Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Активные формы кислорода в организме 8
1.1.1. Пероксид водорода 8
1.1.2. Супероксидный анион - радикал 9
1.1.3. Синглетный кислород 9
1.1.4. Гидроксил радикал 10
1.1.5. Оксид азота 10
1.2. Цитотоксическое действие активных форм кислорода в организме 12
1.3. Антиокислительная защита организма 14
1.3.1. Механизмы внутриклеточной антиокислительной защиты 14
1.3.1.1. Супероксиддисмутаза 15
1.3.1.2. Каталаза 16
1.3.1.3. Пероксидаза 18
1.3.1.4. Глутатион зависимые ферменты 19
1.3.2. Механизмы неферментативной природы 21
1.4. Иммуноглобулины 23
1.5. Каталитически активные антитела 26
1.5.1. Природные каталитически активные антитела при различных аутоиммунных патологиях 28
1.5.2. Возможные механизмы образования природных абзимов 29
1.5.3. Природные абзимы с протеазной активностью 32
1.5.4. Природные абзимы с нуклеазными активностями 33
1.5.5. Природные абзимы с другими активностями 32
1.5.6. Абзимы с оксидоредуктазной активностью 35
1.6. Доказательство принадлежности каталитических активностей антителам 41
2. Экспериментальная часть 44
2.1 Реактивы и материалы 44
2.2. Методы 45
2.2.1. Получение сыворотки крови 45
2.2.2. Вьщеление антител из плазмы крови крыс аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose 45
2.2.3. Очистка IgG с помощью гель-фильтрации 45
2.2.4. Электрофоретический анализ белков - 45
2.2.5. Концентрирование препаратов белка 46
2.2.6. Определение концентрации белка 46
2.2.7. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей антител 46
2.2.8. Иммунизация кроликов 47
2.2.9. Определение оптимального значения рН в реакции окисления Диаминобензидина (DAB) антителами 48
2.2.10. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей белков в полиакриламидном геле 48
2.2.11. Проведение рН-шока антител 49
2.2.12. Исследование влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител 49
2.2.13. Определение каталазной и глутатионпероксидазной активностей AT 50
2.2.14. Определение кинетических параметров реакции окисления субстрата антителами 50
2.2.15. Анализ содержания металлов в препаратах антител 50
2.2.16. Хроматография AT на сорбенте, хелатирующем ионы металлов 51
2.2.17. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей методом флуоресценции 51
3. Результаты и их обсуждение 53
3.1. Выделение препаратов антител из сыворотки крови крыс линии Wistar 55
3.2. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей в препаратах антител 56
3.3. Определение оптимальных условий реакции окисления диаминобензидина антителами 63
3.3.1. Исследование зависимости пероксидазной активности от рН среды 63
3.3.2. Зависимость пероксидазной активности от концентрации пероксида водорода 65
3.4. Доказательство принадлежности каталитической активности антителам 66 3.4.1. Кислый шок препаратов антител 67
3.5. Локализация активных центров антител 71
3.5.1. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей методом in situ 73
3.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител 77
3.6.1. Анализ содержания металлов в препаратах антител 83
3.6.2. Хроматографическое разделение IgG на сорбенте, хелатирующем ионы металлов 87
3.7. Субстратная специфичность IgG при окислении различных соединений 97
3.7.1. Окисление различных субстратов препаратами антител 104
4. Выводы 109
5. Список литературы 110
- Цитотоксическое действие активных форм кислорода в организме
- Возможные механизмы образования природных абзимов
- Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей белков в полиакриламидном геле
- Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей в препаратах антител
Введение к работе
Известно, что окислительный стресс, а также действие мутагенов и канцерогенов приводит к старению человека и развитию у него различных патологий: раковых заболевании, инфаркта миокарда, атеросклероза, диабета, катаракт, эмфизем, различных дегенеративных заболеваний мозга, сердца, мышц, аутоиммунных заболеваний (АИЗ) т. д. [1]. Одной из основных причин окислительного стресса является накопление активированных форм кислорода (АФК): »02~, 'Ог, Нг02, НО*, ОСГ, R02*. НО*2, N0* и др. АФК являются потенциальными окислителями ДНК, белков, липидов и других компонентов клеток человека [2, 3].
