Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Антиоксидантная система организма при острой алкогольной интоксикации .13
1.1.1 Окислительный стресс при острой алкогольной интоксикации .13
1.1.2 Система глутатиона при острой алкогольной интоксикации 19
1.1.3 Белки, витамины и гормоны антиоксиданты при острой алкогольной интоксикации 29
1.1.4 Показатели минерального обмена при острой алкогольной интоксикации 31
1.2 Антиоксиданты в коррекции острых отравлений этанолом 35
Глава 2. Материалы и методы исследования .39
2.1 Объекты исследования .39
2.2 Биохимические методы исследования 42
2.3 Статистические методы исследования 56
Глава 3. Показатели минерального обмена при острой алкогольной интоксикации .57
3.1 Показатели минерального обмена в плазме периферической крови при остром отравлении этанолом интактных животных 57
3.2 Показатели минерального обмена в плазме периферической крови крыс при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации 63
3.3 Показатели минерального обмена в плазме периферической крови людей при остром отравлении этанолом 70
Глава 4. Показатели антиоксидантной защиты при острой алкогольной интоксикации 79
4.1 Показатели антиоксидантной защиты в периферической крови крыс при остром отравлении этанолом интактных животных 79
4.2 Показатели антиоксидантной защиты в периферической крови крыс при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации 91
4.3 Показатели антиоксидантной защиты в периферической крови людей при остром отравлении этанолом 111
Заключение 121
Выводы 129
Практические рекомендации 130
Список сокращений .131
Список литературы
- Окислительный стресс при острой алкогольной интоксикации
- Антиоксиданты в коррекции острых отравлений этанолом
- Статистические методы исследования
- Показатели антиоксидантной защиты в периферической крови крыс при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Количество острых алкогольных отравлений в Российской Федерации ежегодно возрастает, сохраняется высокая инвалидизация больных Ковалев А.В., Гасимова З.М. и др. Токсикологическая помощь населению Российской Федерации: состояние и проблемы. Токсикологический вестник. 2014. №3. С.2-8; Клиническая токсикология / Е.А. Лужников, Г.Н. Суходолова. М.: 2008. 576 с.). Показатель смертности от отравлений этиловым спиртом и его суррогатами в России является одним из самых высоких в мире. Среди госпитализированных с острыми алкогольными отравлениями 90% - больные хроническим алкоголизмом (Острые отравления этанолом и его суррогатами / Ю.Ю. Бонитенко [и др.]; СПб.: «ЭЛБИ-СПб», 2005. 224 с.).
Окислительному стрессу принадлежит ведущая роль в формировании
цитотоксических эффектов этанола (Долго-Сабуров В.Б., Петров А.Н., Беляев В.А. О роли
окислительного стресса в формировании цитотоксических эффектов этанола.
Токсикологический вестник. 2011. №1. С.6–10; Панченко Л.Ф., Давыдов Б.В., Теребилина Н.Н. и др. 2013. № С.452-458). Изучение свободно-адиальных процессов служит источником ценной информации о ходе адаптивных реакций (Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л., Цейликман В.Э. Челябинск: Изд-во Челябинского гос. пед. ун-та, 2000. 167 с.). Показатели антиоксидантной защиты являются чувствительными к действию этанола, так при острой алкогольной интоксикации в плазме крови возрастает содержание церулоплазмина (Орбиданс А.Г., Терехин Г.А., Владимирский Е.В., Терехина Н.А. Экспериментальное обоснование использования энтеросорбентов при остром отравлении этанолом. 2009. № 4. С.29-30), а при алкоголизме концентрация церулоплазмина в сыворотке крови больных снижается (Ващенко В.И., Ващенко Т.Н. Биология и фармакология церулоплазмина: от эксперимента до лекарственной терапии. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2008. Т.6. №1. С.31-44). Особое место в антиоксидантной защите организма занимает система глутатиона, которая является естественной цитопротекторной системой в условиях острых интоксикаций (Глушков С.И., Куценко С.А. Система глутатиона как естественная цитопротекторная система в условиях острых интоксикаций. Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты. Спб.: ООО «Издательство Фолиант». 2004. С.67-68). Уровень восстановленного глутатиона увеличивается при острой алкогольной интоксикации в эритроцитах крови подростков (Щеглова Е.Л., Высокогорский В.Е., Долгих В.Т., Титов Д.С. Показатели системы глутатиона в крови подростков, злоупотребляющих алкоголем. Наркология. 2015. №8. С.41-44), снижается - в крови больных алкоголизмом (Высокогорский В.Е., Ефременко Е.С., Быков Д.Е. и др. Нарушение обмена глутатиона при алкоголизме. Омский научный вестник.
-
№1. С.9-12). При острой интоксикации этанолом в плазме крови увеличивается активность аминотрансфераз В.В., Васильев С.А. и др. Фармакологическая коррекция токсических поражений печени у больных с тяжелыми формами острых отравлений этанолом. Экспериментальная и клиническая фармакология.
