Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. О растворимой гуанилатциклазе 8 стр.
1. Основные характеристики растворимой гуанилатциклазы 8 стр.
2. Субъединичная структура и изоформы растворимой гуанилатциклазы 10 стр.
3. Активная форма растворимой гуанилатциклазы 14 стр.
4. Структурные особенности субъединиц фермента 15 стр.
5. -N-концевой гем-связывающий домен 17 стр.
6. -центральный димеризационный домен 21 стр.
7. -С-концевой каталитический домен 23 стр.
8. Механизм каталитической активности растворимой гуанилатциклазы 26 стр.
Глава 2. Оксид азота - эндогенный активатор растворимой гуанилатциклазы 28 стр.
1. Растворимая гуанилатциклаза-как основной внутриклеточный рецептор оксида азота 28 стр.
2. Механизм взаимодействия оксида азота с растворимой гуанилатциклазой 30 стр.
3. Основные физиологические эффекты оксида азота 32 стр.
Глава 3. YC-1 - NO-независимый активатор растворимой гуанилатциклазы 34 стр.
Материалы и методы исследований 40 стр.
1. Использованные реактивы 40 стр.
2. Объект исследования 41 стр.
3. Выделение тромбоцитов из крови человека 41 стр.
4. Определение концентрации белка 41 стр.
5. Ферментативная реакция 42 стр.
6. Иммуно ферментный анализ 43 стр.
7. Статистическая обработка результатов 46 стр.
Результаты исследований 47 стр.
- Субъединичная структура и изоформы растворимой гуанилатциклазы
- Структурные особенности субъединиц фермента
- Механизм взаимодействия оксида азота с растворимой гуанилатциклазой
- Иммуно ферментный анализ
Введение к работе
Одним из значительных открытий последних лет, имеющих фундаментальное значение и позволивших по-новому подойти к пониманию молекулярных основ ряда физиологических процессов в клетке, является открытие оксида азота (N0) и установление его роли в регуляции различных физиологических и биохимических процессов (Нобелевская премия в области физиологии и медицины, 1998 г).
Эндогенный оксид азота (N0) образуется из L-аргинина за счет окисления аминогруппы гуанидинового фрагмента под действием L-аргинин- NO-синтетазы и идентичен эндотелиальному фактору релаксации (ЭДФР) [1]. Эндогенный оксид азота участвует в процессах нейротрансмиссии, является цитотоксическим агентом и мощным фактором гемостаза [2]. Кроме того, оксид азота ингибирует агрегацию тромбоцитов и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор. Антиагрегантные свойства и сосудорасширяющее действие оксида азота связаны с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ) [3].
Гуанилатциклаза катализирует биосинтез цГМФ из гуанозин-5-трифосфата (ГТФ). Гуанилатциклаза существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. В настоящее время достоверно установлено, что эти формы не только самостоятельные белки, но и ферменты, с различными механизмами регуляции [4]. Растворимая гуанилатциклаза является гетеродимером, состоящим из двух иммунологически различных субъединиц. Мембранная форма представляет собой трансмембранный фермент, состоящий из одной полипептидной цепи [5;б] и служит рецептором для натрий уретических пептидов [7]. В данной работе будет рассматриваться только растворимая форма гуанилатциклазы, так как именно этот фермент лежит в основе молекулярных механизмов действия оксида азота.
Интерес к гуанилатциклазе резко возрос в конце 80-х годов после идентификации оксида азота в качестве эндотелиального фактора релаксации (ЭДФР) [8]. Именно тогда появилась новая внутриклеточная сигнальная система оксид азота - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ [8].
Важная роль повсеместно распространенной сигнальной системы: N0 - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в функции клеток, нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях (гипертония, астма, сепсис, септический шок, злокачественные новообразования) требуют создания препаратов, которые бы направленно регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения. Подобные модуляторы активности гуанилатциклазы не только способствовали бы выяснению физиологической значимости этого фермента, но и, что не менее существенно, могли бы использоваться в качестве терапевтических средств [9].
