Введение к работе
Актуальность проблемы
Нарушение равновесия между свертывающей и противосвертывающей системами крови лежит в основе патогенеза многих заболеваний. Связано это, как правило, с недостаточностью кровоснабжения критического органа и угнетения его функциональной активности. К числу наиболее известных патологий такого рода относятся заболевания сердечно-сосудистой системы и некоторые инфекционные болезни. Кроме того, в поле зрения исследователей находятся митогенные и трансформирующие эффекты факторов свертываемости. Сформировалось представление о связи способности к быстрому росту и распространению в организме клеток различных новообразований с активностью внешнего пути свертывания крови. В этом случае ведущей является роль тромбоцитов и эндотелия.
Эндогенная регуляция множественных биологических эффектов тромбина строго регламентирована и реализуется на различных уровнях, от экспрессии отдельных белковых компонентов и их последующей активации в ходе каскадных взаимодействий между отдельными факторами свертывания до возбуждения специфических рецепторов тромбина и процессов передачи сигнала. Усилия специалистов ведущих научных центров и биотехнологических фирм мира (Maganin Pharmaceutical Inc., Genzyme Molecular Oncology, AEtema и др.) направлены на поиск новых субстанций и разработку препаратов, аналогичных эндогенным веществам. Эффективными для дальнейшего использования оказываются вещества, полученные как в результате химического синтеза (пептиды; производные индола, имидазола, пиридина), так и выделенные из натуральных источников (растения, беспозвоночные, рыбы, опухолевые клетки).
В ходе таких исследований создаются теоретические основы избирательной регуляции клеточной активности; решаются проблемы синтеза новых соединений; разрабатываются новые подходы к выделению, очистке и испытанию биологической активности перспективных субстанций. Настоящая работа находится в русле упомянутых направлений.
Цель диссертационного исследования состояла в изучении молекулярно-клеточных механизмов действия природных и синтетических
антикоагулянтов и обосновании путей их использования для регуляции функций клеток и тканей.
Задачи исследования
Для достижения указанной цели были сформулированы и решены следующие основные задачи:
-
Изучить особенности внутриклеточных изменений, развивающихся в нормальных и опухолевых клетках под действием тромбина.
-
Провести сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности.
-
Определить роль тромбининдуцируемых реакций в процессах развития новообразований и нормальных тканей. Обосновать пути эндогенной регуляции множественных биологических эффектов тромбина.
-
Разработать схему получения новых и оптимизировать схему получения известных производных хинолина. Провести синтез и сравнительный токсикологический анализ полученных субстанций в опытах in vitro.
-
Оптимизировать схему получения природного ингибитора тромбина -гирудина из медицинской пиявки; исследовать его эффекты на различных уровнях; протестировать его свойства в сравнении с другими природными антикоагулянтами из медицинской пиявки.
-
Изучить специфические и токсикологические свойства рекомбинантного фактора некроза опухоли-Р и производных фактора некроза опухоли-а в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина.
-
Провести сравнительное изучение антикоагуляционных свойств производных хинолина, индола, 10,11-дигидро-5Н-дибеш[Ь, вазелина, 2-оксо-1-пирролидино-2-бутина, камфары, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-тетрагидробензтиофена; сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих, гуанидиносодержащих соединений и гирудина. Исследовать возможность регуляции тромбининдуцируемой клеточной пролиферации с использованием указанных субстанций и рекомбинантных цитокинов.
8. В опытах in vivo на моделях мегастазирующих новообразований провести испытание противоопухолевой эффективности антикоагулянтов и рекомбинантных цитокинов.
Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов заключается, прежде всего, в фундаментальном значении теоретических выводов из диссертации.
Впервые с использованием приемов компьютерной лазерной фазовой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности. Полученные данные соотнесены с другими параметрами функционирования клеток.
Установлены специфические динамические характеристики Ras-
трансформированкьгх и опухолевых клеток; отмечены особенности влияния тромбина, эпидермального фактора роста и альфа-фетопротеина.
Сформулированы представления о роли тромбининдуцируемых реакций в процессах развития новообразований и нормальных тканей. Обоснованы пути эндогенной регуляции множественных биологических эффектов тромбина
Впервые в экспериментах на разных группах животных, в том числе и на обезьянах, были изучены антикоагуляционные и токсикологические свойства рекомбинантных фактора некроза опухоли-р и производных фактора некроза опухоли-а в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина. Данные соотнесены с результатами испытаний препаратов на культуре клеток in vitro.
