 2011; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2011). Альбумин сыворотки крови в результате неферментативного гликозилирования теряет свои транспортные, антиоксидантные и детоксикационные свойства, перестает связывать билирубин и длинноцепочечные жирные кислоты (Bourdon E., Loreau N., Blache D., 1999; Муравская Е.В., Лапко А.Г., Муравский В.А., 2003; Barnaby O.S., Cerny R.L., Clarke W., Hage D.S., 2011; Seedher N., Kanojia M. 2013).

Серосодержащие природные и синтетические соединения с потенциальной противодиабетической активностью

НГБ является неферментативной реакцией, поэтому возможно её моделирование in vitro. Однако отсутствуют общепринятые подходы к оценке скорости протекания реакции в модельной системе. В частности, в качестве компонентов системы используются различные белки и углеводы, отличаются время и условия протекания реакции, а также детектируемые продукты НГБ (O Harte F.P.M., Hojrup P., Barnett C.R., Flatt P.R., 1996; D. Bonnefont-Rousselot, 2001; Matsuura N., Aradate T., Sasaki C. et al., 2002; Farah M.A., Shambhunath B., Lee J.-H. et al., 2005; Linetsky M.D., Shipova E.V., Legrand R.D., Argirov O.O., 2005; Linetsky M.D., Shipova E.V., Argirov O.O., 2006; Rondeau P., Bourdon E., 2011; Кузнецова В.А., Соловьева О.А., Мацевич А.И., Спасов А.А., 2014). Нами в качестве модельного белка был выбран БСА как доступный белок с известной аминокислотной последовательностью и пространственной структурой; в качестве углевода – глюкоза как наиболее распространённый моносахарид in vivo. Оценка скорости реакции НГБ в присутствии и в отсутствии потенциальных ингибиторов проводилась по накоплению начального продукта процесса – ФА. Поскольку в предварительных экспериментах была установлена способность исследуемых серосодержащих гетероциклических соединений поглощать в ультрафиолетовой области спектра, то оценка скорости реакции по накоплению флюоресцирующих КПГ в нашем исследовании была невозможна.

В модельную систему, состоящую из БСА в концентрации 5 г/л и глюкозы в концентрации 20 ммоль/л, добавляли исследуемые вещества, консервант м-крезол и инкубировали при температуре 4С в течение 8 недель. На сроках 1, 2, 4, 8 недель отбирали пробы, а которых определяли концентрацию ФА.

Принцип метода: гликозилированный белок содержит 1-дезокси-1-(N-аминоацил)фруктозу (ФА), которая дегидратируется ортофосфорной кислотой и взаимодействует с тиобарбитуровой кислотой с образованием цветного комплекса, имеющего абсорбционный максимум при 443 нм (Викторова Л.Н., Городецкий В.К., 1990).

Спектрофотометрировали пробы (Е1), контрольные растворы (Е2 и Е3) и стандарт (Ест) против воды в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 443 нм на спектрофлуориметре «Флюорат-02 Панорама». Содержание начального продукта НГБ рассчитывали так: по зависимости Е стандартов от концентрации калибровочных растворов определяли угловой коэффициент прямой sm (литр/мкмоль). Содержание гликозилированного белка рассчитывали по следующей формуле: С = (Е1 – (Е2 + Е3))/С белкаsm, где С – концентрация гликозилированного белка [мкмоль фруктозы/ г белка].

По аналогичной методике определяли концентрацию ФА в плазме крови и гомогенатах органов экспериментальных животных.

Метод исследования антиоксидантной активности производных 1,3,4-ТД по ингибированию окисления АК кислородом воздуха

Для исследования антиоксидантной активности природных и синтетических соединений предложены различные подходы, основанные на детектировании кинетики их окисления в модельных системах (Бурлакова Е.Б., 2007; Дорожко Е.В., Короткова Е.И., 2010). АК в водных растворах подвергается окислению кислородом воздуха до ДАК. Тиолы, восстанавливая ДАК, по аналогии с антиоксидантной системой клетки, снижают убыль АК в растворе (Девис М., Остин Дж., Патридж Д., 1999). Способность соединений класса 1,3,4-ТД ингибировать окисление АК кислородом воздуха исследовали в водном растворе, включавшем исследуемое вещество и АК в двух молярных соотношениях 1:1 и 2:1. Контролем служили растворы АК и исследуемого 1,3,4-ТД. Принцип метода: количественное определение АК основано на её способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, который в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой – красную, а при восстановлении обесцвечивается (рис. 21) (Девис М., Остин Дж., Патридж Д., 1999).