Наиболее известными лекарственными средствами, которые долгие годы используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний: стенокардии, тяжелых форм гипертонии, комплексного лечения инфаркта миокарда и сердечной недостаточности и связанных с недостаточностью образования эндогенного оксида азота, являются органические нитраты (нитроглицерин, изосорбитдинитрат и др.) [9]. Однако механизм действия этих соединений был установлен только в конце 70-х годов, когда было обнаружено, что в результате их метаболизма образуется оксид азота, активирующий растворимую гуанилатциклазу, что приводит к накоплению цГМФ. Последний активирует цГМФ-зависимые протеинкиназы, а также кальций-зависимую АТФазу, участвующих в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу ионов кальция из мышечных волокон и в конечном итоге к вазодилятации. Несмотря на накопленное к настоящему времени достаточно большое число активаторов гуанилатциклазы, относящихся к донорам оксида азота, поиск новых соединений, которые могли бы избирательно стимулировать активность этого фермента, продолжается. В то же
время, в последние годы, стали высказываться предположения, что использование лекарств, аналогичных органическим нитратам и другим донорам оксида азота, может стать проблематичным. Во-первых, это связано с феноменом толерантности, развивающимся при продолжительном применении нитратов. Механизм, лежащий в основе этой толерантности, остается невыясненным, но он может быть связан со сниженной метаболической активностью этих соединений [10]; с избыточным уровнем синтеза ряда эндогенных веществ, регулирующих тонус и состояние сосудистой стенки (эндотелина, ангиотензина 2, супероксид радикала и т.д.) в ответ на лечение [11]; или со снижением чувствительности растворимой гуанилатциклазы к оксиду азота [12]. Во-вторых, при использовании подобных соединений in vivo возможно высвобождение из них оксида азота, его свободная диффузия, прямое взаимодействие с другими молекулами и образованием токсических веществ. В связи с этим поиск соединений, способных активировать гуанилатциклазу по NO-независимому механизму, представлял бы значительный интерес и мог способствовать появлению новых эффективных лекарственных средств.
Таким соединением оказался YC-1 (3-(5'-оксиметил-2'-фурил)-1-бензил индазол) который является не только NO-независимым активатором фермента, но и усиливает активацию фермента донорами оксида азота [13]. В присутствии YC-1 и донора оксида азота наблюдается (в зависимости от концентрации соединений) аддитивная или синергичная активация фермента. Этот эффект имеет большое фармакотерапевтическое и физиологическое значение. Использование соединений, аналогичных по своему действию YC-1, позволило бы значительно снижать дозы нитровазодилятаторов без снижения эффективности их лечебного действия. Это в свою очередь снизило бы возникновение нежелательных побочных эффектов, в том числе и толерантность при их длительном применении. В последнее время обращается особое внимание на возможность существования эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC—1.
Известно, что YC-1 усиливает NO-зависимую активацию гуанилатциклазы и при физиологических концентрациях оксида азота и таким образом повьшіает эффективность эндогенного N0 в проявлении своих физиологических эффектов. В связи с этим выявление эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC-1, заслуживает особого внимания. Однако данные о них пока отсутствуют.
Цель исследования
Выявление, изучение и анализ соединений, способных усиливать активацию растворимой гуанилатциклазы NO-донорами.
Задачи исследования
Были изучены следующие группы соединений:
Производные протопорфирина IX: (2,4-ди-(1-метоксиэтил)-дейтеропорфирин IX) - димегин и гематопорфирин.
Полиамины (путресцин, спермидин, спермин)
3. Производные изатина (эндогенного индола): 5-нитроизатин и арбидол
(противовирусный препарат)
4. Лекарственные средства: антибиотики - левомицетин и тетрациклин, и
противовирусный препарат - оксолин.
