Введение к работе
Актуальность проблемы. С открытием полинуклеотидфосфорилази - фермента, катализирующего поликонденсациіо рибонуклеозидди--фосфатов, появилась возможность получения высокомолекулярных полирибонуклеотидов различного состава. Синтетические полинук-леотиды интересовали исследователей как модельные соединения, с помощью которых можно получить информацию о различиях структуры ДНК и РНК, они использовались в расшифровке генетического кода и в изучении биосинтеза белка.
Открытие в 1967 году интерфероногешшх и противовирусных свойств у двунитевого полирибонуклеотидного комплекса по-лиСИ) -полиШ) ознаменовало новый поворот в исследовании комплексов синтетических комплементарных полирибонуклеотидов. Стали разрабатываться новые методы синтеза полирибонуклеотидов, изучаться условия комплексообразования, структурные особенности, необходимые для проявления интерферон-индуцирующей активности. Целью всех этих исследований является создание наиболее активных и наименее токсичных индукторов интерферона.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в выделении и очистке интерферонов, а также в их получении с помощью методов генной инженерии, продолжает оставаться актуальным использование индуктороЕ интерферона, вызывающих образование в организме эндогенного (собственного) интерферона. Отчасти это связано с недостатками экзогенного интерферона. Введенный в орг яизм, он быстро гидролизуется. Поэтому высокую концентрацию интерферона в организме удержать неьолможно, а Сольшие дозы вводить опасно из-за его токсических эффектов.
Кроме того, интерферон является чисто терапевтическим средством применение которого необходимо в острой фазе заболевания, особенно в случае опасности для жизни больного. Индукторы же незаменимы для профилактической защиты организма от возможной инфекции, в том числе в тех случаях, когда тип вируса, представляющего потенциальную опасность, еще точно не определен. Такая профилактическая подготовка к встрече надвигающейся инфекции может осуществляться г. течение достаточно большого срока, охватывать большие людские контингенти, и при этом она может быть выполнена при умеренных финансовых затратах.
Очень важно также, что, кроме интерферон-индуцирующей и противовирусной, двунитевые полирибонуклеотидные комплексы обладают также имунностимулирующей, противоопухолевой и радиопротекторной активностями.
Наконец, исследование полирибонуклеотидных комплексов как индукторов интерферона остается актуальным и в теоретическом плане, т.к. изучение их структурных особенностей необходимо для расшифровки молекулярных механизмов их взаимодействия с чувствительными клетками и выработки этого защитного регуляторного белка.
Основные задачи работы
-
Изучение ферментативного синтеза полирибонуклеотидных сополимеров различного состава, предназначенных для исследования структуры комплексов и целенаправленного получения новых типов противовирусных препаратов.
-
Изучение синтеза комплекса поли(Г)*поли(Ц) при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы, его исследование и доказательство его максимальной структурной упорядоченности и возможности применения в качестве стандарта при анализе дефектов структуры полирибонуклеотидных индукторов интерферона.
-
Исследование чувствительности перспективных для клинического применения полирибонуклеотидных индукторов интерферона различного происхождения к рибонуклеазам человеческой крови и оптимизация способов их защиты.
Научная новизна работы
Впервые изучены закономерности синтеза ряда сополимеров -нуклеотидных модификаций гомополимера поли(Ц) с помощью поли-нуклеотидфосфорилазы из термофильного микрорганизма Thermus thermophilic.
Впервые проведено подробное сравнительное изучение гомогенного и гетерогенного синтеза с определением нуклеотидного состава сополимера поли(Ц,У), синтезируемого как растворимыми, так и иммобилизованными полинуклеотидфосфорилазами из мезофиль-кых (Е. coli) и термофильных (Т. thor:r.ophllus) бактерий.
Впервые при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы был получен комплекс поли(Г)-поли(Ц), который превосходил по активности в культуре клеток комплекс поли(И) -поли(Ц), а также исследована
его структура, доказаны упорядоченность и-возможность использования его з качестве стандарта при структурных исследованиях.
Впервые было: а) проведено исследование стабильности природных индукторов интерферона двунитевых РНК - ларифана и ри-достина к действию нуклеаа крови человека; б) доказано, что КМЦ с полилизином не препятствует у них проявлению интерферон-индуцирующей активности, а обеспечивает значительную защиту от нук-леаз крови; в) показано, что только полигуацил не нуждается в защите от нуклеаз крови человека; г) установлено, что наибольший защитный эффект обеспечивает полидиаин с молекулярным весом 12300.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в докладах на научных семинарах лаборатории биополимеров и Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 146 работ.