Все АФК обладают высокой цитотоксичностью для любых типов клеток и клеточных образований, что определяется их химической реактивностью, при этом концентрации АФК в тканях невысоки: Н202 - 10"8 М, »0{~- 10"" М, НО'<10"" М [4-6].
В процессе эволюции для защиты от АФК в клетках выработались специализированные системы ферментативных антиокислителей. Ферментативные антиокислители характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных АФК; специфичностью клеточной и органной локализации, которые зачастую перекрываются комплементарным образом, а также необходимостью присутствия в качестве катализаторов металлов, таких как Си2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+ [7, 8].
Иммунная система высших организмов играет важнейшую роль в их защите от патогенного влияния окружающей среды. Центральную роль в этом процессе играют антитела, основной функцией которых является взаимодействие со специфическими антигенами, приводящее к нейтрализации токсинов, чужеродных микроорганизмов и т. д. Однако, исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов - их способности катализировать большое число различных химических реакций.
В настоящее время абзимология - наука, изучающая антитела, обладающие ферментативными активностями, интенсивно развивается, и число примеров химических превращений, катализируемых абзимами, превышает 100. Методами сайт-направленного мутагенеза и селективной химической модификации [9, 10] были получены абзимы, субстратная специфичность которых в ряде случаев выше, чем ферментов, а также абзимы, для которых нет аналогов среди природных ферментов [11].
Новые перспективы в области изучения каталитически активных антител возникли в 1989 году в связи с открытием группой С. Пола [12] первых природных абзимов с протеолитической активностью в сыворотке крови больных бронхиальной астмой.
Позднее, при ряде других аутоиммунных заболеваний, а также в молоке здоровых рожениц, были обнаружены абзимы с протеолитической, фосфатазной, ДНК- и РНК-гидролизующими, амилолитической, полисахарид-, протеин- и липидкиназной активностями. Недавно было показано, что AT человека и животных обладают супероксиддисмутазной активностью и превращают синглетный кислород 'Ог в его восстановленную форму О * [13,14].
Группой И. Генералова было показано, что препараты IgG крови здоровых доноров и пациентов с различными формами гепатита обладают пероксидазной активностью [15], но доказательства отнесения этой активности непосредственно к AT отсутствовали.
Цель настоящей работы заключалась в исследовании пероксидазной активности препаратов IgG, из крови крыс линии Wistar. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Доказать, что исследуемые пероксидазная и оксидоредуктазная активности являются собственным свойством антител;
Изучить влияние ионов двухвалентных металлов на ферментативные активности антител;
Провести анализ субстратной специфичности AT с пероксидазной и оксидоредуктазной активностями;
Определить относительные удельные оксидоредуктазную и пероксидазную активности антител в реакциях окисления 3,3'- диаминобензидина (DAB);
Изучить ферментативные свойства (металл- и рН-зависимость, кинетические параметры реакции окисления субстратов), а также провести их сравнение с соответствующими характеристиками пероксидазы хрена.
Цитотоксическое действие активных форм кислорода в организме
Все формы АФК обладают высокой цитотоксичностью для любых типов клеток и клеточных образований, наиболее вероятными мишенями являются процессы индукции ПОЛ в биологических мембранах, повреждения белков связанных с мембранами, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток [4]. В зависимости от ситуации любые белки, липиды, нуклеиновые кислоты могут стать критическим элементом повреждающего действия АФК, что приводит к изменению физико-химических свойств белков: фрагментации, агрегации и подверженности протеолизу. В первую очередь воздействию кислородных радикалов подвергаются остатки пролина, гистидина, аргинина и SH-содержащие аминокислоты. Агрегация белков связана со способностью АФК образовывать межмолекулярные сшивки. В результате денатурации белковых молекул нарушается их конформация, и они становятся более уязвимыми к действию протеолитических ферментов [7].
Окисление липидных молекул приводит к необратимому изменению или повреждению мембранных структур, нарушению их проницаемости для ионов, в результате чего усиливается гемолиз эритроцитов. Наиболее подвержены перекисному окислению ненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая, арахидоновая и докозагексаеновая. Окисление липидов приводит к образованию перекисей и увеличению гидрофильности молекул. В плазме крови АФК вызывают окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности (ЛНП), в результате чего они становятся цитотоксичними и эффективно захватываются макрофагами через скэвенджер-рецепторы. Окисленные ЛНП обладают более высокой электрофоретической подвижностью и повышенной гидрофильностью [27].
