Введение к работе
Актуальность проблемы
Молекулярные механизмы регуляции процесса клеточной пролиферации и роста исследуют с помощью самых различных подходов и очень интенсивно (Дж.Дингл, 1980; Н.К.Бердинских.С.П.Залеток, 1987; Т.А.Короленко, 1990; K.Nishioka, 1996). Тем не менее, на данный момент многое в этой центральной проблеме современной биологин и медицины остается до конца не изученным. В частности, это касается возможности влиять на этот процесс опосредованно через лизосомную и полиаминовую системы. Поэтому разработка такого подхода стала целью настоящего исследования
В целом, данная работа базируется на концепциях, разрабатываемых академиками Т.Т.Березовым и В.А.Фроловым.- Так, в течение последних двух десятилетий на кафедре патологической физиологии под руководством В.А.Фролова изучается роль лизосом в инициации процессов клеточной репарации, регенерации и гипертрофии тканей. Хорошо известны также представления, развиваемые Т.Т.Березовым, о биологическом значении снижения или полной утрате клетками опухоли ряда регуляторных функций ферментов азотистого обмена вообще и обмена аминокислот, в частности.
Выбор лизосом и полиаминов (ПА) в качестве объекта исследований был обусловлен также следующими обстоятельствами. Так, индукция ор-нитиндекарбоксилазы (ОДК) - ключевого фермента синтеза ПА, оказалась одним из самых ранних молекулярных проявлений активирования метаболизма клеток, готовящихся к делению, росту и дифференцировке. Более того, окисленные до иминоальдегидов ПА ингибировали рост асцитного рака Эрлиха, инактивировали вирус гриппа и вирус болезни Newcastla и Sendai, подавляя синтез белка и нуклеиновых кислот. Существует тесная взаимосвязь между синтезом ПА и процессами роста и дифференцировки злокачественных клеток, поскольку рост и пролиферация обеспечиваются высоким уровнем синтеза ПА, а переход клеток от пролиферации к дифференциации сопровождается снижением активности ОДК и внутриклеточной концентрации ПА. Общая направленность катаболизма азотистых веществ в сторону ослабления в пролиферирующих клетках (Т.Т.Березов, 1969) позволяет предположить, что в клетках опухолей два промежуточных процесса (усиленный синтез и ослабление катаболизма) направлены на поддержание высокой внутриклеточной концентрации ПА, которая необходима для быстрого роста и пролиферации опухолевых клеток (С.П.Ся-ткин, Т.Т.Березов, 1982). Однако молекулярные механизмы и значение изменений активности ферментов обмена ПА в опухолевых клетках для процессов пролиферации и дифференцировки в настоящее время полностью
еще не раскрыты и нуждаются в детальном исследовании.
Гидролитические ферменты лизосом также вовлекаются в плейоти-пический механизм индукции и регуляции пролиферации клеток. В низких концентрациях эти ферменты играют роль митогенных факторов. Лизосо-мотропные агенты, увеличивающие проницаемость лизосомных мембран способны стимулировать клеточную пролиферацию. При стабилизации лизосомных мембран тормозится синтез ДНК и митотическая активность. Лизосомотропные амины ингибируют процесс митогенеза, индуцированный факторами роста. Предполагают, что ПА служат модуляторами мембранной текучести. Опосредованно через регуляцию плавления мембран ПА ,влияют, вероятно, на процессы клеточного роста и деления. Уменьшение концентрации ПА в клетках, приостанавливает деление и приводит к накоплению большого количества вакуолей. При добавлении ПА в культураль-ную среду вакуоли исчезают и клетки возобновляют деление. Вероятно, существует взаимосвязь между плавлением мембран и содержанием ПА в клетке при стимуляции их деления. Таким образом, ПА и лизосомы вовлечены в процессы регуляции клеточной пролиферации и роста путем прямого или опосредованного влияния на скорость синтеза нуклеиновых кислот и белка. Однако взаимосвязь и характер взаимодействия между этими биогенными поликатионами и лизосомным аппаратом почти не изучены.
Не менее важным аспектом этой проблемы следует признать разработку методических подходов к химическому регулированию обмена ПА и состояния лизосом. Так, при применении индукторов дифференциации наблюдали снижение внутриклеточного содержания путресцина (Пут) и спе-рмидина (Сд). Дифференцировка в эритролейкозных клетках мышей, вызванная диметилсульфоксидом и гексаметиленбисацетамидом (индукторами этого процесса), развивается на фоне снижения внутриклеточной концентрации этих ПА при применении дифторметилорнитина (ДФМО). Таким образом, ингибиторы биосинтеза ПА вызывают дифференцировку опухолевых клеток, а также подавляют рост и вызывают экспрессию дифференцированных функций (иеланогенез) в растущих в культуре клетках меланомы мышей. Обработка культуры L 1210 аналогом Пут (2,5- диамино -3-гексином) вызывает быстрый, морфологически определяемый эффект вакуолизации, который возможно связан с ингибированием клеточного роста. Очевидно, что методология поиска и подходов разработки новых перспективных химиотерапевтических средств, обладающих направленным действием с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки, в частности обмена ПА и состояния лизосомного аппарата. Это позволит корректировать синтез и осуществлять конструирование новых противоопухолевых агентов.
