Введение к работе
Актуальность проблемы. Бурное развитие научных и научно- прикладных направлений иммунологии и молекулярной биологии коренным образом изменило методологические подходы в разработке диагиостикумов и вакцин нового поколения. К
середине 1980-х годов новые идеи в иммунодиагностике и иммунопрофилактике были
>1' і
подготовлены прогрессом в изучении элементарных единиц иммунологической активности, «—о привело к материализации антигенной детерминанты, или эпитопа, как простейшей структуры, определяющей иммунологические свойства белка. Развитие новых подходов к предупреждению инфекционных болезней, изучение механизмов иммунологической защиты животных и взаимоотношений между различными клетками иммунной системы неразрывно связаны с разработкой и внедрением новых методов и технологий, в основе которых лежат современные, представления об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимают отношения в системе антиген-антитело (Р.В.Петров, 1982, 1988; Э.Я.Грен, П.П.Пумен, 1988; и др.).
Для проведения разноплановых исследований необходим выбор одной из двух форм антительных реагентов: поликлональные антисыворотки или моноклональные антитела (МкА). Препараты и тех и других получают различными путями с различной целью; выбор между ними осуществляется не произвольно, а в большей степени зависит от соответствия специфичности антител требованиям теста.
При своей ценности использование антисывороток в иммунологических тестах 'ограничено. Поликлональные антитела образуются в результате функционирования многочисленных клеточных клонов и, следовательно, гетерогенны на самых разных уровнях: по изотипу, специфичности, активности и аффинности. Поэтому, их очистка до той степени .специфичности, которая необходима для вьивления отдельных структур и антигенных различий между молекулами на уровне индивидуального эпитопа, представляется практически невозможной задачей (Д.Кэтти, 1991; U.Bruderer et зі., 1992).
Разработанный Келлером и Милыптейном (1975) метод получения гибридом, продуцирующих моноюгональные антитела заданной специфичности, открыл новую эру в биологической науке. С тех пор моноклональные антитела завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента исследований в молекулярной биологии, генетике, медицине и ветеринарии. Гибридомная биотехнология является примером не только очень быстрого внедрения науки в практику, но и продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований, причем на качественно новом уровне.
Особая ценность МкА предопределяет их использование для проведения исследований различных антигенов, где их. чувствительность и специфичность способствуют решению множествапроблем, которые не могут быть решены с помощью поликяональных реагентов. Являясь реагентами направленного действия, моноклональные антитела позволяют идентифицировать отдельные эпитопы в сложных композициях антигенных структур, способны значительно упростить многие тесты и значительно расширить число тестируемых молекул (В.Ф.Фукс с соавт., 1982; С.С.Шишкин, 1997; C.Horn et al„ 1996; J. W.Goding, 1996; G.Kertesz et al., 1997 и др.).
В настоящее время современные методы иммунохимического анализа, основанные на применении как поли- так и моноклоналышх антител, широко используются в диагностике инфекционных и паразитарных болезней, онкологической, сердечно-сосудистой и другой патологии (А.М.Егоров, 1988; А.М.Егоров и др., 1991; Г.М.Раткер, 1996; J.P.Gosling, 1990; W.E.Lee et al, 1993; J..Kwang et al.. 1995; H.Zola et al., 1995; D.P.Stites et al., 1997 и др.). Как в медицине, так и в ветеринарии, особая роль при этом отводится углубленной, характеристике иммунного статуса здоровых и больных людей и животных (В.В.Новиков, 1994; Р.В.Петров с соавт. 197; J.K.Lunney, 1984; LJ.Gershwin et al., 1995; I.R.Tizard, 1996 и др.)ч
Анализ гуморальных факторов иммунного ответа играет важную рольв диагностике
иммунологической недостаточности и напрямую связан с определением количественных
соотношений иммуноглобулинов и распределением изотип/субизотип- специфических
антител в биологических жидкостях организма (КШ.Федоров, 1984; Л.Ф. Мерингова с
соавт., 1997; J.Madic-et al., 1995; P.Lind et al., 1997 и др.). Несмотря на то, что за последние
годы сделаны значительные успехи в изучении иммуноглобулинов, остаются недостаточно
рассмотренными вопросы, связанные с определением роли различных изотипов/
субизотипов Ig при многих иммунодефицитных. состояниях, изучением эпитопной структуры Ig и их субьеданиа, нммунохимической природы специфических антител и их функциональных свойств у многих видов животных. В связи с этим, возникает необходимость разработки разноплановых диагностических тест- систем на основе поли- и моноклональных антител для оценки состояния гуморального звена иммунитета, иммунодиагностики и эпитопного картирования субьединиц Ig's, что представляет значительный интерес не только в прикладных аспектах, но и для фундаментальной науки в целом.
Цель работы. Анализ гуморального иммунного ответа на основе оценки изотип-/субизотип- специфического распределения антител и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях свиней и собак на примере ряда
болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также при,. определении антигенных и иммунногенных свойств вакцинных препаратов. Изучение и характеристика эпитопов иммуноглобулинов свиньи я некоторых других видов животных и человека. Основные задачи исследований.