Идентифицировано более 20 типов окислительных повреждений молекул нуклеиновых кислот: различные виды повреждения оснований, возникновение одно- и двухцёпочечных разрывов, сшивок и хромосомных аберраций. Как правило, прямое действие «Ог" и Н2О2 на ДНК не вызывает повреждения оснований или образования сшивок между основаниями. Основным повреждающим агентом выступает ОН-радикал, который взаимодействует с дезоксирибозой, пуриновьгми и пиримидиновыми основаниями. Синглетный кислород более специфично, чем ОН взаимодействует с гуанином. Пероксинитрит вызывает нитрозилирование и дезаминирование аминогрупп в основаниях ДНК, при этом 8-нитрогуанин является индикатором повреждающего действия пероксинитрита. В условиях окислительного стресса в наибольшей степени повреждается ДНК митохондрий, из-за низкой активности систем репарации, а также низкого содержания гистоновьгх белков, оказывающих защитное действие [32].
Углеводы также подвержены окислительному действию АФК, было показано, что глюкоза может выступать в качестве ингибитора ОН-радикалов. Однако в физиологических условиях углеводы могут претерпевать аутоокисление с образованием дикарбонильных соединений, Н2О2 и гидроксильных радикалов, и таким образом скорее усиливают образование АФК, нежели их ингибируют. Так как метаболизм углеводов значительно интенсивнее метаболизма липидов и белков, то окисленные продукты данных соединений достаточно быстро удаляются из организма и не являются причиной последствий окислительного стресса [33].
Все специализированные ферментативные системы синтеза АФК (NADPH-оксидаза, пероксидазы, (миелопероксидаза в нейтрофилах, пероксидаза в эозинофилах) NO-синтаза) участвуют в микробицидном действии фагоцитов.
Н2О2, in vitro в концентрациях 0.1-2.5 мМ, вызывает повреждение ДНК и разрушение гранулоцитов крови, а также Т - лимфоцитов ВИЧ - инфицированных людей, при этом фрагментация молекул ДНК является важным признаком апоптотической гибели этих клеток. Цитотоксическое действие Н2О2 in vivo может реализовываться через инактивацию ингибитора протеиназ и активацию сывороточных белков системы комплемента по альтернативному пути [34].
ОН -радикалы вызывают повреждение ДНК, фибронектина, альбумина и других молекул клеточных структур, ингибируют белки С5 - фракции системы комплимента, индуцируют образование органических радикалов и таким образом запускают ПОЛ. Считается, что цитотоксическое действие кислородных радикалов более чем на 50% обусловлено ОН -радикалами [34]. Гидроксильный радикал может разрывать любую С-Н- или С-С- связь, и взаимодействует с органическими соединениями со скоростью, равной скорости диффузии, в результате чего время жизни ОН -радикала в биологических системах по разным оценкам составляет от 2 10" до 8"10 9 с [35].
Цитотоксическое действие N0 "-радикала может во многом зависеть от образования окислов азота: нитрита (NO2-), нитрата (ИОз ) и пероксинитрата (ONOO-). Нитрит снижает микробицидное действие гипогалоидов в системе НгОг-миелопероксидаза-СІ [36]. Пероксинитрит способен окислять NH2- и SH- группы белков, что приводит к инактивации а і-ингибитора протеиназ и снижению антиокислительной активности плазмы крови; также индуцирует процессы ПОЛ в мембранах. Показано, что участие ONOO- в расщеплении ДНК, в конечном итоге, может приводить к канцерогенезу. Пероксинитрит стимулирует проколлагеназу нейтрофилов человека, которая играет важную роль в разрушении и перестройке ткани в физиологических условиях, а также в таких патологических процессах, как воспаление и инфекция; данные подтверждают участие пероксинитрита в ускорении роста опухолей [31].
В нормально функционирующем организме концентрация кислородных радикалов находится под контролем системы антиокислительной защиты, ферментативных и неферментативных механизмов, предупреждающих и устраняющих последствия повреждений, вызванных свободнорадикальными окислительными процессами. Но свободные радикалы способны выходить из-под контроля клетки, что приводит к усилению их повреждающего действия и, в конечном итоге, к проявлению различного рода патологий.