Обзор литературы
Субъединичная структура и изоформы растворимой гуанилатциклазы
Растворимая гуанилатциклаза - это гетеродимер, состоящий из двух иммунологически различных субъединиц - большей а и меньшей, связывающей гем, р-субъединицы. Простетической группой фермента является гем. Именно гем отвечает за чувствительность фермента к N0 [23,24]. Гем-дефицитная гуанилатциклаза не может активироваться оксидом азота [25] до тех пор пока гем не будет введен в молекулу фермента. Гем-реконструированная гуанилатциклаза активируется N0 [26]. Другая характерная черта фермента - это наличие на его поверхности лабильных SH групп. Последние легко окисляются различными эндогенными и экзогенными окислителями и способствуют активации фермента [18]. Кислород воздуха, свободные радикалы, ненасыщенные жирные кислоты, их гидроперекиси активируют фермент. В то же время высокие концентрации окислителей или их длительное воздействие — его ингибируют.
Каждая субъединица содержит N-концевой регуляторный домен и С-концевой каталитический домен [6]. Анализ растворимой гуанилатциклазы из различных тканей демонстрирует существование множества изотипов фермента с различными комбинациями субъединиц. Наиболее распространенные субъединицы al (82 кДа у крыс или 73 кДа - бык) и pi (70 кДа), которые находятся в большинстве тканей, впервые были выделены из легких крысы и быка [6]. Экспрессируемые отдельно al или pi субъединицы не проявляют каталитической активности, тогда как ко-экспрессия этих субъединиц приводит к образованию гуанилатциклазы, которая проявляет базальную активность и может быть активирована донором оксида азота [27]. р2 субъединица (76 кДа), выделенная из почки крысы, содержит 86 добавочных аминокислотных остатков в С-концевом регионе по сравнению с pi субъединицей [28]. Подобные изменения в структуре Р2 субъединицы необходимы по-видимому, для локализации растворимой гуанилатциклазы на мембране клетки. Р2 субъединица наиболее распространена в почках и печени. Р2 субъединица может также образовывать гетеродимер с al субъединицей; этот холофермент проявляет низкий уровень ферментативной активности в сравнении с al/pi гетеродимером [29]. Так, стимуляция донором оксида азота гетеродимера al/ pi (в линиях клеток COS - 7) приводит к образованию цГМФ в количестве в 3 раза большем по сравнению с гетеродимером al/ р2 [30]. Ко-экспрессия р2 - субъединицы с гетеродимером al/ pi уменьшает образование последнего, что указывает на конкуренцию между pi и р2 субъединицами за связывание с al субъединицей. Этот факт может служить в пользу гипотезы о том, что экспрессия Р2 субъединицы необходима для регуляции активности растворимой гуанилатциклазы (гетеродимера al/ pi) [6]. Вдобавок, экспрессия Р2 субъединицы может играть роль в патогенезе гипертензии у крыс [30].
Существуют четыре субъединицы растворимой гуанилатциклазы человека: al, a2, pi, р2. Из них образуются гетеродимеры; наиболее изученными являются al/ pi и a2/ pi [31, 32]. С 619-го аминокислотного остатка р субъединицы начинается эволюционно-консервативный КШ-концевой гем-связывающий домен, длина которого составляет около 200 остатков [33,34]. а2 субъединица (82 кДа), выделенная из эмбрионального мозга человека образует гетеродимеры с pi и р2 субъединицами, но имеет меньшую чувствительность к pi. Гетеродимер а2/ pi проявляет более низкую ферментативную активность, чем al/ pi гетеродимер.
В легких человека были найдены две формы pi субъединицы растворимой гуанилатциклазы: HSGC-1 и HSGC-2 [35]. Изотип pi субъединицы- HSGC-1 идентичен малой субъединице из легких крыс и быка, тогда как HSGC-2 изотип содержит делецию в тридцать три аминокислоты. Две другие субъединицы растворимой гуанилатциклазы - аЗ (82 кДа) и рЗ (70 кДа) были выделены из мозга взрослого человека. Между аЗ и рз субъединицами имеется высокая степень гомологии С-концевых регионов (72% гомологии между 310-ю аминокислотными остатками). Наличие регионов гомологии может говорить в пользу существования единого предшественника для этих субъединиц [36].