-
Унифицировать методы выделения, очистки и идентификации различных изотипов иммуноглобулинов животных и их структурных субъединиц.
-
Получить панель поли- и моноклональных антител к различным изотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак. Дать иммунохимическую характеристику полученным и имеющимся в нашем распоряжении антителам и испытать их в качестве иммунодиагностических реагентов.
-
Разработать и внедрить в ветеринарную практику тест- системы на основе различных вариантов ИФА и РИД с использованием поли- и моноклональных антител для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов различных изотипов в биологических жидкостях организма животных,
-
Изучить общие (межвидовые) эпитопы иммуноглобулинов животных и человека, провести исследования по эпатопному картированию -,1- цепи IgGl свиньи и детально охарактеризовать специфичность формирующих ее эпитопов.
5. Провести анализ распределения в гуморальном иммунном ответе изотип-
специфических антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГС) в секретах
молочных желез супоросных свиноматок после иммунизации , .ассоциированной вакциной
против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной инфекции и колибактериоза, а
также изучить их роль в формировании лактогенного иммунитета у новорожденных.
6. Провести количественную оценку уровня IgG, IgM н IgA в сыворотке крови собак
,, при демодекозе, дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии в сравнении с
показателями уровня иммуноглобулинов у здоровых животных.
7. Используя поли- и монокяональные антитела к основным, структурным белкам
аденовируса собак 1 серотипа (CAV-1), сконструировать диагностические иммунофермент-
ные тест- системы, предназначенные для одновременной детекции гексона CAV-1 и антител
к нему и с их помощью изучить взаимосвязь в цепи вирус- гуморальный иммунный ответ.
Научная новизна работы. Получены и охарактеризованы монрклональные антитела к IgG, IgGl, IgM, slgA, к- и Х- легким цепям Ig свиньи, а также охарактеризованы _МкА, направленные к различным изотипам Ig крупного рогатого скота и человека. На гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к IgG, IgM и легким цепям Ig свиньи получены
Патенты РФ: № 2093572 «Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L., используемый для получения моноклональных антител к L-цепям иммуноглобулинов свиньи»; № 2093573 «Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L., .используемый для получения моноклональных антител к IgM свиньи» и №2093574 «Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG свиньи» от 20 октября 1997 г.
ч, , С использованием полученных и охарактеризованных поли- и моноклональных .. антител к различным изотипам/субизотипам и легким цепям иммуноглобулинов свиньи и собак разработано девять диагностических тест- систем на основе различных вариантов „ИФА и РИД
Впервые проведено эпитопное картирование yl- цепи IgGl свиньи и детально охарактеризована специфичность семи ее эпитопов.
Показана принципиальная возможность использования моноклональных антител к межвидовым эпитопам иммуноглобулинов или их структурных субъединиц для разработки разноплановых иммунохимических методов (различные варианты ИФА и РИД) по выявлению специфических антител и/или количественному определению уровня Ig в биологических жидкостях организма нескольких видов животных и человека.
Впервые изучена роль антител, содержащих различные типы легких цепей, в формировании иммунитета слизистых при трансмиссивном гастроэнтерите свиней и проведен анализ .распределения Ig's (к)- и Ig's (X)- антител в иммунном ответе к ВТГС.
Получень1,.гибридомы, продуцирующие моноклоналыше антитела к основным структурным белкам CAV-1 и на основе МкА разработаны тест- системы с использованием различных .вариантрв ИФА для диагностики, инфекционного гепатита плотоядных и изучения гуморальных факторов иммуногенез.а,,при данном заболевании. На «Штамм гибридных клетрк Mus,musculus„L.,, продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса собаки первого, серотипа (СAV-1) получен Патент РФ,№ 2095411 от 10 ноября 1997 г.
Получены новые данные по количественной характеристике IgG, IgM и IgA в сыворотке крови собак при различных формах демодекоза и дерматитах неинфекционной и непаразитарной этиологии.
Практическая значимость исследований. Материалы исследований по получению,
характеристике и использованию поли- и моноклональных антител к различным изотипам Ig
''' ''ft,
, животных вошлив нормативно-техническую документацию (НТД) на:
«Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в
биологических жидкостях свиней методом радиальной иммунодиффузии» ТУ № 9388-
0038-00008064-96; Временное наставление по применению № 13-7-2/618. Утв.
Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96.;
«Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в
биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной
иммунодиффузии» ТУ № 9388-0039-00008064-96; Временное наста'вление по
применению № 13-7-2/617. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от127.05-.. ч'"
На примере ряда болезней инфекционной и неинфекционной этиологии, а также "при
определении антигенных и иммунногенньгх свойств вакцинных препаратов, 'показана
возможность использования препаратов поли- и моноклонаЛьных антител - для
иммунодиагностики и оценки изотип-/субизотип- специфического распредїлйния'іантител "
и/или количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических Жидкостях *
организма животных. ' ОлЧ
Результаты научных исследований использованы при оформлении НТД и выпуске коммерческих иммунотерапевтическях и иммуномодулирующего препаратов:1-
«Сьгеоротка против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных гипериммунная» ТУ № 08064-19-66-95; Наставление по применению № 13-4-2/405. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от 28.09.95.;,
«Гамма- глобулин (иммуноглобулин) против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных» ТУ № 9382-08-11472788-96; Временное наставление!по .применению № 13-4« 2/739. Утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ от \6Д8,%.; ! Hnrir -л-,' ил,
«Препарат "Рнботан" для регуляции иммунной- системы, организма j животных
(иммуномодуяятор)» ТУ №,9365-082-95; Временное наставление,.по--применению №13-
4-2/496. Утв. Департаментом ветеринаршШСХиП РФ от 28.12.95^-' .--, f
Положения, выносимые на ^защиту. Полученные «экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: -,;;;,, і -'.-от ''~'
* Получение, кммунохимическая характеристика поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам животных и их использование в качестве иммунодиагяостических реагентов в разработанных тест- системах на основе различных вариантов ИФА и РИД;
* Определение роли изотипов, субизотипов, к- и к- цепей иммуноглобулинов в
формировании гуморального иммунного ответа на иммуногены различной
природы у свиней и собак;
* Характеристика эпитопов иммуноглобулинов и их структурных субъединиц.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:
Пленарном заседании секции «Биохимия сельскохозяйственных животных»
Московского отделения Всесоюзного Биохимического общества АН СССР, 1991 г.;
« Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии (С.-Петербург, Пушкин, 1994 г.);
4 Международном симпозиуме по ветеринарной иммунологии (Дэвис, США, 1995 г.);
9 Международном конгрессе по иммунологии (Сан-Франциско, США, 1995 г.);
Европейской uncqjie по иммунологии (Прага, Чехия, 1995 г.);
Заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (Москва, 1995 г.); ;
Итоговом годичном собрании Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (Москва, 1996 г.); . „.,„,.
Углубленном курсе и симпозиуме по иммунологии (Пекин, Китай, 1996 г.);
Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ..1998 г.
Результаты по отдельным разделам работы были рассмотрены и опубликованы в материалах 3 Международного., симпозиума^по ветеринарной иммунологии (Будапешт, Венгрия, 1993 г.); 8 Международного і .симпозиума по, ветеринарной лабораторной диагностике. (Иерусалим, Израиль; :і1996т.)^,1. Конгресса Федерации иммунологов стран Азии-Океании (Аделаида, Австралия, ,1996 г.); 13 Европейского симпозиума по иммунологии (Амстердам, Нидерланды, 1997 г.); 4 Конгресса по ветеринарной вирусологии (Эдинбург, Шотландия, 1997 г.), а также в,материалах международных симпозиумов и конференций, проводимых в России и странах СНГ (1990- 1997 гг-)-
По теме диссертации опубликовано 49 научных работ.. ..
Объем и структура диесертации. Диссертационная работа изложена на 258 страницах машинописного текста и состоит из , введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Материалы
диссертации иллюстрированы 57 рисунками и 27 таблицами. Список литературы включает 334 источника (56 отечественных и 278 зарубежных авторов).
В работе использован комплекс методов исследовании: физико-химические, методы гибридомной технологии, иммунологические и иммунохимические.
Физико- химические методы включали в себя комплекс хроматографических методов (гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобная и тиофильная хроматография), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы и CsCl, аналитический и препаративный электрофорез в ПААГ- ДСН, электроэлюцию белков,* определение концентрации белка по Лоурк, а также синтез иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА.
Методы гибридомной технологии использованы для получения моноклональных антител заданной специфичности и включали в себя иммунизацию мышей линия BALB/c, слияние клеток с помощью полиэтиленгликоля, скрининг гибридом на продукцию МкА, клонирование и реклонирование клеточных культур, получение асцитических жидкостей и выделение МкА из мышиных асцитов.
К иммунологическим отнесены методы получения поликлоналышх антисывороток к выделенным антигенам с использованием кроликов и овец в качестве животных-продуцентов. В процессе выполнения работы получены, охарактеризованы и использованы: моноспецифические антисыворотхи к IgG свиньи, IgG мыши, IgG и IgA собак; полиспецифические антисыворотки ко всем белкам сыворотки крови и молозива свиней и собак.
Иммунохимические методы использованы для очистки МкА, определения активности и специфичности полученных поли- и моноклональных реагентов, а также для разработки разноплановых диагностических тест- систем с их использованием и проведения комплекса научных исследований по оценке гуморального иммунного ответа животных в норме и при патологии, а также эпитопному картированию IgG свиньи.
Они включали в себя: иммуноблоттинг (ИБ), иммуноэлектрофорез (ИЭФ), все основные варианты твердофазного ИФА (прямой, непрямой, конкурентный и «сэндвич»), дот- блот ИФА, реакции двойной иммунодиффузяи по Оухтерлони (РДП), радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД), торможения гемагглютинации , (РТГА) и нейтрализации (РН).
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с
использованием программы Excel для Windows. .