Антиокислительная защита направлена против всех видов радикалов, образующихся в организме [37-40].
В настоящее время под антиокислителями (или антиоксидантами) подразумевают широкий класс соединений различной химической природы, которые способны тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических соединений молекулярным кислородом [2]. Соединения этой группы реагируют со свободными радикалами, а также катализаторами свободно радикального окисления и, прежде всего, с ионами металлов переменной валентности.
Защита от повреждающего действия АФК осуществляется на всех уровнях организации: от клеточных мембран до организма в целом. Жирорастворимые антиокислители (фосфолипиды, токоферолы, витамин А, каротиноиды, убихинон, витамины группы К, стероидные гормоны) осуществляют свою защитную функцию в биологических мембранах. Водорастворимые антиокислители (аскорбиновая, лимонная, никотиновая, липоевая и бензойная кислоты; серосодержащие соединения - цистеин, гомоцистеин, церулоплазмин; полифенолы, флавоноиды, трансферрин, лактоферрин, альбумин, мочевина, мочевая кислота) в основном локализуются в цитозоле клеток, межклеточной жидкости, плазме крови и лимфе [57].
Возможные механизмы образования природных абзимов
Однако наиболее убедительные данные о существовании природных абзимов -каталитических антител - были получены в течение последних 15 лет.
Подавляющее большинство данных, полученных к настоящему времени свидетельствует о том, что появление и наработка природных каталитических антител определенно связана с иммунными нарушениями. Аутоиммунные заболевания (АИЗ) характеризуются наличием в организме высокого титра аутоантител к специфическим эндогенным антигенам. В случае астмы таким антигеном является широко представленный в центральной и периферической нервных системах вазоактивный интестинальный нейропептид (ВИП) [12]. При аутоиммунном тиреоидите (АИТ) наблюдается повышенная концентрация антител к тиреоглобулину, микросомальной фракции тироцитов и некоторым другим антигенам [70].
У больных рассеянным склерозом (PC) наблюдается повышенный синтез в ткани мозга и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов (обычно IgG), а также свободных легких цепей AT [71, 72]. При PC, как и при других АИЗ, обнаружены полиспецифические ДНК-связывающие AT, взаимодействующие с фосфолипидами [73,74].
Некоторые вирусные заболевания типа иммунодефицита человека и вирусных гепатитов не относятся к аутоиммунным заболеваниям (АИЗ), но у людей с этими патологиями происходит существенное нарушение их иммунного статуса. Так, вирусные гепатиты [74] и СПИД [75, 76] сопровождаются гуморальными и клеточными реакциями: в крови больных гепатитом (так же как и при АИЗ) обнаруживаются тканенеспецифические и неорганоспецифические аутоантигены.
Известно, что при АИЗ эффективно протекает апоптоз клеток, в результате, которого в крови могут появляться как нативные, так и частично деструктурированные белки, НК и другие компоненты клеток. Следовательно, одной из особенностей больных АИЗ является повышенное содержание в их крови НК и, соответственно, анти-НК антител. Подобный эффект обнаружен у пациентов с СКВ, аутоиммунным гепатитом, болезнью Грейвса, полимиозитом, PC [77-82], синдромом Сьегрена [80], а также при некоторых вирусных заболеваниях, например, при СПИД [74, 74] и лимфопролиферативных [81].
В работе [83] было показано, что в первый триместр беременности кровь женщин также содержит ДНК в повышенных концентрациях, а в последний триместр происходит характерный для АИЗ апоптоз клеток [84]. Таким образом, стала очевидной возможность скрытой иммунизации рожениц и некоторых общих или похожих механизмов наработки абзимов у рожениц и больных АИЗ.
Особый иммунный статус имеет материнское молоко. В течение первых 6-7 месяцев жизни, пока иммунная система новорожденных еще не сформирована, иммуноглобулины материнского молока играют важную роль в создании пассивного иммунитета ребенка. В этот период в молоке также присутствуют анти-ДНК антитела и их уровень слабо изменяется в период лактации [85].