Были идентифицированы подтипы и других субъединиц растворимой
гуанилатциклазы. Так, в различных клеточных линиях и тканях была найдена ферментативно неактивная субъединица а2, так называемая a2i, содержащая дополнительные 31 аминокислоту в каталитическом регионе после глутамина 612 [37]. Этот вариант a2 (a2i) был обнаружен с использованием праймеров для ПЦР, основанных на постоянных (консервативных) последовательностях в каталитическом домене растворимой гуанилатциклазы млекопитающих [6]. Субъединица a2i продуцируется путем альтернативного сплайсинга РНК, когда добавляется тридцать одна аминокислота к каталитическому домену, и данный участок становится гомологичен региону внутри каталитического домена аденилатциклазы (АЦ). Предыдущие исследования показали, что растворимая гуанилатциклаза может катализировать реакцию превращения АТФ в цАМФ [6]. Наличие региона гомологии в a2i субъединице к АЦ, повышает чувствительность этой изоформы к утилизации АТФ в качестве субстрата и получению цАМФ [6]. Однако ко-экспрессия a2i с pi - субъединицей в клетках линии Sf 9, приводила к потере способности растворимой гуанилатциклазы образовывать цАМФ [6]. Вдобавок, Sf 9 клетки, трансфецированные с а2і/рі гетеродимером, содержали растворимую гуанилатциклазу, лишенную способности синтезировать цГМФ, тогда как ко-экспрессия нормальной а2 с pi субъединицей приводила к появлению ферментативной активности в этих клетках. Все вышесказанное говорит о том, что a2i субъединица может конкурировать с а2 субъединицей за связывание с pi, и играть, таким образом, роль фактора, ингибирующего активность фермента [6]. То есть экспрессия a2i субъединицы может рассматриваться как механизм регулирования активности фермента в специфических клетках. Кроме того, были найдены два более коротких транскрипта для al субъединицы, не содержащие сайтов инициации трансляции, и их экспрессия коррелировала с низким уровнем ферментативной активности [6].
Новые изоформы растворимой гуанилатциклазы, которые не требуют образования гетеродимера для проявления ферментативной активности, были выделены из нервной системы табачного улиточного червя Manduca Sexta. Эта новая изоформа растворимой гуанилатциклазы, Ms - рЗ, проявляет высокую степень гомологии с pi субъединицей крыс и содержит дополнительные 315 аминокислот в С-конце, которые не гомологичны ни одной из известных изоформ фермента [38]. Изотип Ms - рЗ не содержит консервативных последовательностей, характерных для других видов растворимой гуанилатциклазы и необходимых для активации фермента с помощью оксида азота. Однако как все известные циклазы, изотип Ms - рЗ (в виде свободной субъединицы) проявляет высокую ферментативную активность в присутствии ионов магния и марганца (кофакторов фермента) [б]. Вдобавок к изотипу Ms - РЗ из цитозоля клеток нервной системы червя Manduca Sexta был изолирован другой новый класс растворимых гуанилатциклаз.
Структурные особенности субъединиц фермента
Эта часть субъединиц растворимой гуанилатциклазы наименее консервативная и показывает низкую гомологию между изоформами фермента, поэтому различные виды гуанилатциклазы сравнивают по центральному и каталитическому доменам. Несмотря на различия в первичной структуре, данный домен имеет большое значение для связывания гема с ферментом, и именно связывание гема с ферментом приводит к образованию холофермента, высокочувствительного к оксиду азота. Рекомбинантная и нативная растворимая гуанилатциклаза, очищенная из различных источников, содержала один моль гема в гетеродимере, отсюда высказывалось предположение, что гем просто зажат между двумя субъединицами, и вклад каждой из них в прототип al/pl невозможно однозначно определить [41]. Появившиеся в одно время данные о наличии двух молекул гема на одну молекулу белка, пока не подтвердились и не получили дальнейшего развития. После этого последовали серии экспериментов, в которых изучалось влияние делеции (усечения) части N-концевого региона каждой из субъединиц на способность гетеродимера связывать гем. Таким образом, удалось выявить вклад каждой из субъединиц в связывании гема и установить какие аминокислотные последовательности играют наибольшую роль в этом процессе.