-
Т.75, № С.30-33), возрастает активность лейцинаминопептидазы (Орбиданс А.Г., Терехин Г.А., Терехина Н.А. Сравнительный анализ антитоксической активности сорбентов при острых отравлениях этанолом и метанолом. Материалы V международной научно-практической конференции «Фармация и общественное здоровье». Екатеринбург. 2012. С.49-51), в печени снижается содержание гликогена (Акимов П.А., Орбиданс А.Г., Терехин Г.А., Терехина Н.А. Влияние острой алкогольной интоксикации на содержание гликогена в печени и скелетных мышцах. 2010. №2. С.15-17).
Хроническое поражение органов и систем из-за длительного употребления этанола значительно отягощает течение, влияя на исход острого отравления этанолом А.Н., СВ. и др. Метаболические нарушения у больных с острыми отравлениями этанолом на фоне хронического алкоголизма и пути их фармакологической коррекции. 2015. Т.115. №4-2. С.64-68). Высокая концентрация меди наблюдается в крови при хронических панкреатитах алкогольной этиологии (Girish B.N., Vaidyanathan К., Rajesh G. et al. Effects of micronutrient statuson oxidative stress and exocrine pancreatic function in patients with chronic pancreatitis. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 2012. Vol.49. P.386-391). В сыворотке крови больных хроническим алкоголизмом повышается содержание мукопротеинов, сиаловых кислот, С-реактивного белка, а 1-антитрипсина, al-кислого гликопротеина, ферритина и снижается уровень трансферрина (Высокогорский В.Е., Арзамасова О.А., Лукина Н.Ю. и др. Гликопротеины сыворотки крови у больных алкоголизмом. 2012. Т.11. № С.33-38). При хронической алкогольной интоксикации в тканях печени крыс снижается содержание цинка, меди и магния (Задорожня, В.Ю., Єщенко Ю.В., Бовт В.Д. и др. Зміни вмісту цинку і магнію в клітинах та позаклітинному просторі внаслідок алкоголізації. Вісник Запорізького національного університету. 2010. №2. С.63-70), в крови и печени достоверно увеличивается содержание малонового диальдегида, гидроперекисей, активность гаммаглутамилтранспептидазы, уменьшается содержание восстановленного глутатиона (Гетте И.Ф., Каминская Л.А., Данилова И.Г. Глутатион и глутамат - протекторы процессов перекисного окисления липидов при алкогольной интоксикации. Биоантиоксидант: тезисы докладов VI международной конференции. М., 2002. С.109-111), снижается активность глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, увеличивается активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Аллекрад Х., Л.Ф. и др. Влияние тиоктовой кислоты и мелатонина на глутатионовую антиоксидантную систему и активность некоторых НАДФН-генерирующих ферментов в печени и сыворотки крови крыс при хронической алкогольной интоксикации. Вопр. биол., мед. и фарм. химии. 2010. №2. С.20-23), в
эритроцитах крови больных уменьшается активность супероксиддисмутазы и
глутатионпероксидазы, в плазме крови снижается уровень цинка (Zima T., Kalousov M. Oxidative stress and signal transduction pathways in alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 2005. Vol.29. №11. Р.110-115). При алкоголизме, абстинентном синдроме (Мингазов А.Х., Кривулин Е.Н., Бабин К.А. и др. Гендерные особенности окислительной модификации белков плазмы крови больных алкоголизмом позднего возраста. Сибирский вестник психиатрии и наркологии. 2013. №3. С.9-13), алкогольном делирии (Перфильев П.Р., Виноградов Д.Б., Паначев И.В., Синицкий А.И. Особенности окислительного стресса и содержание кортизола в крови пациентов с абстинентным состоянием, осложненным развитием алкогольного делирия. Медицинская наука и образование Урала. 2014. Т.15. №4. С.115-117) в плазме крови увеличивается уровень карбонильных производных белков, при этом их уровень в плазме крови у пациентов с синдромом алкогольной зависимости выше, чем при острой алкогольной интоксикации (Захарова А.Н. Продукты окисления белков и липидов при острой алкогольной интоксикации и синдроме алкогольной зависимости. Медична психологія. 2014. №1. С.108-110).
Энтеросорбция доступный и перспективный метод эфферентной терапии. Экспериментально обосновано использование сорбентов при острых отравлениях этанолом, наиболее выраженным антитоксическим эффектом при этом обладает полисорб (Орбиданс А.Г., Терехин Г.А., Владимирский Е.В., Терехина Н.А. Экспериментальное обоснование использования энтеросорбентов при остром отравлении этанолом. 2009. № 4. С.29-30). Таким образом, актуальным остается исследование молекулярных механизмов реагирования организма на острое отравление этанолом и поиск при этом методов детоксикации.