Более того, АИЗ характеризуются повышенным уровнем различных типов абзимов, например, с НК-гидролизующими и протеолитическими активностями, к широкому спектру эндогенных антигенов. Каталитическая активность обычно возникает у природных аутоантител в результате ответа на антигены, моделирующие переходные состояния химических реакций, либо в качестве вторичных аутоантител к активным центрам ферментов [86-91]. Например, абзимы, выделенные из сыворотки крови пациентов с подтвержденным диагнозом СКВ, астма, гемофилия или тиреоидит, способны гидролизовать различные специфические субстраты, такие как ДНК, нуклеосомы, ВИП, тиреоглобулин, фактор VIII, протромбин и т.д. (для обзора см. [87-91]). Следует отметить, что связь между АИЗ и катализом аутоантителами также подтверждается тем, что штаммы мышей с генетической предрасположенностью к АИЗ продуцируют каталитические антитела в ответ на иммунизацию аналогами переходного состояния [92]. Накопленные на данный момент данные говорят о том, что иммунная система человека потенциально способно генерировать обширный пул НК-гидролизующих активностей, что проявляется в вариациях субстратной специфичности, значений Км и Fmax, также различном отношении к ионам двухвалентных металлов, рН и ионной силе реакционной смеси [87-91].
Одной из основных проблем абзимологии является получение высокоспецифичных моноклональных антител с высокой удельной активностью и высоким сродством к субстратам. Индукция и дизайн AT с заданной каталитической специфичностью имеют огромный спектр возможностей в биотехнологии и медицине. Основные механизмы генерации антител с ферментативными свойствами к настоящему времени хорошо изучены в экспериментах с моноклональными антителами. Однако возможность реализации того или иного варианта in vivo, как в случае природных поликлональных абзимов, оценить достаточно проблематично. Тем не менее, существует несколько моделей индукции каталитических антител.
Первый механизм получения каталитически активных антител основан на том, что мАТ вырабатываются не к субстрату непосредственно, а к стабильному аналогу переходного состояния (САПС), который может стабилизировать и увеличивать эффективность превращения субстрата. При этом структура используемого аналога должна быть максимально близкой структуре переходного состояния и максимально отличаться от структуры исходного субстрата. Абзимы, полученные на первом этапе развития абзимологии, отличались низкими скоростью и специфичностью катализа соответствующих реакций. Тем не менее, эти работы заложили основу для конструирования аналогов переходных состояний для получения мАТ с различными заданными активностями.
Известно, что при аутоиммунных заболеваниях происходит спонтанная наработка первичных AT к белкам, нуклеиновым кислотам и их комплексам, а затем вторичных AT уже к наработанным первичным AT и т. д. [70, 82]. В связи с этим считается, что в крови пациентов с АИЗ могут содержаться различные AT, возникновение которых можно объяснить на базе модели антиидиотипической сети Эрне (N. Jerne) [93], согласно которой антиидиотипические AT, полученные к антигенсвязывающему центру IgG, узнающему активный центр какого-либо фермента, могут сами проявлять аналогичную активность.
Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей белков в полиакриламидном геле
Как следует из данных «Литературного обзора» каталитически активные антитела с различными ферментативными функциями образуются в основном у больных различными АИЗ, а также в крови и молоке здоровых по медицинским показаниям беременных и лактирующих женщин. У здоровых доноров, кроме рожениц, уровень активности AT обычно очень низок, что затрудняет достоверное установление их существования. Тем не менее, есть несколько примеров достоверного детектирования каталитической активности абзимов в крови небольшого числа здоровых доноров. Например, поликлональные IgG, расщепляющие вазоактивный нейропептид были найдены как в крови больных астмой, так и у здоровых доноров [12]. Позже абзимы, расщепляющие тиреоглобулин, также были обнаружены в крови больных АИЗ и здоровых доноров [114].
