Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммуноглобулины (lg) - специфические белки иммунной системы человека, играют важнейшую роль в его защите от патогенного влияния окружающей среды Антитела (AT) узнают и связывают антигены (чужеродные организму вещества и микроорганизмы, такие как вирусы, бактерии, белки, ДНК, и др.) с высоким сродством за счет образования большого числа специфических нековалентных связей - электростатических, ван-дер-Ваальсовых и водородных. Еще в 1948 г. Л Полинг, отметив общие черты в механизмах узнавания антигенов антителами и переходных состояний химических реакций ферментами, предположил принципиальную возможность существования lg с функциями ферментов В 1969 г. Б. Дженкс, принимая во внимание максимальную комплементарность активных центров ферментов не самим субстратам, а переходным состояниям химических реакций, высказал гипотезу о том, что AT против химически стабильных аналогов переходных состояний могут иметь структуру антигенсвязывающего участка, подобную структуре активного центра фермента, и в таком случае должны катализировать реакцию превращения субстрата подобно ферменту.
С помощью гибридомной технологии в 1986 г. были получены первые моноклональные AT с эстеразной активностью (Tramontano А. et a/., Science, 1986, 234, 1566; Pollack S.J. et a/., Sc/елсе, 1986, 234, 1570) и такие антитела-ферменты были названы "абзимами" (ABZYME производное от AntiBody и enZYME). На сегодняшний день уже получены моноклональные абзимы, катализирующие более 100 различных химических реакций (для обзора см. в списке публикаций
В настоящее время известно более 80 различных аутоиммунных заболеваний, некоторые из них относятся к главным медицинским и социальным проблемам современного общества - ими болеют люди активного возраста и молодежь Известно, что аутоиммунные заболевания характеризуются наличием в организме высокого титра аутоантител - AT к эндогенным антигенам Некоторые вирусные заболевания, такие как иммунодефицит человека, вирусные гепатиты и клещевой энцефалит, не относят к аутоиммунным заболеваниям, но у людей с этими патологиями происходит существенное нарушение иммунного статуса. СПИД - заболевание, вызывающее тяжелый иммунодефицит, обусловленный прогрессирующим снижением Т-хелперов и их функциональной недостаточностью. Выраженный иммунный ответ на вирус служит важнейшим фактором, определяющим медленное прогрессирование ВИЧ-инфекции до стадии СПИД Патогенез гепатита и клещевого энцефалита сопровождается
1 ІІрос национальная]
I БИБЛИОТЕКА ]
аутоиммунными гуморальными и клеточными реакциями- в крови больных обнаруживаются ткане-неспецифические и органо-неспецифические аутоантигены
Интересно, что повышение концентрации ДНК и анти-ДНК антител в крови тестируют при большом числе различных аутоиммунных патологий, таких как системная красная волчанка (СКВ), болезнь Грейвса, полимиозит, рассеянный склероз (PC), синдром Сьегрена, а также при лимфопролиферативных и некоторых вирусных заболеваниях. В случае СКВ обнаружены особенно высокие концентрации ДНК и анти-ДНК антител (Shoenfeld, У. et ai, Clin. Immunol. Immunopathol., 1989, 51, 313; Gabibov, A G. et ai, Appl Biochem. Biotechnol., 1994, 47, 293; Kozyr, A.V. et ai, Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 45).
Природные абзимы впервые были обнаружены в крови больных астмой, они высокоселективно гидролизовали вазоактивный нейропептид (Paul et ai, Science, 1989, 244, 1158) Вторым примером природных абзимов были ДНК-гидролизующие IgG, обнаруженные группой А Габибова в крови больных СКВ (Shuster, А М et al, 1992, Science, 256, 665).
Открытие каталитической активности lg из крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями, а также крови и молока здоровых по медицинским показаниям женщин существенно изменило традиционные представления о роли и функции AT и поставило ряд новых вопросов о механизмах функционирования иммунной системы человека. Какие функции выполняют абзимы в организме человека в норме и при патологиях? Есть ли четкие корреляции между тяжестью заболевания и уровнями абзимов и их активности? Каким образом каталитическая активность AT влияет на состав крови, изменяет функционирование клеток, изменяет биологическую функцию других гуморальных факторов? Совпадает ли роль нормальных ферментов клетки с ролью AT, имеющих аналогичную активность, или они имеют абсолютно разные функции в организме? Почему возможно появление абзимов в молоке и крови женщин в период лактации, но не в крови «обычных» людей? В чем сходство или различие свойств абзимов и путей их наработки при аутоиммунных патологиях и у рожениц?