Цель исследования - при острой алкогольной интоксикации в эритроцитах и плазме периферической крови изучить показатели минерального обмена, антиоксидантной защиты и оценить влияние на них сорбентов.
Задачи исследования
-
Изучить содержание глутатиона в эритроцитах, церулоплазмина и трансферрина в плазме крови людей и экспериментальных животных при острой алкогольной интоксикации.
-
Оценить показатели хемилюминесцентного анализа эритроцитов и плазмы периферической крови и окислительную модификацию белков эритроцитов при моделировании острого отравления этанолом интактных крыс и на фоне предварительной алкоголизации.
-
Определить содержание цинка, меди, железа, магния в плазме периферической крови людей и экспериментальных животных при острой алкогольной интоксикации.
-
Сравнить влияние сорбентов на активность ферментов холестаза при острой алкогольной интоксикации в плазме крови экспериментальных животных.
-
Оценить влияние сорбентов на показатели минерального обмена и антиоксидантной защиты в периферической крови при моделировании острого отравления этанолом интактных крыс и на фоне предварительной алкоголизации.
Методология и методы исследования
В работе использована научная методология, основанная на системном подходе с применением формально-логических, общенаучных и специфических методов. Для достижения цели и решения поставленных задач использовались биохимические и статистические методы. Все лабораторные исследования проведены на сертифицированном оборудовании. Использовались спектрофотометры СФ-46 (Россия), PD-303 (Япония) и биохемилюминометр БХЛ–07.
Работа включает как экспериментальное исследование на разных моделях острой алкогольной интоксикации на животных, так и исследование периферической крови больных людей. В эритроцитах и плазме периферической крови изучали показатели минерального обмена, антиоксидантной защиты. При острой алкогольной интоксикации проводили оценку влияния сорбентов на показатели минерального обмена и антиоксидантной защиты в крови экспериментальных животных. Все эксперименты проведены с учетом требований международных и российских законодательных актов о юридических и этических принципах исследований с использованием подопытных животных.
Организация исследования одобрена этическим комитетом ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России (протокол №5 от 28.05.2014).
Степень достоверности, апробация работы, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и практических рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и экспериментальных данных, использовании современных методов и применении статистического анализа материалов исследования с использованием пакета программ Microsoft Office 2007.
Основные положения работы представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Зубаировские чтения: новое в коагулологии» «Медицинская биохимия: достижения и перспективы» (Казань, 2015), XVIII форуме «Национальные дни лабораторной медицины России – 2014» (Москва, 2014), XIX форуме «Национальные дни лабораторной медицины России – 2015» (Москва, 2015), Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых специалистов с международным участием «Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева» (Рязань, 2016), научной сессии Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера (Пермь, 2014, 2015, 2017), Международном научном конгрессе, посвященном 100-летию Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера «Актуальные вопросы медицины – 21 век» (Пермь, 2016), V съезде биохимиков России (Сочи – Дагомыс, 2016). Предварительная экспертиза исследования проведена на совместном расширенном заседании кафедр ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России: кафедры биохимии, кафедры нормальной физиологии, кафедры патологической физиологии, кафедры фармакологии, центральной научно-исследовательской лаборатории и кафедр ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России: кафедры
биохимии, кафедры токсикологической химии, кафедры экстремальной медицины и товароведения (Пермь, 2017).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, цели и задач, определение общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем доктором медицинских наук, профессором Н.А. Терехиной. Лично диссертантом разработан дизайн исследования, проведен анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Все биохимические исследования проведены лично диссертантом в лаборатории кафедры биохимии ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России. Затравка и лечение животных, расчет необходимых доз этанола и сорбентов выполнены на базе токсикологической лаборатории ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России под руководством заведующего кафедрой экстремальной медицины и товароведения, профессора, доктора медицинских наук Г.А. Терехина. Выражаем отдельную благодарность заведующему отделением острых отравлений Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Пермского края «Медсанчасть №9 им. М.А. Тверье» М.К. Вишневецкому за консультативную помощь по выбору больных.
Статистическая обработка первичных данных, написание и оформление рукописи диссертации осуществлялась соискателем лично. Интерпретация и анализ полученных результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях, съездах проводились совместно с научным руководителем доктором медицинских наук, профессором Н.А. Терехиной.
Положения, выносимые на защиту
-
Антиоксиданты глутатион, церулоплазмин и трансферрин являются мишенью для действия этанола. Сорбенты полисорб, литовит и сапропель оказывают нормализующее влияние на показатели антиоксидантной защиты при острой алкогольной интоксикации.
-
В плазме крови экспериментальных животных при острой алкогольной интоксикации снижается содержание меди, железа и цинка. Двухнедельное введение литовита или сапропеля нормализует показатели минерального обмена.