Появление абзимов в крови беременных и молоке лактирующих женщин, здоровых по медицинским показаниям, следует рассматривать как особое и уникальное явление, возможно имеющее какое-то отношение к аутоиммунным реакциям. Во время беременности и с началом лактации организм женщины характеризуется особым иммунным статусом [87, 89,123]. Кровь женщин, подобно крови больных АИЗ, содержит ДНК в повышенных концентрациях [83, 123]. Кроме того, она еще содержит клетки плода и установлена корреляция повышенной частоты их встречаемости с заболеваемостью аутоиммунной склеродермой [162]. Ревматоидный артрит ослабляется или исчезает во время беременности [163], а состояние больных с СКВ и антифосфолипидным синдромом, а также рядом других АИЗ, заметно ухудшается [164]. Сразу после родов иногда наблюдается аутоиммунный шок - резкое обострение аутоиммунной (АИ) реакций. Независимо от того, был ли у рожениц аутоиммунный шок, у некоторых из них развивается ряд послеродовых АИ-патологий: тиреоидит, почечная недостаточность, гемолитическо-уремический синдром, идиопатический полимиозит, антифосфолипидный синдром, АИ-миокардит [162, 165]. При этом послеродовые АИЗ могут проявляться сразу после родов или в более поздний период. Послеродовой аутоиммунный тиреоидит - одно из наиболее часто встречающихся послеродовых АИ-расстройств. Частота его встречаемости, показанная разными исследователями, варьирует в пределах 1.9-16.7% [166, 167]. В то же время, в отличие от типичных больных АИЗ, исчезновение признаков АИЗ у женщин в поздний послеродовой период является нормой, хотя в отдельных случаях «временная активация АИ-процессов» иногда плавно или остро (через АИ-шок) переходит в типичный хронический АИ-процесс. Особенностью реорганизации иммунной системы беременной женщины является «включение» особой иммунопамяти, которая аккумулирует во время беременности всю информацию о вредных факторах окружающей среды [87, 89, 123]. Эта информация частично «используется» иммунной системой в период беременности, но в основном сразу после начала лактации. В случае млекопитающих это ведет к тому, что их иммунизация различными антигенами за 1-3 месяца (но не более) до появления новорожденного приводит к тому, что молоко содержит AT к этим антигенам в очень больших концентрациях [168, 169]. При этом не важно, каким путем попадает антиген в организмы млекопитающих (введением в кровь или орально), а также является ли он компонентом пищи, бактерий или вирусов. Эти данные указывают на то, что появление абзимов у рожениц может иметь какие-то особые причины.
Первым примером абзимов у здоровых пациентов были AT, катализирующие окислительно-восстановительные реакции - супероксиддисмутазную и каталазную. Эти данные свидетельствовали о защите организма млекопитающих от Ог" с помощью AT и поставили вопрос о возможности специальной эволюции Ig как специфических антиоксидантов крови [13, 14]. Для Ig был открыт механизм, с помощью которого кислород может быть восстановлен и повторно использован при фагоцитозе, что указывает на возможность участия иммунной системы в микробной регуляции. Еще более удивительным является сделанное недавно открытие абзимов высших эукариот, катализирующих образование озона, используемого клетками при фагоцитозе [14].
Поскольку из супероксидрадикала образуется пероксид водорода, встал вопрос о том, не могут ли AT обладать и другими каталитическими активностями типа глутатионпероксидазы или других пероксидаз, превращая токсичную Н2О2 в НгО? В данной работе проведена исследование, направленное на выяснение этого вопроса. Известно, что крысы, особенно дикого типа, очень устойчивы к различным исключительно вредным факторам окружающей среды, включая окислительный стресс и повышенное радиоактивное излучение. В ИЦиГ СОРАН были получены линии крыс Wistar, а также OXYS, которая зарегистрирована в международных базах данных с ключевой характеристикой «врожденная гиперпродукция свободных радикалов» [170]. Недавно было показано, что крысы линий Wistar и OXYS являются хорошими моделями для изучения ферментов реперации [171]. Было проведено сравнение относительной активности ферментов репарации в ядрах, цитозоле и митохондриях крыс OXYS и Wistar [171]. Показано, что в ядрах и митохондриях клеток печени крыс OXYS и Wistar с возрастом увеличивается активность ферментов репарации, удаляющих из ДНК модифицированные нуклеотиды (дезоксирибоуридин, гипоксантин, 8-оксигуанин). Однако увеличение активности всех этих ферментов не предотвращает развитие окислительного стресса. Содержание окисленных белков в печени особенно в мозге крыс OXYS с возрастом нарастает быстрее, чем у Wistar. На первом этапе работы была поставлена задача установления возможности присутствия в крови крыс AT с окислительно-восстановительными функциями. В качестве объекта исследования были выбраны иммуноглобулины класса G из сыворотки крови здоровых крыс линии Wistar.