Так, в одном из экспериментов наблюдали, что гетеродимеры al/pi, образуемые из измененных усеченных субъединиц al (отсутствовали первые 131 аминокислотный остаток) и усеченных pi (отсутствовали первые 64 аминокислотных остатка), могли связать гораздо меньшее количество гема нежели полноцепочечные гетеродимеры [42]. Основываясь на этих данных, было высказано предположение, что для процесса связывания гема требуется наличие целого (неповрежденного) N-конца обеих субъединиц [6]. Однако впоследствии другими исследователями было обнаружено, что делеция первых 259 аминокислотных остатка al субъединицы человека никак не влияет на связывание гема с ферментом и на чувствительность фермента к оксиду азота. Кроме того, аминоконцевая часть pi (аминокислотные остатки 1 — 385), экспрессируемая в клетках E.coli, образует домен, способный самостоятельно связывать гем; поэтому pi субъединица считается первично связывающей гем [43]. Поэтому, несмотря на то, что обе субъединицы необходимы для проявления стимулированной донорами оксида азота активности, ведущую роль в этих процессах играет именно pi субъединица (предполагая участие al субъединицы в процессах координации гема) [6]. Наиболее важная роль в связывании гема отводится следующим аминокислотным остаткам pi субъединицы: Cys 78, Cys 214 и His 105 [б].
Простетическая гемовая часть фермента, наиболее чувствительная к оксиду азота, расположена в гем-связывающем домене р субъединицы. Гем связывается с белком путем образования нековалетной связи железа гема с осевым лигандом - имидазолом His 105. Пропионовые остатки гема связываются с другими якорными остатками: Tyr-135, Ser-137, Arg-139 [44]. Точечная мутация His 105 р субъединицы на Phe разрушает связь гема с белком и рекомбинантная гуанилатциклаза теряет способность к активации оксидом азота, сохраняя базальную каталитическую активность. Мутация двух цистеиновых остатков (Cys-78 и Cys-214), расположенных в р-субъединице в непосредственной близости от His 105, участвующего в связывании гема, приводит к образованию рекомбинантного белка, нечувствительного к оксиду азота [44].
Гем представляет собой пятикоординационное азот-содержащее кольцо, в котором четыре атома азота координированы с центральным атомом железа, находящимся либо в окисленном либо восстановленном состоянии. Именно за счет формирования осевых связей между имидазольным кольцом гистидина 105 р субъединицы и пятикоординациоонным кольцом гема, становится возможным образование холофермента растворимой гуанилатциклазы [6]. Замена гистидина 105 в pi субъединице на фенилаланин, аланин или глицин, приводит к тому, что фермент становится гемдефицитным [45-46]. Более того, при замене гистидина 105 на фенилаланин в pi субъединице, в случае одновременной ко-экспрессии с al субъединицей, происходит образование каталитически активного гетеродимера фермента, не чувствительного к оксиду азота. Замена гистидина 105 на цистеин приводит к образованию фермента, проявляющего высокий уровень базальной активности, но также как и в предыдущем случае, не чувствительному к оксиду азота [47]. Замена других консервативных гистидинов не влияет на способность фермента связывать гем [6]. Помимо этого, для координации гемовой группы при взаимодействии с ферментом, необходимо наличие аминокислотных остатков цистеина (дополнительно к гистидину 105). Участие Cys 78 и Cys 214 pi субъединицы в связывании гема было показано за счет низкого гем-связывающего аффинитета для субъединиц с заменой C78S и C214S [6]. Эти данные согласуются с важностью присутствия цистеиновых остатков и в других гем-содержащих белках. Так в цитохроме С гем ковалентно связан с белком через тиоэфирные связи с двумя цистеиновыми остатками, подтверждая предположение о том, что гем в растворимой гуанилатциклазе также может быть связан с ферментом через цистеиновые остатки р субъединицы. Замена соответствующих аминокислотных остатков в al субъединице не изменяла чувствительности фермента к оксиду азота [6].