Таким образом, данная работа проводилась на стыке двух биологических дисциплин: биохимий и патологической физиологии. Это определило специфику экспериментальных методов и подходов. Главной задачей было правильно выбрать ключевые показатели струкгурной целостности лизосом и обмена ПЛ и разработать высокочувствительный, специфические, но вместе с тем доступные для технического исполнения методы количественного анализа этих показателей. Отсутствие таких методов сильно затрудняло и делало недоступным исследование в этом направлении. Цель и задачи исследования
Целью данной работы была разработка принципов и методических подходов к химической регуляции, опосредованной через полиаминовую и лизосомную систему, процессов клеточной пролиферации и опухолего роста. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать новые и модифицировать известные в литературе экспериментальные методы количественного анализа основных компонентов обмена ПА и показателей структурной целостности изолированных лизосом.
-
Изучить прямое влияние физико-химических факторов, лежащих в основе формирования ряда патологических состояний организма, на структурную целостность изолированных лизосом.
-
Исследовать механизмы регуляции обмена ПА в тканях с высокой скоростью пролиферации.
-
Провести скрининг химических соединений органического синтеза (аналогов ПА) в качестве потенциальных антипролиферативных агентов в модельных бесклеточных тест-системах из тканей с высоким митотичес-ким индексом.
Научная новизна
Разработаны модификации высокочувствительных и специфических микрометодов количественного анализа активности ди- и полиаминокси-даз, орнитиндекарбоксилазы (ОДК) (спектрофотометрический и флуороме-трический), кислой фосфатазы, лизосомных гликозидаз (общая, доступная, латентная и неседиментируемая формы активности), концентрации ПА (путресцина, спермидина и спермина), белка (в пробах с повышенным содержанием липо- и гликопротеинов), структурной целостности изолированных лігіосом: спекгрофогометрический (осморезистентноеп», термотоле-рашность и кислотоустойчнвость) и ферментативный (показатели целостности и лабилизации лизосомных мембран), а также модельные тест-системы для оценки прямого действия химических соединений на состояние изолированных лизосом и скорость обмена ПА (бесклеточные и клеточные системы).
Показана возможность прямого лабилизируещего действия на лизо-
сомы физико-химических факторов внутриклеточной среды. Полученные результаты подтверждают предположение о роли лизосом как об одном из ключевых звеньев молекулярных механизмов формирования ряда патологических состояний организма человека и животных, в основе которых лежит генерализованная гипертермия (ожоговая болезнь, тепловое поражение) и гипотермия (консервация тканей, обморожение), а также изменение внутриклеточного рН (ишемия и реоксигенация органов, опухолевый рост) и осмотического давления (отравление лизосомотропными химическими соединениями, перегрузка лизосом осмофильными веществами, химический канцерогенез).
Ди- и ПА тормозят лизис лизосом, вызванный сочетанным действием t(50C), рН7.0 и ті (0.75МПа) инкубационной среды, оказывая протекторное действие на мембраны лизосом.
Механизмы регуляции уровней ПА в тканях при нормальной и «патологически» ускоренной пролиферации различны. Повышение концентрации ПА и их аккумуляция при опухолевом росте обусловлено не столько повышением скорости биосинтеза, как это имеет место при регенерации в печени, сколько угнетением распада этих поликатионов. Снижение скорости окислительного дезаминирования ПА при гепатоканцерогенезе, вероятнее всего, является первичным, в то время как повышение скорости декар-боксилирования можно рассматривать как результат дисдифференцировки трансформированных гепатоцитов. Ди- и полиаминоксидазы, регулируя уровни ПА в животном организме, могут оказывать прямое или опосредованное влияние на процесс усиленной клеточной пролиферации, в том числе на опухолевый рост. Активность же самих ферментов на ранних этапах печеночной малигнизации может регулироваться высокими концентрациями ПА (субстратное ингибирование) и недостатком витамина Вб (экстренный тип регуляции). В заключительную фазу злокачественного перерождения регуляция активности диаминоксидазы (ДАО) может осуществляться на генетическом уровне путем прекращения синтеза апофермента (хронический тип регуляции).
Выдвинуто предположение, что ПА способны оказывать прямое и опосредованное, в частности через лизосомы, регуляторное влияние на процессы клеточной регенерации, пролиферации и роста.