Получены новые производные хинолина и испытаны их антикоагуляционные и токсикологические свойства.
Впервые проведено сравнительное изучение антикоагуляционных свойств
производных хинолина, индола, 10,11-дигидро-5Н-дибенз[Ь,і]азепина, 2-оксо-1-
пирролидино-2-бутина, камфоры, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-
тетрагидробензтиофена; сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих,
гуанидиносодержащих соединений и гирудина. Исследована возможность регуляции тромбининдуцируемой клеточной пролиферации с использованием некоторых перспективных для дальнейшего использования веществ.
Обнаружены центральные эффекты после введения ингибиторов тромбина экспериментальным животным.
Впервые на моделях перевиваемых метастазируюгцих опухолей было проведено сравнительное изучение разных способов регуляции множественных биологических эффектов тромбина и доказана их эффективность при лечении новообразований у мышей (рак легких РЛ-67; меланома В-16) и китайских хомяков (ХОП).
Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:
Разработаны экспериментальные модели изучения молекулярно-клеточных механизмов действия природных и синтетических антикоагулянтов. Полученные данные могут быть использованы в медицине при диагностике, исследовании и терапии ряда патологических состояний, прежде всего, новообразований и патологий гемостаза.
Методология, разработанная при изучении Дси-трансформированных клеток, может найти применение при дальнейших исследованиях особенностей развития опухолевых клеток.
Оригинальный синтез и исследование биологической активности новых производных хинолина в сравнении с другими полифункциональными гетероциклическими соединениями вносят реальный практический вклад в создание новых антикоагулянтов - регуляторов клеточной активности.
Проведено экспериментальное доклиническое испытание общей и специфической токсичности рекомбинантных фактора некроза опухоли-Р и производных фактора некроза опухоли-а. Данные соотнесены с антикоагуляционными свойствами препаратов.
Оптимизация способа выделения гирудина из натурального сырья позволяет обеспечить эффективное получение препарата для исследовательских и практических нужд. Результаты испытаний биологической активности препаратов из медицинской пиявки могут быть использованы при создании новых лекарств с целью профилактики тромбозов и новообразований, лечения инфекционных заболеваний.
Результаты сравнительных исследований противоопухолевой активности природных и синтетических антикоагулянтов могут найти применение при создании новых лекарственных препаратов и разработке альтернативных схем лечения новообразований.
В процессе разработки теоретических и практических основ регуляции множественных биологических эффектов тромбина проведен патентный поиск и подготовлена заявка на изобретение.
Апробация работы
Результаты, описанные в диссертации, были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований в области создания генно-инженерных препаратов для медицины и ветеринарии». Оболенск. 1992; II, Ш, IV, VI, VII Всероссийских Конгрессах «Человек и Лекарство». Москва. 1995, 1996, 1997, 1999, 2000; Научно-практической биотехнологической конференции, Степногорск, 1995; Международных конгрессах по иммунореабилитации в медицине, Сочи-Дагомыс, 1995, 1996; First FEPS congress, Maastricht, 1995; I Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии», Санкт-Петербург, 1995; European research conference «Molecular pathogenesis of infectious diseases», Obemau, 1996; XIV конференции «Морфометрия в диагностике болезней», Москва, 1996; International meeting of scanning microscopy, Washington, 1996; Spring meeting of British society for immunology, Bristol, 1996; ХП Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 1996; 1* Joint meeting of the ICS and the ISICR, Geneva, 1996; ХХП European tumor virus group meeting, Innsbruck, 1997; 13th European Immunology Meeting, Amsterdam, 1997; SPUE Meeting, San Remo, 1997; 4th European congress of pharmaceutical sciences, Milan, 1998; Conference on biomedical laser metrology and applications, Munich, 1999; 7th European Congress of Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, Jerusalem, 1999; Всероссийском биофизическом съезде, Москва, 1999; VI конференции Ассоциации гирудологов, Пятигорск, 1999; First euroconference on quantitative molecular cytogenetics, Bari, 2000.
По теме диссертации опубликовано 3 8 работ.
Структура и объем работы