Ряд статей указывает на тот факт, что другие аминокислоты, такие как тирозин 135 и аргинин субъединицы также могут являться необходимыми для связывания гемовых фрагментов и активации фермента за счет оксида азота [48]. Кроме того, эти аминокислотные остатки могут играть решающую роль в действии таких активаторов, как BAY-58-2667. Когда BAY-58-2667 представлен в высоких концентрациях, его карбоксильные группы конкурируют с аналогичными группировками гема за аминокислотные остатки тирозин 135 и аргинин 139, что является причиной вытеснения гема и высвобождения гем-связывающей аминокислоты гистидина 105; эти изменения немедленно приводят к изменению конформации фермента и его активации [40].
Механизм взаимодействия оксида азота с растворимой гуанилатциклазой
Усилия многих ученых во всем мире были направлены на синтез соединений, которые могли бы быть донорами оксида азота при введении в живой организм и таким образом оказаться эффективными в борьбе с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Задача синтеза новых доноров оксида азота и выявление среди них активаторов гуанилатциклазы представлялась перспективной для решения одной из наиболее фундаментальных проблем современной биологической и медицинской химии -направленному поиску и синтезу эффективных антигипертензивных препаратов.
К основным физиологическим эффектам оксида азота, непосредственно связанным с функционированием растворимой гуанилатциклазы, относят его вазодилатирующее действие на сосуды и способность угнетать агрегацию тромбоцитов.
Сосудорасширяющее действие оксида азота связано с активацией гуанилатциклазы и накоплением цГМФ [5]. Накапливающийся цГМФ активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу, участвующую в дефосфорилировании легких цепей миозина, а также кальций-зависимую АТФазу саркоплазматического ретикулума, что приводит к выходу ионов кальция из цитозоля клетки в эндоплазматический ретикулум и способствует расслаблению мышечных клеток эндотелия. В конечном итоге, подобные изменения метаболизма гладкомышечных клеток приводят к расширению сосуда [5].
Известно, что оксид азота и нитропруссид натрия ингибируют агрегацию тромбоцитов. Этот ингибирующий эффект связывали со способностью этих соединений активировать растворимую гуанилатциклазу [5]. Считается, что гуанилатциклаза регулирует агрегацию по механизму обратной связи: инициация агрегации способствует активации фермента, а накапливающийся цГМФ опосредует сигнал к дезагрегации. Другими словами, функционирование тромбоцитарной гуанилатциклазы и агрегантная способность тромбоцитов взаимосвязаны. Действительно, при сравнении функционирования тромбоцитарной гуанилатциклазы больных сахарным диабетом (обоих типов), характеризующихся повышенной способностью к агрегации, и в тромбоцитах здоровых доноров, у первых было отмечено снижение базальной активности гуанилатциклазы и способности фермента к активации [5]. При этом, чем выше была способность тромбоцитов к агрегации, тем больше были снижены базальная активность гуанилатциклазы и ее способность к активации [5]. Следует заметить, что снижение параметров гуанилатциклазы связано не с этиологией диабета, а лишь с нарушением в системе гомеостаза.
Таким образом, гуанилатциклазу можно рассматривать как защитный механизм на пути развития агрегации. В этой связи направленная активация гуанилатциклазы оксидом азота и его донорами, может быть использована для ослабления патологически увеличенной способности тромбоцитов к агрегации и снижать таким образом риск развития сосудистых осложнений [5].
Исследование роли оксида азота при различных патологических состояниях показало, что нарушения синтеза N0 в организме связаны не только с недостатком его образования, но и гиперпродукцией. Такие заболевания, как астма, другие воспалительные процессы в дыхательных путях, сепсис, септический шок, характеризуются резким усилением образования оксида азота и для нормализации N0 и устранения возникших при этом нарушений необходимо торможение NO-зависимой активации гуаиилатциклазы.
Следует отметить, что в отличие от целого арсенала новых доноров оксида азота, усиливающих активность гуаиилатциклазы, препараты, которые бы ингибировали N0-зависимую активацию фермента, практически отсутствуют.