В настоящее время в крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями, а также в крови и молоке женщин во время беременности и лактации обнаружены абзимы, которые гидролизуют пептиды, белки, ДНК, РНК, нуклеотиды и полисахариды. Кроме того, эти AT обладают активностями супероксиддисмутаз, протеин, липид и полисахарид киназ. Успехи, достигнутые в абзимологии, отражены в ряде обзоров [18-19, 24-28, 32, 34]. А высокоактивные абзимы с антиокислительными функциями присутствуют в крови всех исследованных здоровых доноров и
животных В связи с этим встает вопрос о том, не являются ли абзимы дополнительным источником ферментов альтернативного типа, выполняющих специфические функции в защите млекопитающих от воздействия вредных факторов окружающей среды, регулирующих развитие и/или элиминацию определенных клеток организма и т д
Фундаментальные исследования, направленные на решение этой проблемы, являются очень важными и актуальными для развития представлений как о принципах функционирования AT в живых организмах, так и об альтернативных механизмах создания ферментов в живых клетках. Развитие этих работ со временем может привести к открытию новых путей регуляции жизнедеятельности клеток при различных заболеваниях и созданию лекарственных препаратов на основе каталитически активных антител.
Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе и сравнении каталитических свойств и биологических функций антител с РНК- и ДНК-гидролизующими активностями в норме (молоко и кровь здоровых доноров) и при различных аутоиммунных патологиях (аутоиммунные и вирусные заболевания человека, протекающие с развитием аутоиммунных реакций)- рассеянный склероз, системная красная волчанка, аутоиммунный тиреоидит (АИТ), полиартрит (ПА), вирусные гепатиты (ВГ), синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) и клещевой энцефалит (КЭ).
В ходе исследования решались следующие основные задачи.
Доказательство наличия каталитической активности у иммуноглобулинов крови и молока человека.
Изучение ферментативных свойств и субстратной специфичности природных абзимов молока и крови здоровых доноров и пациентов с аутоиммунными патологиями (АИП) в сравнении с обычными нуклеазами человека.
Исследование ДНК- и РНК-гидролизующих активностей абзимов молока и крови, а также динамики изменения нуклеазной активности антител крови женщин во время беременности и лактации.
Оценка уровня нуклеазной активности абзимов в сравнении с биохимическими, иммунологическими и клиническими специфическими маркерами крови больных с АИП для изучения молекулярных и иммунологических особенностей протекания этих заболеваний, а также для поиска новых подходов к их лечению и оценке эффективности различных лекарственных средств.
Исследование механизмов образования абзимов у человека в норме и при нарушении иммунного статуса, а также возможной
биологической роли природных абзимов-нуклеаз и их участия в патогенезе АИП.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено систематическое исследование ферментативных свойств и субстратной специфичности антител с нуклеазными активностями в норме (кровь и молоко здоровых женщин во время беременности и лактации) и при АИП человека (PC, АИТ, СКВ, ПА, ВГ, СПИД и КЭ) Представленные данные являются оригинальными и вносят существенный вклад в решение проблемы структурно-функциональной протеомики иммунной системы человека в норме и при АИП.
Полученные результаты позволяют сформулировать новое представление о свойствах иммуноглобулинов, а также открывают новые возможности в исследовании исключительного многообразия и необычной субстратной специфичности поликлональных абзимов крови человека с нуклеазными активностями, которые являются ферментами с уникальными свойствами. Результаты работы и используемые подходы могут служить базой для создания новых дифференциальных комплексных методов диагностики, профилактики и терапии большого числа заболеваний, ведущих к нарушению иммунного статуса человека, а также для дизайна биокатализаторов с заданными ферментативными свойствами.
Публикации и апробация работы. Автором данной работы опубликовано 55 статей по исследованию абзимов, гидролизующих ДНК, РНК, нуклеотиды и полисахариды, а также фосфорилирующих белки, липиды и полисахариды В диссертацию вошли результаты по исследованию AT, гидролизующих ДНК и РНК, изложенные в 37 статьях и 44 тезисах докладов Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях' «Catalytic Antibodies and Antibody Engineering» (Франция, 1996), «Седьмая научно-практическая конференция врачей» (Новосибирск, 1997), «International Society of Neuroimmunology Fifth International Congress» (Канада, 1998), «Tenth International Congress of Immunology», (Индия, 1998), «Восьмая научно-практическая конференция врачей» (Новосибирск, 1998), «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998), «18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology» (Великобритания, 2000), Объединенная научная сессия СО РАН И СО РАМН "Новые медицинские технологии" (Новосибирск, 2000), "RNA as Therapeutic and Genomics Target" (Новосибирск, 2001), «Опыт введения новейших достижений супрамолекулярной химии в учебные программы средних и высших учебных заведений» (Новосибирск, 2001), III Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), II Объединенная
научная сессия СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине» (Новосибирск, 2002), «Интегративная Медицина - путь к здоровью человека в сегодняшнем мире» Международного междисциплинарного Конгресса "Progressive Scientific Technologies for Human Health" (Феодосия, Украина, 2003 г.), "Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids" (Новосибирск, 2003), Объединенный иммунологический форум ( Екатеринбург, 2004), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), Всероссийская конференция «Фундаментальные науки - медицине (Новосибирск, 2005) Международный Междисциплинарного Симпозиума «From Experimental Biology to Preventive and Integrative Medicine» (Судак, Крым, Украина, 2005).