Разработана система показателей структурного состояния лизосом и обмена ПА для количественной оценки регуляторних, антипролифератив-ных свойств химических соединений. Исследованы 26 новых веществ органического синтеза и два известных ингибитора биосинтеза ПА [дифтор-метилорнитин и метилглиоксальбис(гуанилгидразон)]. Разработанные тест-системы проявили высокую степень чувствительности к действию этих ингибиторов так же, как и L-клетки. Воздействие тестируемых веществ на
скорость синтеза Пут и ПА в системах из регенерирующей и опухолевой ткани различалось по эффективности и носило избирательный характер. Это указывает на разбалансированность з опухолевой ткани процесса поэтапного синтеза ПА и, вероятно, обусловлено изменениями в структуре и каталитических свойствах полиаминсинтезирующих ферментов. Высокая антипролиферативная активность тестируемых веществ была связана с такими особенностями их структуры, как наличие терминальной ОН-группы, длина алифатической цепи, присутствие остатков урацила.
Изменения в содержании ПА предшествовало моменту появления первичных гепатом при гепатоканцерогенезе, а также торможению скорости роста опухолевых L- и CaOv клеток в культуре ткани под действием ингибиторов синтеза ПА. Это подтверждает предположение о первичности изменений в обмене ПА в отношении процесса неопластической трансформации тканей.
Теоретическая ценность работы
Сформулировано.приоритетное направление по изучению направленного воздействия на состояние лизосом и обмен ПА с помощью химических соединений с целью регуляции процессов клеточной репарации, регенерации, пролиферации и роста.
Результаты скрининга химических соединений на разработанных модельных тест-системах для оценки их действия на состояние лизосом и обмен ПА могут служить теоретической базой для разработки критериев целенаправленного синтеза веществ, наделенных дротивоопухолевой активностью.
Практическая ценность работы
По результатам работы получены 12 авторских свидетельств и два акта внедрения изобретений. Высказано предположение о целесообразности применения ПАО в энзимотерапии опухолей. Положительный эффект при этом будет обусловлен устранением эссенциальных (т.е. ПА) факторов роста и образованием веществ с цитостатическим действием: иминоальде-гиды и Н2О2. Определение активности ДАО и ПАО может иметь диагностическое значение при оценке степени неопластической трансформации ткани. ПА участвуют в реализации антипролиферативного действия ДФМО и МГБГ и могут служить биохимическими маркерами эффективности такого действия для новых канцеростатиков. Показано, что потенциальные индукторы дифференцировки и (или) ингибиторы роста опухолевых клеток должны быть одновременно наделены способностью существенно снижать как суммарное содержание ди- и полиаминов, так и отношение Сд/См и уровень Сд до критического уровня (70%). Из числа исследованных соединений этим требованиям в большей степени удовлетворяли вещества 769 и 1694 из группы инденопиридинов, I, IV и V из числа алифа-
тических оксиамино-аналогов и бис(урацилил)-алкилдиамины (VII, VIII и IX). Последние три вещества были существенно эффективнее ДФМО. Это позволяет рекомендовать их для дальнейшего фармакологического исследования в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов.
Корреляционный анализ связи проявляемой активности тестируемых веществ в клеточной и бесклеточной тест-системах служит обоснованием возможности использования бесклеточных тест-систем вместо культуры ткани опухолевых клеток для первичного отбора и прогнозирования малотоксичных веществ с антипролиферативными свойствами. Это позволит существенно съэкономить время, трудовые и материальные ресурсы и повысит производительность труда.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработано приоритетное направление по изучению принципов химической регуляции, опосредованной через лизосомную и полиаминовую системы, процессов клеточной пролиферации и роста с помощью оригинальных количественных показателей состояния лизосом и обмена ПА на фоне действия потенциальных канцеростатиков.
-
Исследования термотолерантности, осморезистентности и кислотоустойчивое суспензии изолированных лизосом показали возможность прямого регуляторного действия физико-химических факторов внутриклеточной среды (tC, я и рН) на структурную целостность лизосом и, следовательно, возможность влияния на патогенез заболеваний, у которых реализация действия патогенетических факторов связана с участием лизосомного аппарата, в частности, при опухолевом росте и химическом канцерогенезе.
-
ПА в диапазоне физиологических значений концентраций оказывают регуляторное.действие на структурное состояние лизосом и, вероятно, могут служить центральным звеном в реализации регуляторных воздействий опосредованно через лизосомы в тканях с усиленной клеточной пролиферацией (регенерирующей, малигнизирующей, опухолевой), в которых уровни ПА специфически повышены.
-
Регуляция уровней ПА в тканях с контролируемым процессом клеточной пролиферации (репарация, регенерация) осуществляется за счет по-лиамин-синтезирующих ферментов, а в тканях с бесконтрольным клеточным делением и ростом (опухолевые) за счет ферментов окислительного дезаминирования (ДАО и ПАО).