Итак, нарушение синтеза оксида азота в организме и метаболические последствия изменений активности сигнальной системы N0- растворимая гуанилатциклаза-цГМФ могут играть значительную роль в этиологии различных патологических состояний.
Поэтому, агенты, способные модулировать активность гуаиилатциклазы селективным образом должны обладать значительным терапевтическим потенциалом, а, возможно, могут быть использованны с лечебными целями.
Клиницисты широко используют в качестве лекарственных средств органические нитраты и другие NO-доноры или "нитровазодилататоры" - которые высвобождают оксид азота для активации растворимой гуаиилатциклазы. Однако в последние годы использование подобных препаратов представляется проблематичным. Это связано с развитием толерантности к этим лекарственным средствам при их длительном применении, о которой уже упоминалось в разделе "Введение". Кроме того, использование NO-доноров чревато осложнениями, связанными с неспецифическим взаимодействием N0 с другими биологическими молекулами. Эти реакции трудно контролировать, благодаря спонтанному высвобождению оксида азота из нитровазодилататоров и его свободной диффузии в биологических системах. Согласно
современным представлениям предпочтительное (физиологическое) действие оксида азота — это активация растворимой гуанилатциклазы (т.е. цГМФ - зависимое); вредное же (патологическое) действие N0 проявляется в основном через прямое взаимодействие (цГМФ - независимое). Последнее связано с модификацией белков (нитрозилирование, нитрование) липидов (перекисное окисление), нуклеиновых кислот. Таким образом, использование терапевтических средств, связанных с высвобождением оксида азота — это всегда обоюдоострый меч, т.е. возможность развития событий в двух противоположных направлениях. В связи с этим, соединения, которые могут активировать гуанилатциклазу по NO-независимому механизму, не вызывающему развития толерантности, представляли бы значительные преимущества в качестве лекарственных средств. Таким соединением оказалось производное бензил индазола YC-1 или 3-(5 -оксиметил-2 -фурил)-1-бензил индазол. YC-1 - новый NO-независимый активатор гуанилатциклазы, обладает гипотензивным и антиагрегантным действием [52,53,54]. Соединение не генерирует N0 и активирует гуанилатциклазу независимо от оксида азота [55,56].
Иммуно ферментный анализ
Следует отметить, что димегин и ГП не влияют на активацию фермента YC-1. Из табл.1 видно, что при инкубации гуанилатциклазы в присутствии 3,0 мкМ YC-1 и 5,0 мкМ димегина (или 5,0 мкМ ГП) найденная активность не отличается от арифметической суммы активностей фермента, стимулированных каждым из агентов по отдельности. Отличия составляют всего +3 и -3 % в опытах с димегином и ГП соответственно (табл.1), т.е. димегин и ГП действуют на фермент независимо от YC-1. Таким образом, димегин (5,0 мкМ) и ГП (5,0 мкМ) вызывают синергичную активацию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия (10,0 мкМ), не влияют на активацию фермента YC-1 (3,0 мкМ) и не изменяют синергичного усиления стимулированной нитропруссидом натрия (10,0 мкМ) активности гуанилатциклазы в присутствии YC-1 (3,0 мкМ).
В отличие от синергичного действия YC-1 на активацию фермента нитропруссидом натрия эффекты YC-1 (3,0 мкМ) и ПП (5,0 мкМ) при совместном инкубировании с гуанилатциклазой аддитивны (табл.2).
Та же аддитивность наблюдается и при инкубации фермента в присутствии 10,0 мкМ нитропруссида натрия и 5,0 мкМ ПП (табл.2). В то же время активация гуанилатциклазы ПП в присутствии 5,0 мкМ димегина (или 5,0 мкМ ГП) тормозится на 33 ±2 % (или 30 ± 2 %).