-
Экспериментально обосновано использование сорбентов при острой алкогольной интоксикации. Двухнедельное введение полисорба, литовита или сапропеля при острой алкогольной интоксикации экспериментальных животных нормализует показатели хемилюминесцентного анализа эритроцитов и плазмы крови, содержание церулоплазмина и железа. Выявлены свойства энтеродоноросорбента у сапропеля. Введение литовита или сапропеля в течение двух недель при острой алкогольной интоксикации нормализует в эритроцитах содержание глутатиона, а в плазме крови содержание меди, железа и цинка.
Научная новизна
Впервые дана сравнительная оценка показателей антиоксидантной защиты (церулоплазмин, трансферрин, глутатион) и минерального обмена (медь, железо, магний, цинк) в эритроцитах и плазме крови при моделировании острой алкогольной интоксикации на интактных животных и на фоне предварительной алкоголизации. Установлено, что белки антиоксиданты церулоплазмин, трансферрин и трипептид глутатион являются мишенью для действия этанола. При остром отравлении этанолом в крови животных увеличивается содержание церулоплазмина и глутатиона, а содержание трансферрина снижается. При моделировании острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации повышается уровень церулоплазмина, снижается содержание глутатиона и трансферрина. В эритроцитах крови больных людей при острой алкогольной интоксикации снижается уровень глутатиона, в плазме крови уменьшается содержание церулоплазмина и трансферрина. При острой алкогольной интоксикации установлено увеличение уровня карбонильных производных белков эритроцитов крови людей и экспериментальных животных, что свидетельствует об усилении окислительной модификации белков.
Выявлено, что содержание меди, железа и цинка в плазме крови снижается как при острой интоксикации этанолом интактных животных, так и на фоне предварительной алкоголизации. При острой алкогольной интоксикации в плазме крови больных людей не установлено достоверных изменений содержания меди, железа, цинка и магния. Впервые разработан способ дифференциальной диагностики механической желтухи опухолевого генеза по содержанию меди в плазме крови больного.
Установлено нормализующее влияние полисорба, литовита и сапропеля на показатели
минерального обмена, антиоксидантной защиты организма и показатели
хемилюминесценции при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации животных. Выявлены свойства энтеродоноросорбента у сапропеля.
Теоретическая и практическая значимость работы
Показано, что мишенью для действия этанола являются антиоксиданты
церулоплазмин, трансферрин и глутатион. При острой алкогольной интоксикации
изменяются показатели минерального обмена: снижается содержание меди, железа и цинка.
Дана оценка влияния сорбентов на показатели минерального обмена, антиоксидантной
защиты и активность ферментов холестаза в периферической крови при моделировании
острого отравления этанолом интактных крыс и на фоне предварительной алкоголизации.
Экспериментально обосновано использование сорбентов при острой алкогольной
интоксикации. В комплексной терапии острой алкогольной интоксикации целесообразно
сочетанное применение сорбентов, что позволяет корректировать показатели как
минерального обмена, так и антиоксидантной защиты. Выявлены свойства
энтеродоноросорбента у сапропеля. Наличие в составе сапропеля большого количества биологически активных веществ в сочетании с сорбционной и антиоксидантной активностью позволяет рекомендовать его применение при острой алкогольной интоксикации.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования используются в учебном процессе кафедры биохимии
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Пермский государственный медицинский университет имени академика
Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации и кафедры
экстремальной медицины и товароведения Федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Пермская государственная
фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Публикации
Соискатель имеет 18 опубликованных научных работ по теме диссертации, из них 8 работ опубликовано в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, 1 патент на изобретение. Соискателем опубликованы 1 тезисы и 2 материалов в сборниках Всероссийских конференций, 1 материалы в сборнике международного конгресса, 1 статья в электронном научном издании, 4 материалов в сборниках научной сессии ПГМУ. Общий объем публикаций составляет 3,25 печатных листа.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа представлена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 196 отечественных и 151 зарубежных источников. Работа проиллюстрирована 45 таблицами и 47 рисунками.
Окислительный стресс при острой алкогольной интоксикации
Окислительный стресс сопровождается интенсификацией свободнорадикального окисления (СРО) и снижением активности антиоксидантной защиты (АОЗ) [61]. Причиной формирования окислительного стресса является нарушение баланса между антиоксидантной и прооксидантной системами в пользу последней [24, 123, 179, 320, 340].
Окислительному стрессу принадлежит ведущая роль в формировании цитотоксических эффектов этанола [47, 90, 126, 138, 197, 221, 281, 293]. Острая интоксикация этанолом изменяет состояние АОЗ организма [28, 75, 125, 126, 194]. Этанол и его метаболиты являются естественными компонентами обмена веществ и участниками гомеостатических механизмов [169]. Метаболизм поступившего в организм этанола на 75-95 % осуществляется в паренхиматозных клетках печени [47, 84]. Антиоксидантная защита, объединяющая антирадикальные и антиперекисные механизмы, имеет особое значение при биотрансформации химических веществ [39]. Нарушения в этих системах приводят к ослаблению гидрофобных связей, белок-липидных взаимодействий, разрыхлению клеточных мембран, что приводит к нарушению всех мембранозависимых процессов [123].