Выделение гомогенных препаратов моноклональных абзимов чаще всего представляется относительно простой задачей и достигается аффинной хроматографией AT на сорбентах с иммобилизованными гаптенами. В то же время, получение гомогенных препаратов природных абзимов с высокой активностью является одной из самых сложных задач. Известно, что суммарные препараты AT являются поликлональными, состоят из большого числа Ig, имеющих сродство к различным гаптенам, включая белки и ферменты и т.п., которые могут быть прочно связанными с этими AT. Абзимы, входящие в состав поликлональных препаратов AT, могут иметь различное происхождение, и их взаимодействие с каким-либо из иммобилизованных субстратов может отличаться на порядки. Таким образом, при очистке абзимов на первых стадиях необходимо отделить AT от всевозможных АГ, белков и ферментов и т.д. Затем выделить фракцию AT, имеющую повышенное сродство к потенциальному субстрату, и далее отделить фракцию абзимов от AT, имеющих сродство к тому же лиганду, но не обладающих каталитической активностью. Разработанные к настоящему времени методы очистки абзимов позволяют осуществить все описанные выше этапы, кроме последнего. До сих пор, нет методов, которые позволили бы разделить абзимы и AT без каталитической активности.
Аффинная хроматография на носителях с иммобилизованным белком А из Staphylococcus aureus является широко применяемым и эффективным методом вьщеления иммуноглобулинов из различных биологических жидкостей, и позволяет достичь высокой степени очистки иммуноглобулинов. Белок А обладает высоким сродством к Fc-участком иммуноглобулинов класса G подклассы (Gl, G2 и G4), что позволяет проводить селективную элюцию компонентов иммунных комплексов (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) в условиях с повышенной ионной силой или в присутствии неионных детергентов, не затрагивая при этом комплексов Ig с белком А [150].
Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей в препаратах антител
Этот же подход был использован для анализа каталитической активности у изолированных легких и тяжелых цепях IgG. С этой целью перед электрофорезом препараты AT обрабатывали ДТТ. Для ряда индивидуальных препаратов IgG крыс методом in situ была обнаружена активность как у легких, так и у тяжелых цепей, но для некоторых препаратов четко выявлялась активность только тяжелой цепи (рис. 13, б, дор. 2,3).
Анализ активности непосредственно в геле имеет определенные ограничения. Так, гель невозможно инкубировать достаточно продолжительное время в реакционной смеси для ренатурации белка и его активности, поскольку в этом случае может происходить частичное «вымывание» белка из геля. В то же время за приемлемое время ренатурации белка в геле хорошего восстановления активности может не достигаться. При анализе in situ также невозможно инкубировать гель с субстратом достаточно продолжительное время, поскольку это ведет к сильной неспецифической окраске фона. Эти недостатки метода in situ можно избежать, если после электрофореза и удаления SDS, продольный гель разрезать на мелкие поперечные фрагменты длиной 2-3 мм. Затем кусочки геля растереть и экстрагировать белок из геля в течение долгого времени. При этом произойдет не только «экстракция» белка, но и более эффективное восстановление его активности. Учитывая это, для количественного анализа пероксидазной активности изолированных субъединиц IgG дополнительно был использован этот подход. Как видно из рис. 14, после электрофоретического разделения IgG, обработанного ДТТ в мягких условиях, пик пероксидазной активности совпадает с положением легкой и тяжелой цепей IgG, однако, наблюдается небольшая активность в положении интактного IgG. При этом пик легкой цепи обладает более высокой активностью. Таким образом, наличие у IgG крыс пероксидазной и оксидоредуктазной активностей подтверждено с использованием большого числа различных подходов, включая один из самых достоверных, однозначных и наглядных критериев - анализ активности in situ.