Недавно выяснилось, что сигнальная система NO - растворимая гуанилатциклаза — цГМФ, выполняющая важные функции в центральной нервной системе, в процессах вазодилятации и гемостаза, участвует в регуляции пролиферативных процессов в клетке. Было показано, что аллостерический активатор растворимой гуанилатциклазы YC-1 3-(5 -оксиметил-2 -фурил)-1-бензил индазол и 8-бром-цГМФ (проникающий в клетки аналог цГМФ) защищают клетки от апоптических стимулов, а, следовательно, и их гибели [85]. С другой стороны, ингибитор растворимой гуанилатциклазы ODQ (1-Н[1,2,4] оксадиазоло[4,3-а]хиноксалин-1) вызывает значительное усиление каспазной активности, ассоциирующейся с потерей жизнеспособности клеток, снижением в них уровня цГМФ [85]. Метиленовый синий (хорошо известный ингибитор NO-зависимой активации гуанилатциклазы) ингибирует рост лейкемических клеток линии L-1210 и Р388. Более того, было показано, что уровень цГМФ в плазме нелеченых больных раком значительно выше, чем у здоровых людей, и он нормализуется при ремиссии [86].
Другими словами, увеличение уровня цГМФ может способствовать развитию пролиферативных процессов в клетке. Действительно, в литературе имеется достаточное количество литературных данных, указывающих на определенную роль цГМФ в пролиферативных процессах в клетке [85;87-89]. Известно, что важную роль в процессах роста и деления клеток приписывают и полиаминам, которые, как было показано ранее [90], активировали растворимую гуанилатциклазу в культурах клеток сердца и повышали уровень цГМФ. Эти данные дают основание предположить участие сигнальной системы N0 - растворимая гуанилатциклаза - цГМФ в пролиферативных процессах в клетке и вовлечение этой системы в реализацию эффектов полиаминов. Поскольку специфические биологические функции полиаминов в процессах роста и деления клеток пока не установлены, была исследована возможность влияния полиаминов (путресцина, спермина, спермидина) на активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека и на стимуляцию фермента NO-донором (нитропруссидом натрия) и N0-независимым аллостерическим активатором гуанилатциклазы YC-1.
Путресцин, спермидин, спермин (100 мкМ) повышали базальную активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека на 20, 91 и 61 % соответственно (см. табл.3). В концентрации ЮмкМ эти полиамины были менее активны. Путресцин, спермидин, спермин (в концентрации 100 мкМ) потенцировали стимуляцию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия. Из данных таблицы видно, что при инкубации гуанилатциклазы с 10 мкМ нитропруссидом натрия без и в присутствии (по отдельности) путресцина, спермидина или спермина величины стимулированных активностей составляли 465±38, 485±34, 756±52, 528±32 пмоль цГМФ/мг белка/мин, соответственно. При этом арифметические суммы двух активностей фермента, стимулированных (по отдельности) нитропруссидом натрия (10 мкМ) и каждым из использованных полиаминов (путресцином, спермидином или спермином, по 10 мкМ) составляли 485 ±35, 556 ±39, 526 ± 37 пмоль цГМФ/мг белка/мин, соответственно. Эти данные показывают, что стимулирующие эффекты нитропруссида натрия и путресцина (или спермина) были аддитивны, а спермидин синергично усиливал аддитивный эффект до 136 %, т.е. полиамины и нитропруссид натрия действовали независимо на два разных участка фермента. Все использованные полиамины тормозили активацию гуанилатциклазы YC-1. Из таблицы 3. видно, что при инкубации фермента с YC-1 (ЗмкМ) без полиаминов и в присутствии путресцина, спермидина или спермина стимулированные активности гуанилатциклазы равнялись 111±8, 84 ±5, 93 ±6 и 91± 5 пмоль цГМФ/мг белка/мин, соответственно. Арифметические же суммы двух активностей фермента, стимулированных (по отдельности) YC-1 (3 мкМ) и каждым из полиаминов (путресцином, спермидином или спермином, по 100 мкМ) составляли 131 ± 10, 202 ± 14, 172 ± 13 пмоль цГМФ/мг белка/мин, соответственно, т.е. путресцин, спермидин и спермин тормозили активацию гуанилатциклазы YC-1 на 36 %, 54 % и 47 %, соответственно.