Установлено, что при тяжелой форме отравления этанолом у экспериментальных животных из-за нейротоксического действия этанола наблюдаются поведенческие и неврологические нарушения, которые у человека также проявляются нарушением когнитивных функций [94]. Развитие гипоксии при тяжелых интоксикациях нейроторопными ядами может привести к генерации в клетках высокого уровня свободных радикалов [40]. Для оценки состояния процессов СРО используют хемилюминесцентный анализ эритроцитов и плазмы крови [80, 152]. Интенсификация хемилюминесценции различных биологических жидкостей свидетельствует об усилении СРО, а хемилюминесцентный анализ позволяет судить о тяжести заболевания [180]. Через 24 часа после введения животным этанола в дозе 0,5 LD50 не выявлено достоверных изменений интенсивности хемилюминесценции эритроцитов и плазмы крови [126]. Величина светосуммы индуцированной хемилюминесценции обратно пропорциональна общей антиокислительной активности плазмы крови [113]. Изменения антиокислительной системы имеют гендерные отличия: в организме мужчин, злоупотребляющих алкоголем, отмечается интенсивная спонтанная светимость хемилюминесценции, резко повышается активность СОД гемолизатов эритроцитов и уровень восстановленного глутатиона эритроцитов [194]. Установлена взаимосвязь между показателями хемилюминесценции и показателями активности ферментов АОЗ у подростков, злоупотребляющих алкоголем [195]. Показатели хемилюминесценции зависят от скорости выведения этанола из организма: при преобладании этанола в крови светосумма в 3,8 раза выше, чем при преобладании этанола в моче [195]. При активном употреблении алкоголя повышается уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида [198], при прекращении употребления алкоголя уровень продуктов ПОЛ снижается [206].
Окислительную модификацию белков (ОМБ) называют ранним маркером окислительного стресса [48]. Имеются половые и возрастные различия скорости ОМБ в плазме крови лабораторных животных: более высокий уровень антиокислительной активности плазмы крови у молодых и стареющих самок, в сравнении с самцами соответствующих возрастных групп [102].
Высокая степень ОМБ отмечается при различных эндогенных интоксикациях: у больных псориазом и атопическим дерматитом [78], при позднем гестозе беременных [1], при сахарном диабете 2 типа независимо от степени компенсации [59], на фоне длительного воздействия сероводородсодержащего газа независимо от возрастной и половой принадлежности [102]. Высокая ОМБ сыворотки крови отмечена у больных при всех формах ишемического инсульта [183] и в гемолизате эритроцитов больных с надпочечниковой недостаточностью [121]. В динамике гипокинетического стресса в головном мозге активация окисления белков опережает усиление липопероксидации [74]. При алкогольном делирии отмечена интенсификация карбонилирования белков плазмы крови [141]. У больных алкогольным делирием, инфицированных вирусами гепатита С и иммунодефицита человека, окислительный стресс в виде повышения содержания карбонилированных белков более выражен по сравнению с неинфицированными больными алкоголизмом [187].
При остром отравлении этанолом часто обостряются хронические заболевания гепатобилиарного тракта. Известна роль алкоголя в этиологии острого панкреатита [140]. Механизм токсического действия этанола связан с его избирательным действием, в том числе на печень и поджелудочную железу. При остром алкогольном панкреатите более резко изменяются показатели хемилюминесценции и активность ферментов АОЗ, чем при остром билиарном панкреатите [186].
Активация процессов СРО играет важную роль в возникновении и развитии функциональных и структурных нарушений органов гепатобилиарного тракта, особенно печени [281], при механической желтухе, хроническом панкреатите [112], хроническом [73, 90] и остром холецистите [175], остром отравлении этанолом [28, 29, 47, 126, 138, 197, 221, 281, 293].
Антиоксиданты в коррекции острых отравлений этанолом
Принцип метода – зависимость хемилюминесценции эритроцитов от структурной организации мембранных липидов и от активности антиоксидантных ферментов. В мембранах эритроцитов имеются условия для развития свободнорадикального окислении и накопления перекисей: большое количество полиненасыщенных жирных кислот, кислорода и гемового железа. В норме свободнорадикальный процесс протекает на низком уровне, лимитируясь перекисной резистентностью эритроцитов, поэтому снижение перекисной резистентности эритроцитов указывает на уменьшение антиоксидантного потенциала эритроцитарной мембраны.