Растворы были приготовлены так, чтобы концентрация АК была везде одинакова и составляла 44 мг/мл. Модельные системы инкубировали 6 часов при постоянном перемешивании и температуре 37оС. Отбор проб для определения концентрации АК производился каждый час. В предварительном эксперименте было показано, что 1,3,4-ТД не вступают в реакцию с 2,6-дихлорфенолиндофенолом, поэтому данный метод может быть использован для определения концентрации АК в присутствии 1,3,4-ТД.

Ход определения: Отбирали 1 мл исследуемого раствора, количественно переносили в коническую колбу для титрования и приливали 2 мл дистиллированной воды. Полученную смесь оставляли на 10 мин. К полученному раствору добавляли 2-3 капли 10% раствора соляной кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Содержимое колб титровали 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с.

Расчет: количество мл 2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченное на титрование исследуемого раствора, эквивалентно содержанию АК в титруемой жидкости: если на титрование пошло А мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, то в исследуемом растворе содержится такое же количество миллилитров АК той же нормальности. Эквивалент АК равен 176/2=88. В 1 мл 0,001 н раствора содержится 0,088 мг. Содержание АК в мг/мл раствора вычисляется по формуле:

Определение коэффициента распределения веществ в системе «н-октанол-вода» методом медленного перемешивания

В условиях гипергликемии при СД развиваются метаболические нарушения, среди которых тесно связанные между собой НГБ и ОС (Wen Y., Skidmore J.C., Porterurner M.M. et al., 2002; Смирнова О.М., Никонова Т.В., 2003; М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская, 2005; Балаболкин М.И., Креминская В.М., Клебанова Е.М., 2005; Ланкин В.З., Лисина М.О., Арзамасцева Н.Е. и соавт., 2005; Аметов А.С., Соловьева О.Л., 2011). Под действием свободных радикалов повреждаются мембраны клеток и клеточных органелл, усугубляя течение болезни. Хорошо известно, что при СД наблюдается дефицит в организме эндогенных антиоксидантов (Abdel-Wahab Y.H.A., O Harte F.P.M., Mooney M.H. et al., 2002; Wilson J. X., 2002; Антонова К.В., Недосугова Л.В., Балаболкин М.И. и соавт., 2003; Смирнова О.М., Никонова Т.В., 2003; Волчегорский И.А., Рассохина Л.М., Мирошниченко И.Ю., 2013). Поэтому в качестве противодиабетических средств перспективны соединения, обладающие комбинированным противогликозилирующим и антиоксидантным действием. Одним из важнейших природных антиоксидантов является аскорбиновая кислота (АК). В организме АК проявляет антиоксидантные свойства синергично с другими природными антиоксидантами. Известно, что аскорбат восстанавливает витамин Е, сам при этом окисляется до ДАК, а тиоловые соединения восстанавливают ДАК. В водных растворах in vitro происходит окисление АК кислородом воздуха (Девис М., Остин Дж., Патридж Д., 1999). Вещества, способные восстанавливать ДАК препятствуют убыли концентрации АК в такой системе. В проведённом эксперименте было выяснено, как влияют производные 1,3,4-ТД на скорость окисления АК кислородом воздуха. Для этого растворы смесей 1,3,4-ТД и АК в соотношениях 1:1 и 1:2 соответственно инкубировались при температуре 37 С и интенсивном перемешивании. Каждый час отбирались пробы и устанавливалась концентрация АК в растворах. На основании полученных данных были построены графики снижения концентрации АК в присутствии каждого исследуемого вещества (на примере соединения L-17 - рис. 25). Рис. 25. Оценка влияния соединения L-17 на кинетику окисления АК кислородом воздуха

Скорости снижения концентраций вычислялись по формуле , где – изменение концентрации АК, - время инкубации (6 часов). Данные на примере вещества L-17, приведенные на рисунке, показывают, что концентрация АК в растворе с течением времени уменьшается. Из графика видно, что окисление АК кислородом воздуха в чистом растворе идет быстрее, чем в растворах, где присутствует вещество L-17. Кинетика убыли АК в растворе носит практически линейный характер. Скорость убыли АК без ингибитора составила 15,0 мкг/лчас, в присутствии эквимолярного количества L-17 она снижалась до 11,5мкг/лчас, а при 2-кратном избытке L-17 – до 8,5 мкг/лчас.

На рисунке 26 приведены графики снижения концентрации АК в присутствии ЛК. Несмотря на то, что в клинической практике ЛК показывает эффективное антиоксидантное действие, в эксперименте с АК она уступает синтетическим соединениям класса 1,3,4-ТД. Как показано на графиках, в растворах с ЛК окисление АК превосходит контрольные показатели в первые два часа. Далее ЛК незначительно замедляет окисление АК, но не обнаруживает дозозависимого действия.