-
Разработанные модельные тест-системы проявили достаточную чувствительность для проведения количественной оценки регуляторных свойств химических соединений и позволили выявить из числа исследованных веществ соединения с сильными свойствами как активаторов, так и ингибиторов процесса клеточной пролиферации. В частности, бис(урацил-ил)-алкилдиамины действовали как потенциальные индукторы дифферен-
цировки и ингибиторы роста опухолевых клеток и превосходили по эффективности известные канцеростатики: дифторметилорнитин и метилглиок-саль-бис(гуанилгидразон).
Связь исследований с научной программой
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований следующих научных программ. Комплексная научно-техническая программа ГКНТ «Разработка эффективных методов воздействия на молекулярные структуры лизосомных мембран различных типов клеток животных и человека», шифр 0.74.05, № 300008. Программа «Каталитические и биологические свойства ферментов катаболизма аминокислот (лизин, орнитин, метионин, глутамин, аспарагин) как основа для разработки противоопухолевых агентов», № 305008. Проект № 4-62 «Химические основы регуляции биокаталитических процессов метаболизма аминокислот в нормальной и опухолевой клетке» по приоритетному направлению ГКНТ «Инженерная энзимология». Всесоюзная программа по разработке новых противоопухолевых препаратов по направлению «Поиск новых мишений для химиотерапии злокачественных новообразований, направленный синтез и выделение из природных источников новых противоопухолевых веществ с биологическим тестированием».
Апробация работы
Отдельные фрагменты диссертационной работы были представлены для обсуждения на семинарах, совещаниях, конференциях, съездах и симпозиумах: Всесоюзный симпозиум «Энзимологические исследования при некоторых патологических процессах» (Волгоград, 1977), Всесоюзный Симпозиум «Регуляция активности генов и ферментов нормальных и опухолевых клеток» (Москва, 1979), Межвузовская конференция молодых ученых «Механизмы клеточной и функциональной регуляции» (Москва, 1979), XI Международный биохимический конгресс (Торонто, Канада, 1979), Всесоюзный симпозиум (Псков, 1980), 6-й Объединенный симпозиум биохимических обществ ГДР и СССР (Таллин, 1981), Международная конференция по полиаминам (Будапешт, Венгрия, 1984), Третий Всесоюзный симпозиум с международным участием «Структура и функции лизо-сом» (Москва, 1986), V Всесоюзная научная конференция «Проблемы и перспективы ферментного катализа» (Москва, 1987), 1-й Международный конгресс «Терапия аминокислотами и их аналогами» (Вена, Австрия, 1989), 6-й Европейский симпозиум по органической химии (Белград, Югославия, 1989), 15-й Международный раковый конгресс (Гамбург, ФРГ, 1990), XIV Международный конгресс по клинической химии (Сан-Франциско, США, 1990), Всесоюзный симпозиум «Биохимия опухолевой клетки» (Минск, 1990), Международная конференция «Современная энзимология: проблемы и перспективы» (Санкт-Петербург, 1992), 2-я Всероссийская на-
учная конференция «Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии» (Нальчик, 1994), 9-й Съезд по витамину Вб и карбонильному катализу и 3-й Съезд по PQQ и хинопротеинам (Капри, Италия, 1994), XVI Международный раковый конгресс (Нью-Дели, Индия, 1994), 4-й Международный конгресс по аминокислотам (Вена, Австрия, 1995), 23-й Съезд ФЭБС (Базел, Швейцария, 1995), Всероссийская научная конференция «Фундаментальные основы жизнедеятельности организма в норме и патологии» (Москва, 1996), Российско-Германский симпозиум «Патология висцеральной регуляции и тканевого роста» (Москва, Россия, 1996), 9-й Международный симпозиум. Новые лекарства в раковой терапии (Амстердам, Голландия, 1996), 2-й Съезд биохимического общества Российской академии наук (Москва, 1997), 5-й Международный конгресс по аминокислотам (Греция 1997).
Внедрение результатов исследования
Представления об особенностях и принципах регуляции обмена ПА в тканях с усиленной клеточной пролиферацией включены в курс лекций академика Т.Т.Березова по международной программе Сороса. Метод определения активности орнитиндекарбоксилазы из тканей животных используют в Киевском НИИ онкологии МЗ Украины в научных исследованиях по изучению особенностей обмена ПА в нефробластомах и злокачественных лимфомах у детей. Метод определения лизиноксидазы применяют в отделе физико-химической энзимологии НПО «Фермент».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 69 работ, в том числе получено 12 авторских свидетельств на изобретения.
Объем и структура диссертации
Дисертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа изложена на страницах текста, содер-
жит таблиц и рисунков. Список литературы включает источников,
из них на иностранных языках. v. г..