Введение к работе
Актуальность проблемы, задачи работы. Предлагаемая работа посвящена созданию удобной экспериментальной модели для исследования молекулярной природы уникального класса нейродегенеративных заболеваний человека и животных, таких как скрэйтш овец и синдром Крейцфельда-Лкоба человека. Несмотря на то, что у животных эти заболевания описаны около двухсот лет назад, а у человека в начале этого века, их природа оставалась непонятной вплоть до последнего времени. Объяснение столь медленному прогрессу в исследовании природы этих заболеваний заключается в их исключительно необычной этнологии: известно, что данные заболевания могут возникать спорадически и в то же время они могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. Долгое время комбинация этих трех свойств казалась абсолютно необъяснимой. В 1967 была предложена так называемая «белковая» гипотеза, подразумевающая, что инфекционный агент, вызывающий эти заболевания, который получил названия «прион», представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподдержанию при помощи некоего автокаталитического механизма. Эта революционная гипотеза получила в настоящее Еремя солидное экспериментальное подтверждение в основном благодаря использованию удобных животных моделей и переходу на генно-инженерные методы исследования. В последнее время данные заболевания приковали к себе особо пристальное внимание исследователей не только в силу своей уникальности с точки зрения фундаментальной медицины и биологии, но из-за эпидемического характера их распространения у сельскохозяйственных животных в ряде стран Западной Европы. Особое значение данная проблема получила в силу появпвшггхся в последнее время сообщений о возможности передачи данных заболеваний от животных к человеку.
Три года назад появилась работа, предсказывающая существование прионов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Высказанная гипотеза подразумевала, что цитоплазматический способ наследования двух необычных генетических детерминант дрожжей [PSf] и [URE3] объясняется их прионоподобной природой. Эта революционная концепция была основана исключительно на генетических наблюдениях и нуждалась в биохимическом подтверждении. В связи с этим конкретная задача данной работы состояла, в основном, в исследовании природы прионоподобного детерминанта [PSt], а именно: в доказательстве зависимости свойств белка Sup35p от детерминанта [PSf], в исследовании механизмов проявления супрессорного фенотипа детерминанта [PSf], в
изучении механизмов наследования детерминанта [PSt], в исследовании влияния мутаций в гене SUP 35 на наследование и проявление детерминанта [PSf].
Научная новизна результатов. В ходе работы впервые удалось доказать, что фенотип [PSt] действительно связан с белком Sup35p. Также было показано, что данный белок обладает рядом свойств, присущих прионам. Были исследованы механизмы взаимодействия Sup35p с белком Sup45p, в результате чего был предложен новый механизм регуляции экспрессии генов на посттрансляционном уровне. Была разработана бесклеточная система для исследования прионоподобного превращения белка Sup35p, при помощи которой было показано, что Sup35ppsi" превращается в прионоподобную протеазоустойчивую форму, если он прединкубируется с Sup35pPSI'. Такой конформационный переход был повторен в последовательных циклах, что позволило смоделировать in vitro наследование детерминанта [PSt]. Белок Sup35pps" был очищен и показана его высокая способность к превращеншо Sup35ppb'~ в прионоподобную изоформу [PSt]. Это доказывает, что Sup35ppsl+ является единственным белком, требующимся для прионоподобного превращения белка Sup35p, таким образом, подтверждает верность прионной концепции для детерминанта [РБҐ]. В ходе работы были получены данные, указывающие на справедливость полимеризационной модели . прионоподобного превращения белка Sup35p. Был также установлен механизм элиминации детерминанта [PSf] за счет мутации в N-концевой последовательности гена SUP35. Следует отметить, что значение работы не исчерпывается только созданием простой экспериментальной системы для исследования этиологии и патогенеза прионных заболеваний, но имеет гораздо более широкое общебиологическое значение, поскольку открывает перспективы изучения некоторых механизмов эпигенетической («белковой») наследственности.
Практическая ценность работы. Изучение прионных заболеваний на моделях трансгенных животных встречает ряд технологических трудностей. Использование дрожжей Sacharomyces cerevisiae в качестве модельного объекта значительно облегчает изучение общих механизмов, присущих явлению прионов, так как дрожжи представляют собой наиболее удобный для молекулярно-генетнческого анализа эукариотический организм.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 17-ой Международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Lisboa, 1995), 50-ой конференции Корейской Ассоциации Биологических Наук (Seoul, 1996), Международной конференции «Translational control» (Cold Spring Harbor, 1996), Международной конференции имени Жака Моно «Post-transcriptional regulation: molecular
and functional aspects» (Assois, 1997), межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ (1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б статей и 2 тезисных сообщения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 120 страницах и включает 23 рисунка, 2 таблицы и список литературы, содержащий 116 ссылок.