Аналогично по полученным экспериментальным данным были вычислены скорости снижения концентраций АК в исследованных растворах в присутствии других производных 1,3,4-ТД, а также ЛК, восстановленного и окисленного глутатиона как веществ сравнения (табл. 14).

По приведённым в таблице данным можно сделать выводы о том, что наибольшей антиоксидантной активностью обладает вещество ТД-79, несколько слабее препятствуют окислению АК глутатион восстановленный, соединения Н-32, L-92, и L-17. Вещества L-34 и L-31, а также ЛК и окисленный глутатион в двух исследованных концентрациях оказали неоднозначное влияние на кинетику окисления АК, а вещества LT-1 и L-14 и вовсе ускоряли его.

Анализ взаимосвязи «структура-активность» в ряду производных 1,3,4-ТД, изменяющих кинетику окисления АК кислородом воздуха, показывает зависимость данной активности от заместителей в положении 2 и 5 тиадиазинового цикла. Так, среди производных 1,3,4-ТД, содержащих фенильный фрагмент в положении 5, наибольшей антиоксидантной активностью обладают соединения L-17 и L-31, содержащие в положении 2 морфолиновую группу. С другой стороны, среди морфолинозамещённых производных 1,3,4-ТД наивысшими антиоксидантными свойствами обладают производные, содержащие тиофен в положении 5. Наивысшей антиоксидантной активностью среди исследованных соединений обладал 2-морфолино-5-тиенил-1,3,4-ТД.

Возможный механизм ингибирования окисления АК кислородом воздуха в присутствии производных 1,3,4-ТД мы связываем с действием продуктов их трансформации, содержащих тиольную группу. Эти соединения восстанавливают ДАК до АК, сами при этом окисляясь до дисульфидов (рис. 27).

Таким образом, в проведенном исследовании показана способность производных 1,3,4-ТД ингибировать окисление АК кислородом воздуха в водной фазе, что открывает перспективы исследования антиоксидантной активности этих соединений in vivo.

Взаимодействие между биологически активными веществами и клеточными и субклеточными структурами происходит в водной среде или в неводных слоях мембран, которые образованы гидрофобными фрагментами липидов. Показано, что возрастание липофильности соотносится со снижением водорастворимости, повышением скорости проникновения через кожу, увеличением степени связывания с белками плазмы, материальной кумуляцией, что в значительной мере определяет биологическую активность соединений (Lu Y., Kim S., Park K., 2011). В качестве стандартного растворителя для измерения коэффициента распределения органических веществ принято использовать н-октанол. Наличие гидрофобной длинной алкильной цепи и гидрофильной гидроксильной группы придает н-октанолу сходство с амфифильными липидами биологических мембран. Коэффициент распределения веществ в системе н-октанол/вода (Kow) представляет собой соотношение равновесных концентраций вещества, растворенного в двухфазной системе, состоящей из двух практически несмешивающихся растворителей. Так как это соотношение концентраций, то данный показатель является безразмерным. Наиболее часто он приводится в виде десятичного логарифма (lgKow) (Rutkowska E., Pajak K., Jwiak K., 2013).

Для определения величины lgKow существует несколько методов. Наиболее доступными в практике являются методы встряхивания и медленного перемешивания (ГОСТ 32291-2013). Методом медленного перемешивания были исследованы 10 производных 1,3,4-ТД, отличавшихся по противогликозилирующей активности. Полученные коэффициенты распределения представлены в табл. 15.

Исследование способности блокировать реакцию неферментативного гликозилирования бычьего сывороточного альбумина глюкозой in vitro в рядах 2,4-замещенных тиазолов

В настоящее время СД является широко распространенным заболеванием. Течение болезни длительно и сопровождается осложнениями, со временем приводящими больного к инвалидизации. Поэтому медикаментозная профилактика и коррекция осложнений СД является одной из наиболее важных, социально значимых задач.

Наиболее важным механизмом патогенеза осложнений при СД является НГБ. Этот процесс приводит к изменению строения и, как следствие, биологической функции белков. Однако, несмотря на многочисленные данные о роли неферментативного гликозилирования в развитии заболевания, подходы к его лечению на основе ингибирования данного биохимического процесса не сформированы. Кроме того, на фоне гипергликемии развивается ОС – дисбаланс между про- и антиоксидантами. Имеются данные об эффективности серосодержащих антиоксидантов, в частности, ЛК, в терапии СД. В связи с этим был предпринят поиск веществ с противогликозилирующей активностью среди синтетических серосодержащих веществ, способных трансформироваться в тиолы.

Целью работы являлся поиск веществ с антиоксидантной и противогликозилирующей активностью для коррекции экспериментального СД среди производных серосодержащих гетероциклических соединений. Для достижения заявленной цели был проведён двухэтапный эксперимент: отбор веществ in vitro и дальнейшее исследование веществ-лидеров in vivo, а также проведён кинетический анализ первого этапа процесса гликозилирования и его ингибирования восстановленным глутатионом.