В измерительную кювету вносили 0,2 мл предварительно отмытой взвеси эритроцитов, 0,4 мл фосфатного буфера pH 7,5, 0,2 мл 0,05 мМ раствора сульфата железа и 0,2 мл свежеприготовленного 2% раствора перекиси водорода. Кювету с приготовленной смесью быстро подводили к датчику и измеряли интенсивность хемилюминесценции в течение 30 секунд.
В отмытых эритроцитах крови определяли проницаемость эритроцитарных мембран по методу [77]. Принцип метода – гемолиз в смесях изотонических растворов мочевины и хлористого натрия, обусловленный способностью мочевины быстро диффундировать через клеточную мембрану и, создавая гиперосмолярную концентрацию внутри эритроцита вызывать его набухание с последующим гемолизом. Повышение содержания мочевины в рабочем растворе увеличивает степень гемолиза эритроцитов. Кривая зависимости между содержанием мочевины и степенью гемолиза, отражает проницаемость мембран опытной популяции эритроцитов.
0,3 мл отмытых эритроцитов разводили 0,9 % раствором хлорида натрия 0,6 мл в соотношении 1:2 и по 0,1 мл смеси помещали в 7 центрифужных пробирок. В каждую пробирку добавляли по 5 мл рабочего раствора с возрастающей концентрацией мочевины. Использовались рабочие смеси мочевины (18 г/л) и хлористого натрия (8,5 г/л) в объемных соотношениях: 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35. В седьмую пробирку наливали 5 мл изотонического раствора мочевины и она служила эталоном 100% гемолиза для исследуемой пробы эритроцитов, с которым сравнивали все остальные пробирки. Концентрация мочевины в растворах составила соответственно 0,120; 0,135; 0,150; 0,165; 0,180; 0,195; 0,300 ммоль/л соответственно. Через 3 мин пробы осторожно перемешивали, центрифугировали и определяли оптическую плотность надосадочной жидкости каждой пробы на спектрофотометре в кювете при длине волны 540 нм против дистиллированной воды.
Степень гемолиза выражали в процентах оптической плотности каждой пробы по отношению к оптической плотности эталона 100% гемолиза (7-я пробирка).
Использовали диагностический набор реактивов для определения гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом [87]. Принцип метода – гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин, который при добавлении ацетонциангидрина образует окрашенный гемиглобинцианид. Интенсивность окраски гемиглобинцианида пропорциональна количеству гемоглобина. Трансформирующий раствор приготовляли растворением 1 ампулы 0,5 мл (0,47 г) ацетонциангидрина и 1 флакона, содержащего калий железосинеродистый 0,2 г и натрий двууглекислый 1,0 г, в 1 л дистиллированной воды в посуде из темного стекла.
Проведение анализа. Необходимый для исследования объем гемолизата вносили в 5,0 мл трансформирующего раствора для определения общего гемоглобина. Измерение оптической плотности проводили не менее чем через 30 минут на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. Расчет проводили по формуле: Hb - концентрация общего гемоглобина гемолизата эритроцитов (г/л); 64,458 - миллимолярный вес гемоглобина в граммах; D540 - оптическая плотность раствора для определения общего гемоглобина; 44 - миллимолярный коэффициент экстинкции гемиглобинцианида; V2 - общий объем трансформирующего раствора и гемолизата, равный V1+5 мл (мл); V1 - объем гемолизата для определения общего гемоглобина (мл).
Определение количества восстановленного глутатиона основано на его взаимодействии с ДТНБК (5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного дисульфида. Интенсивность окраски регистрируют спектрофотометрически при длине волны 412 нм. Содержание глутатиона определяют в безбелковых экстрактах по методу [203].
Реактивы: - Осаждающий раствор - 1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор не прозрачен, храниться в холодильнике в течение трех недель; - 0,3 М Na2HPO4; - Раствор ДТНБК - 0,01 г ДТНБК растворяют в 50 мл 1 % раствора цитрата натрия.
Эритроциты гемолизировали добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дистиллированной воды. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали стеклянной палочкой и после 20-минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 2 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объемом 10 мл. Добавляли 8 мл 0,3 М фосфатного буфера. Затем в пробу вносили 0,5 мл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания должна появиться желтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с ДТНБК. Пробу фотометрировали на спектрофотометре при длине волны 412 нм. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабую желтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведенный дистиллированной водой в отношении 2:5. Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали по формуле: Е Е С Где: С – концентрация восстановленного глутатиона в мкмоль/г Hb; Е1 –оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК; Е2 – оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК; 13600 – коэффициент молярной экстинкции окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии восстановленного глутатиона с ДТНБК; F - отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК и после добавления; 138 – разведение эритроцитов в реакционной пробе; 1000 – коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной; Hb - гемоглобин в г/л
Статистические методы исследования
Содержание железа в плазме крови людей при остром отравлении этанолом. По оси абсцисс: К – здоровые люди, 1 – ООЭ, 2 -обострение хронического панкреатита, 3– механическая желтуха опухолевого генеза, 4 - механическая желтуха неопухолевого генеза, 5 - холелитиаз без механической желтухи. По оси ординат - содержание железа в мкмоль/л
Общая железосвязывающая способность плазмы периферической крови больных при остром отравлении этанолом статистически значимо не отличалась от контроля (таблица 13, рисунок 13), однако наблюдались значительные различия полученных показателей.
