Введение к работе
Актуальность, темы. Ошоидные пептиды (Oil) представляют собой
наиболее многочисленную группу нейропептидов:~открнтігуже-десятки-
ендогенних (зпкефалиш, ондорфины, динорфины, дерморфины, дель- ..-торфини) и экзогенных (казоморфпш, акзор$ины) ОП, синтезированы тысячи их аналогов. Количество публикаций по ОП не уменьшается, что обусловлено участием ОП в регуляции важнейших функций организма. Основным источником ОП в организме являются их'предшественники, содержание в своей последовательности целый набор разнообразных ОП. Вместе с тем в литературе накапливается все больше данных о наличии регуляторних пептидов (РП), в том числе и ОП, в белках с самыми различными функциями. Уже достаточно подкреплены экспериментальными результатами теоретические положения о возможности образования РП из белков, не являющихся их традиционными .предшественниками ( Чипенс, 1983, Carraway, Reinecke, 1984, Янковские, 1985, Харченко, 1988).
Биологически активные фрагменты различных белков обнаружены ' преимущественно при энзиматическом переваривании белковых молекул in vitro. Благодаря же увеличению числа белков с установленной первичной структурой и создании их банков данных перспективным направлением поиска РП становится в последние годы сравнительный анализ последовательностей белков с. целью выявления в них гомологичных РП фрагментов, потенциально способных выполнять функцию биорегуляторов. Интересным аспектом в изучении структурно -функциональных соотношений РП является конструирование и анализ свойств химерных пептидов, включающих в себя разные Ш и тем самым обладающих новой комбинацией свойств.
Поскольку эккефалины и дерморфины имеют простую структуру, на основе которой были получены многочисленные; синтетические опиоиднне агочисты, мы предположили, что сходные с ними по структуре пептидные фрагменты в нерегуляторных белках могли бы обладать опиоидной активностьч. Возможно, такие опиатоподобные фрагменты модулируют разнообразные функции в организме при интенсивном протеолизе белков, сопровождающем многие патологические и некоторые физиологические состояния.
Поиск новых опиатоподобных пептидов в последовательностях белков представляет не только теоретическое, но и практическое значение в связи с тем, что природные пептиды более "совместимы" с организмом и полностью метаболизируют в отличие от искусственно созданных последовательностей, и поэтому перспективны для -терапевтических целей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования
являлся поиск в последовательностях белков пептидных фрагментов, сходных либо' отличающихся по структуре с ОП энкефалинами и дерморфином, и создание на основе атих фрагментов новых
високоактивних опиатоподобшх пептидов, а также конструирование химерного пептида, в последовательности которого сочетались бы структуры разных пептидов-анальгетиков.
Для достижения атой цели были поставлены следующие конкретные задачи;
-
Провести целенаправленный поиск опиатоподобшх последовательностей в нер'егуляторннх белках с известной первичной структурой, отобрать часть выявленных пептидных фрагментов для их синтеза, а также создать новый химерный пептид, который включал бы в себя разные классы пептидов-анальгетиков.
-
Исследовать анальгетическую и опиоидную активность синтезированных пептидных фрагментов белков и химерного пептида по биохимическим и фармакологическим тестам и получить на их основе высокоактивные аналоги.
Научная новизна работы. Впервые проведен сравнительный ана-
_ лиз аминокислотных последовательностей нерегуляторных белков '(свыше 500 белков) для выявления в их составе пептидных фрагментов с огшатрподобной структурой. Показано, что в исследованных последовательностях белков встречаются как пептида, сходные по расположению тирозина в 1-й и фенилаланина в 3-й позициях с известным природным 0П дерморфином, так и пептиды энкефалйнового типа с тирозином в 1-й и фенклаланином в 4-й позициях.
Впервые выявлена налоксон-обратимая анальгетическая активность синтезированных пептидных фрагментов из каппа-легкой цепи иммуноглобулина кролика, тяжелой цепи миозина и актина кролика, гормона роста человека.