В модельной системе in vitro, включавшей БСА и глюкозу, был проведён скрининг способности блокировать реакцию НГБ в рядах производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов. Впервые показано, что производные 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов способны ингибировать накопление продуктов НГБ при инкубации бычьего сывороточного альбумина с глюкозой. Установлено, что наилучшими противогликозилирующими свойствами обладают производные 5-фенил-1,3,4-ТД, имеющие кислородсодержащий гетерил- или алкиламиновый заместитель в положении 2.

Оксидативный стресс является важным патобиохимическим звеном развития осложнений СД, поэтому одним из критериев отбора потенциальных противогливогликозилирующих веществ является их антиоксидантная активность. В ходе эксперимента была показана способность производных 1,3,4-ТД ингибировать окисление аскорбиновой кислоты кислородом воздуха, наивысшей активностью обладал 2-морфолино-5-тиенил-1,3,4-ТД.

Важным фактором с точки зрения биодоступности является их растворимость. Методом медленного перемешивания в системе «н-октанол – вода» было оценено соотношение липо- и гидрофильных свойств производных 1,3,4-ТД и 2,4-замещенных тиазолов с антиоксидантной и противогликозилирующей активностью. Показано, что наиболее высокую противогликозилирующую активность показали соединения, коэффициент распределения в системе «н-октанол – вода» которых находится в пределах 2,90-3,14. Вещества-лидеры, показавшие лучшие результаты по противогликозилирующей и антиоксидантной активности, были исследованы в эксперименте на животных. Эксперимент проводился на белых крысах с экспериментальным аллоксановым СД. Крысам внутрибрюшинно трёхкратно инъецировали аллоксан, моделируя СД. В течение месяца 3 раза в неделю животным внутримышечно вводили исследуемые вещества в дозах 40 мг/кг. Биохимическое исследование крови и внутренних органов животных включало определение концентрации глюкозы и гликозилированного гемоглобина крови, фруктозамина в плазме, почке и печени, малонового диальдегида плазмы и активность каталазы в цельной крови. В проведенном исследовании впервые обнаружена способность производных 1,3,4-ТД (соединения L-17, L-14, H-32, L-31, L-91) и 2-гуанидин-4-пиридинтиазола (2-Г-4-ПТ) корригировать метаболические нарушения при экспериментальном СД. Введение аллоксана приводило к стойкой и выраженной гипергликемии, накоплению гликозилированных белков в крови и органах животных. Гипергликемия и активация НГБ могли служить триггером оксидативного стресса, накопления МДА и снижения активности каталазы крови. Введение ЛК существенно ослабляло, хотя и не отменяло полностью, биохимические нарушения при формирующемся аллоксановом СД. Гипергликемия и связанные с ней концентрации гликозилированных белков крови при введении ЛК были на 35-55% ниже, чем в контрольной группе. Содержание ФА в гомогенатах почек и печени при введении ЛК было в 2,8 и 5,6 раз, соответственно, ниже, чем в контроле. Антиоксидантный эффект ЛК в нашем исследовании проявился в увеличении активности каталазы, однако, содержание МДА в крови не претерпело статистически значимых изменений. Исследованные синтетические серосодержащие гетероциклические соединения также обладали способностью частично корректировать метаболические нарушения при развитии аллоксанового СД. Однако в действии производных 1,3,4-ТД и 2-Г-4-ПТ имелись принципиальные различия. Производные 1,3,4-ТД вызывали снижение гипергликемии и концентрации HbA1c в крови, а также ФА в почках и печени животных, подобно ЛК. Ключевым моментом корригирующего действия производных 1,3,4-ТД был антигипергликемический эффект. Выраженность корректирующего эффекта производных 1,3,4-ТД в эксперименте in vivo убывала в ряду L-31 > L-91 > L-17 > H-32 > L-14. Также, соединения H-32 и L-17, активно ингибировавшие окисление АК кислородом воздуха, проявили большую корригирующую активность in vivo, чем соединение L-14, ускорявшее окисление АК в опыте in vitro. Введение 2-Г-4-ПТ не уменьшало выраженности гипергликемии и накопления HbA1c, но статистически значимо снижало уровень МДА и ФА почек и печени. Таким образом, не обладая антигипергликемическим эффектом, 2-Г-4-ПТ проявлял свойства антиоксиданта и блокатора НГБ. Механизмы коррекции метаболических нарушений при аллоксановом СД производными 1,3,4-тиадиазина и 2-гуанидинтиазола могут быть проиллюстрированы нижеследующей схемой (рис. 39).