Общая железосвязывающая способность плазмы крови больных людей при остром отравлении этанолом (мкмоль/л) Исследуемая группа n M±m p Здоровые люди 5 18,01±3,20 острое отравление этанолом 9 23,58±6,28 0,5 Примечание: р – достоверность различий по сравнению с контролем 30 г К 1 Общая железосвязывающая способность плазмы крови больных при остром отравлении этанолом. По оси абсцисс: К – здоровые люди, 1 – острое отравление этанолом. По оси ординат - общая железосвязывающая способность в мкмоль/л
Содержание магния в плазме крови людей при остром отравлении этанолом статистически значимо не отличалось от содержания данного элемента в плазме крови здоровых лиц (таблица 14, рисунок 14).
Не установлено достоверных различий содержания магния в плазме периферической крови больных при обострении хронического панкреатита (таблица 14, рисунок 14). Исследуемая группа n M±m p Здоровые люди 8 0,75±0,05 острое отравление этанолом 24 0,69±0,23 0,5 обострение хронического панкреатита 8 0,78±0,20 0,5 Содержание магния в плазме крови людей при остром отравлении этанолом. По оси абсцисс: К – здоровые люди, 1 – ООЭ, 2 – обострение хронического панкреатита. По оси ординат - содержание магния в ммоль/л Содержание цинка в плазме крови людей при остром отравлении этанолом статистически значимо не отличалось от контроля (таблица 15, рисунок 15).
Примечание: р – достоверность различий по сравнению с контролем К Рисунок 15 - Содержание цинка в плазме крови больных при остром отравлении этанолом. По оси абсцисс: К – здоровые люди, 1 – ООЭ. По оси ординат - содержание цинка в мкмоль/л Таким образом, при острой алкогольной интоксикации установлены изменения содержания показателей минерального обмена в плазме крови людей и экспериментальных животных. В плазме периферической крови крыс при остром отравлении этанолом и при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации достоверно снижалось содержание меди, железа, цинка и ОЖСС. Более существенное снижение содержания железа в плазме крови было установлено при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации. При введении литовита в плазме крови крыс нормализовалось содержание меди, железа и цинка как при остром отравлении этанолом интактных животных, так и при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации. Сапропель при острой алкогольной интоксикации способствовал нормализации в плазме крови содержания меди, железа и цинка. Введение сорбента полисорба привело к нормализации содержания железа при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации. Все исследуемые сорбенты нормализовали ОЖСС плазмы крови крыс при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации и не оказали влияния при остром отравлении этанолом.
Выявлено корригирующее влияние полисорба, литовита и сапропеля на показатели минерального обмена при остром отравлении этанолом интактных животных и на фоне предварительной алкоголизации. Полученные результаты обосновывают использование сорбентов при алкогольной интоксикации.
При острой алкогольной интоксикации снижается содержания меди в плазме крови 50% больных, а железа - 30% людей. Содержание меди в плазме крови больных при обострении хронического панкреатита и при механической желтухе увеличивалось в 2 раза по сравнению со здоровыми людьми. Наиболее значительное увеличение меди в крови наблюдали при механической желтухе, что связано с задержкой выделения меди вследствие нарушения оттока желчи. Исследуемый параметр сохранял свою значимость в течение всего желтушного периода. При этом в плазме крови больных с механической желтухой опухолевого генеза содержание меди достоверно выше, чем в плазме крови больных с механической желтухой, обусловленной наличием камней во внепеченочных желчных протоках. Это позволило разработать способ дифференциальной диагностики механической желтухи опухолевого генеза, заключающийся в том, что в плазме крови больного определяют содержание меди, и при его значении равном и выше 30,88 мкмоль/л определяют механическую желтуху опухолевого генеза.
Показатели антиоксидантной защиты в периферической крови крыс при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации
Количество острых алкогольных отравлений в Российской Федерации ежегодно возрастает, сохраняется высокая инвалидизация больных [99]. Показатель смертности от отравлений этиловым спиртом и его суррогатами в России является одним из самых высоких в мире [130].
Цель исследования - при острой алкогольной интоксикации в эритроцитах и плазме периферической крови изучить показатели минерального обмена, антиоксидантной защиты и оценить влияние на них сорбентов. Дана сравнительная оценка показателей антиоксидантной защиты (церулоплазмин, трансферрин, глутатион) и минерального обмена (медь, железо, магний, цинк) в эритроцитах и плазме крови при моделировании острой алкогольной интоксикации на интактных животных и на фоне предварительной алкоголизации.