Полученные данные свидетельствуют о том, что препараты поликлональных IgG крыс гетерогенны по своему составу, и могут содержать моноклональные AT, в составе которых содержатся как каталитически активные легкие, так и тяжелые цепи. Тем не менее, у некоторых крыс, по-видимому, происходит наработка AT, в которых более активными являются тяжелые цепи. Следует отметить, что, согласно литературным данным [13-14], за супероксиддисмутазную активность AT млекопитающих ответственны тяжелые цепи каталитических IgG. Тем не менее, на данном этапе все же невозможно однозначно ответить на вопрос, существуют ли AT, у которых активный центр сформирован только вариабельной частью легких или только тяжелых цепей. На основании совокупности полученных результатов и литературных данных можно предположить принципиальную возможность разных типов организации активных центров для отдельных субфракций поликлональных AT.
К критериям доказательства активности абзимов также относится анализ их субстратной активности и сравнение ферментативных свойств с каноническими ферментами с такими же энзиматическими функциями (см. ниже).
Известно, что все растительные, бактериальные и эукариотические оксидазы, пероксидазы и дисмутазы, использующие в качестве субстратов активные формы кислорода, являются ферментами, зависимыми от ионов металлов [2, 41]. Единственным ферментом независимым от ионов металлов, является глутатионпероксидаза, которая является селензависимым ферментом. Две известные супероксиддисмутазы эукариот являются Мп- Си- и Zn-зависимыми, в то время как в некоторых бактериях обнаружены Ni- и Fe-зависимые дисмутазы [41]. Fe -зависимая каталаза человека в основном локализована в гепатоцитах и пероксисомах [24]. Необходимо было установить являются ли пероксидазная и оксидоредуктазная активности IgG крыс также металлзависимыми.
Нами проведен анализ влияния экзогенных ионов металлов на относительную активность некоторых препаратов AT. Было показано, что добавление непосредственно в реакционную смесь ионов Fe2+, Cu2+, Ni2+, Со2+, Mn2+, Mg2+ и Ca2+ или после их предынкубации с AT, приводили к возрастанию пероксидазной активности IgG. Как видно из рис. 15, зависимости скорости окисления DAB от концентрации экзогенных металлов имеют очень сложный вид. При этом колоколообразные зависимости с несколькими дискретными максимумами достоверно воспроизводятся. Это указывает на то, что поликлональные препараты AT могут содержать несколько различных субфракций IgG с отличающимся сродством к различным ионам металлов и/или различной активацией экзогенными ионами металлов отдельных субфракций AT, которые содержат разные эндогенные ионы металлов. Оптимальным вариантом предынкубации AT с ионами металлов была 5.0 мМ Си2+ или 1.4 мМ Fe2+(cM. ниже). В качестве примера на рис. 16 приведены кинетические кривые образования продукта для препаратов IgG3 и IgGl 1 до и после его предынкубации с 1.4 мМ FeS04, и 5.0 мМ CuS04, соответственно. Известно, что ионы металлов с переменной валентностью, особенно Fe2+H Cu2+ стимулируют разложение Н2О2 и неспецифическое окисление различных соединений, включая DAB. При использовании стандартного буфера, пропущенного через Chelex, уровень неспецифического окисления в отсутствие ионов металлов не превышал 0.5-3% от такового для Платовых значений, соответствующих образованию продуктов в присутствии AT. Уровень накопления продукта возрастал с увеличением концентрации AT и мог достигать больших значений, порядка 2.5-3 ед А450/МЛ (например, рис. 6, а) и более. Для корректной оценки относительных активностей AT для каждого препарата IgG подбиралась такая концентрация, которая соответствовала линейному участку зависимости накопления продукта от концентрации IgG. Линейные участки кривых образования продукта от времени при различных концентрациях DAB обычно не превышали 1-2 мин (рис. 16), в зависимости от препарата AT и его концентрации в 5-20 и более раз ниже Платовых значений, согласно наклонам кинетических кривых уровень неспецифического окисления в присутствии ионов металлов не превышал 0.1-1.0% от такового для кривых, соответствующих AT, предынкубированным с ионами металлов (рис. 16 и 17). Добавление 1.4 мМ Fe + и 5.0 мМ Си2+ непосредственно в реакционную смесь приводило к увеличению АТ-зависимого образования продукта в 1.5-2.5 раза по сравнению с AT, предынкубированными с ионами металлов в этих концентрациях. При этом на кинетических участках кривых уровень неспецифического окисления DAB возрастал до 15-30% по сравнению с уровнем специфического окисления. Тем не менее, различие в кинетических кривых было статистически достоверным.