Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из основных классов растительных гормонов являются цитокинины - низкомолекулярные химические соединения. Ци-токинины совместно с ауксинами индуцируют деление клеток, активируют рост листьев и дифференцировку в них хлоропластов, задерживают старение листьев, индуцируют побегообразование, а также принимают участие в регуляции транспорта веществ по растению и в его антистрессовых реакциях (Кулаева, 1987). Цитокинины обнаружены практически во всех растениях и частях растений. Наиболее распространенными и активными цитокининами являются тракс-зеа-тин и его производные (Кулаева, 1973, 1987; Skoog and Shmitz, 1979). Значительный научный и практический интерес представляет то, как такие простые по химическому строению вещества могут осуществлять регуляцию разнообразных процессов, происходящих на уровне отдельной клетки и на уровне ткани, органа и растения в целом. Механизмы рецепции и передачи гормонального сигнала в растении нуждаются в подробных исследованиях.
В этой связи очень важно изучение цитокинин-связывающих белков (ЦСБ), которые и должны определять все разнообразие действия цитокининов на растение. До сих пор не ясно, выполняют цитокинины эти разнообразные функции посредством одного или нескольких разных рецепторов.
В литературе описано множество ЦСБ, выделенных из разных растений (Brinegar, 1994), однако функциональная роль этих белков оставалась неустановленной. В настоящее время в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН ведутся комплексные исследования ЦСБ из злаков - ячменя и кукурузы. Выделены в чистом виде и охарактеризованы ЦСБ с молекулярной массой 67 кД из зрелых листьев ячменя (ЦСБ-67) (Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995; Kulaeva et al., 1996; Karavaiko et al., 1996) и ЦСБ с молекулярной массой 70 кД из этиолированных проростков кукурузы (ЦСБ-70) (Бровко и др., 1996; Karavaiko et al., 1996). Доказана рецепторная роль этих белков и выдвинуто предположение, что они являются представителями одного семейства высокого-мологичньгх белков - рецепторов цитокининов (Karavaiko et al., 1996).
Продолжить структурно-функциональные исследования ЦСБ, окончательно прояснить механизм передачи цитокининового сигнала в растении можно будет только после установления первичной структуры этих белков. На пути к этой цели современная молекулярная биология располагает очень мощным инстру-
ментом, а именно, иммунохимическими исследованиями рецепторних белков помощью моноклональных антител (МЛ). МА вырабатываются к отдельны небольшим участкам молекулы белка-антигена (эпитопам), представленны несколькими аминокислотными остатками, и поэтому являются высокоспец фичными реагентами. С помощью МА можно получить гомогенные препарат белков-антигенов, пригодные для структурных исследований, отыскать гомол гичный или аналогичные белки в других объектах, установить клеточную и тк невую локализацию рецепторного белка, определить аминокислотную последов тельность, отвечающую за связывание рецептором гормона, а также провес много других важных и весьма интересных исследований.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было получение М против ЦСБ-70 из кукурузы, характеристика этих антител и их применение д иммунохимических исследований ЦСБ. В соответствии с этим работа состояла следующих этапов:
-
Получение гибридом, продуцирующих высокоспецифичные антите. против ЦСБ-70. Эта часть работы включала иммунизацию животных, тест рование антисывороток в ходе иммунизации, слияние иммунных спленоцит мыши с клетками плазмацитомы, тестирование получаемых гибридом, і клонирование и реклонирование, получение асцитных жидкостей мышей.
-
Характеристика МА, которая включала очистку МА и контроль * чества получаемых препаратов, определение классов и подклассов МА, ко стант аффинности. Кроме того, проводили определение специфичности N/ по отношению к ЦСБ-70 методом иммуноблоттинга, эпитопный анал ЦСБ-70 и определение функциональной активности полученных МА и фрагментов.
Ш.Иммунохимические исследования ЦСБ с помощью МА включали рг работку метода выделения ЦСБ-70 с использованием иммуноаффинной хр матографии, создание тест-системы (сэндвич-ИФА) для обнаружения ЦСБ-в грубых растительных экстрактах, а также иммунохимическое обнаружен ЦСБ в других растениях.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получ набор гибридом, продуцирующих МА к ЦСБ-70, проведена характеристика эт антител, определены константы связывания, класс и подкласс. Обнаруже функциональная активность МА в тесте активации транскрипции рецепторні белком (in vitro). Проведено эпитопное картирование молекулы ЦСБ-70.
Разработана схема очистки ЦСБ-70 с помощью иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных МА. Разработана тест-система (сэндвич-ИФА) обнаружения ЦСБ-70 в грубом растительном экстракте. Показано иммунохими-ческое родство ЦСБ из кукурузы, ячменя, пшеницы и овса.
Полученные экспериментальные данные явились независимым подтверждением существования в злаках семейства близкородственных белков - рецепторов цитокинина. Панель МА против ЦСБ-70, а также методические подходы, разработанные в ходе выполнения работы, в частности, система обнаружения ЦСБ в грубых растительных экстрактах, характеристика антител по влиянию на рецепторную функцию белков, могут быть с успехом применены при дальнейшем изучении молекулярных механизмов передачи цитокининового сигнала в растительной клетке. Таким образом, результаты представленной работы имеют несомненное фундаментальное значение.
Апробация полученных данных. Результаты настоящего исследования были неоднократно доложены на рабочих конференциях в рамках научной программы, финансируемой INTAS (13 февраля 1995 г., Цущино; 18 марта 1996 г., Москва; 6 февраля 1997 г., Москва), на 10-м конгрессе европейского общества физиологов растений (Флоренция, Италия, сентябрь 1996 г.), Вторых чтениях, посвященных памяти акад. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 18 ноября 1996 г.), 1-й и 2-й Открытых городских конференциях молодых ученых г. Пущино (Пущино, май 1996 г., апрель 1997 г.).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 6-ти печатных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит их введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 139 наименований. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 5 таблиц.