Окислительному стрессу принадлежит ведущая роль в формировании цитотоксических эффектов этанола [38, 47, 138]. При остром отравлении этанолом интактных животных в эритроцитах крови снижается показатель максимальной интенсивности хемилюминесценции (Imax), а в плазме крови при этом не выявлено статистически значимых изменений показателей хемилюминесценции. При острой интоксикации этанолом на фоне предварительной алкоголизации изменяется интенсивность хемилюминесценции эритроцитов и плазмы крови крыс. При изучении показателя хемилюминесценции tg 2, отражающего антиоксидантный потенциал, в эритроцитах и плазме крови при остром отравлении этанолом на фоне предварительной алкоголизации не установлено статистически значимых отличий по сравнению с контролем. При введении полисорба, литовита либо сапропеля при острой алкогольной интоксикации на фоне предварительной алкоголизации показатели Imax, S, Simax и tg 2 в эритроцитах и плазме крови не отличались от контроля. Известно, что полисорб при остром отравлении этанолом имеет наиболее выраженный антитоксический эффект, он достоверно сокращает период полувыведения этанола и восстанавливает физическую работоспособность [126], активно адсорбируя этанол в желудке и кишечнике, предупреждает его первичное всасывание, снижая концентрацию его в периферической крови в 2,5 раза, прерывает рециркуляцию этанола в желудочнокишечном тракте, сокращая в 1,6 раза период его полувыведения [126]. При острой алкогольной интоксикации в гемолизате эритроцитов крови больных людей и экспериментальных животных установлено увеличение уровня карбонильных производных белков, что свидетельствует об усилении окислительной модификации белков. Показано, что сорбенты не нормализуют уровень карбонильных производных белков эритроцитов при острой алкогольной интоксикации. После введения полисорба либо литовита при острой интоксикации этанолом на фоне предварительной алкоголизации уровень карбонильных производных белков в эритроцитах крови снижался в 2 раза, но не достигал контрольных значений.
Этанол повреждает биологические мембраны, в том числе мембраны эритроцитов и гепатоцитов. Установлена тенденция к снижению проницаемости эритроцитарных мембран в периферической крови людей и экспериментальных животных при острой алкогольной интоксикации. Проницаемость эритроцитарных мембран изменяется при активации процессов свободнорадикального окисления. Усиление процессов перекисного окисления липидов в клеточных мембранах приводит к уплотнению липидного бислоя, увеличению его микровязкости, уменьшению площади белок-липидных контактов, нарушению функциональной нативности белков, форментов, изменению мембранной проницаемости и поверхностного заряда [18]. Определение проницаемости эритроцитарных мембран может иметь значение для прогнозирования развития холестаза при острой алкогольной интоксикации. Повреждение клеток печени при холестазе сопровождается изменением проницаемости мембранного барьера. Выявлено снижение проницаемости эритроцитарных мембран крови больных при остром панкреатите, обострении хронического панкреатита и при механической желтухе. Установлено, что введение животным сорбентов полисорба, литовита либо сапропеля оказало корригирующее влияние на проницаемость эритроцитарных мембран при острой интоксикации этанолом интактных крыс и на фоне предварительной алкоголизации.
Показатели антиоксидантной защиты являются чувствительными к действию этанола [125, 126]. При острой интоксикации этанолом интактных животных и на фоне предварительной алкоголизации содержание основного антиоксиданта плазмы крови церулоплазмина увеличивается почти в 1,5 раза по сравнению с контролем. В плазме крови больных людей при острой алкогольной интоксикации содержание этого белка снижается. Это можно объяснить повреждающим действием свободных радикалов в отношении структуры церулоплазмина [54]. Содержание церулоплазмина в плазме крови крыс при введении полисорба, литовита либо сапропеля нормализовалось при острой интоксикации этанолом на фоне предварительной алкоголизации. Известно, что при использовании исследуемых сорбентов (полисорба, литовита, сапропеля) повышенный уровень церулоплазмина в крови крыс при остром отравлении этанолом нормализуется [126].
В плазме крови церулоплазмин совместно с трансферрином образуют антиоксидантную систему, регулирующую концентрацию восстановленных ионов железа [24]. Синтезирующая функция печени при острой алкогольной интоксикации нарушается, и содержание трансферрина в плазме крови животных статистически значимо снижается в 1,5 раза при остром отравлении этанолом интактных животных и в 3 раза на фоне предварительной алкоголизации. Показано, что при остром отравлении этанолом введение сорбентов полисорба, литовита либо сапропеля привело к нормализации содержания трансферрина в плазме периферической крови крыс. При введении сорбентов крысам при острой интоксикации этанолом на фоне предварительной алкоголизации содержание трансферрина в плазме крови не нормализовалось.