Впервые обнаружена налоксон-обратимая анальгетическая активность для пептидов неэнкефалинового типа из основного миелинового белка и прознкефалина В.
Получены высокоактивные аналоги исследованных нами каппорфи-на и гисторфина путем введения D-аминскислот во 2-ю позицию и амидированием С-концевой аминокислоты пептидов, по анзльгетичес-кой активности не уступающие мощному природному пептиду дерморфину.
Впервые предложен п исследован новый химерный пептид, состоящий из двух нейропептидов-знальгеткков: лей-энкефалпна и пентанейротензина. По фармакологическим тестам и радиорецепторно-му анализу выявлено доминирование нейротензинсБой компоненты в химерном пептиде.
Установлено.сродство и селекїивность изученных пептидов к ц-«- и х-опиоидным рецепторам головного мозга крыс.
Показано ингибирующее влияние отдельных пептидов (кзппорфк-на, миелорфина, аналогов каппорфина и гисторфина) на активность аденилатциклазы стриатума мозга крыс.
Научно-практическая значимость работы. Проведенный целена-
правленный поиск опиатоподобных пептидных фрагментов в последова-тельностях__ нерегуляторных белков показывает перспективность данного подхода "для обнаружения новых-опиатоподобных пептидов.
Создание высокоактивных аналогов изученных пептидов "каппор-
фина и гисторфина позволяет рассматривать последовательность Tyr-X-Phe-Gly-Gly как основу для создания более мощных -0П.
Конструирование и анализ свойств химерного пептида может способствовать получению новых опиатоподобных пептидов с заданной комбинацией свойств, а также более полному пониманию структурно- _.-функциональных соотношений таких многокомпонентных пептидов каки- V ми являются ОП ендорфиш и динорфины.
Модифицированный нами механический тест определения аналь-ге тиче ской активности может быть рекомендован лабораториям,;; занимающимся исследованиями анальгетических веществ.
На защиту диссертант выносит следующие основные_пдложения:
-
В различных нерегуляторных 'белках обнаружены пентапептида, имеющие сходство по расположению' тирозина в 1-й и фенилаланина в 3-й позициях с ОП дерморфином.
-
Впервые установлена налоксон-обратимая анальгетическая активность для синтезированных пептидных фрагментов белков (каппа-легкой цепи шлмуногло'булина кролика, тяжелой цепи миозина и . актина кролика, гормона роста человека), имеющих структурное сходство с дерморфином, а также пептидов не знкефалилового типа из основного миелшювого белка и интерэнкефалина В.
-
Охарактеризована ошкждная активность некоторых пептидов по конкурентному вытеснению ими меченых селективных опиоидных агонистов на мембранах головного мозга крыс и по влиянию их на активность аденилатциклазы стриатума мозга крыс.
-
Получены высокоактивные аналоги пептидов каппорфина и гистор-
фина, обладающие налоксон-обратимой активностью в 10 - .-10 раз
большей, чем лей-энкефалин. Определено сродство и селективность
аналогов каппорфина и гисторфина к опиоидным рецепторам головного
мозга крыс и влияние их на активность аденилатциклазы стриатума
мозга крыс. ' '
5. Сконструирован химерный пептид иефбин, состоящий из.лей-внке-
фалина и пентанейротензинз, для получения опиатоподобного пептида
с новой комбинацией свойств и изучения структурно-функциональных
соотношений многокомпонентных регуляторних пептидов.
Работа выполнена на дополнительные финансирования Президиума АН СССР, распоряжение N 951 от 30.10.8? г. и N 123 от 12.04.88 г.
Получено удостоверение на рацпредложение "Устройство для
измерения уровня болевого порога у животных при воздействии
опиоидных веществ", N 662 (7) от 10.01.1987 г. (совместно с Т.В.
Соколовой и А.П.Новокрещеновым). . - .
_Пу_бликацш.По теме диссертации опубликовано 8 научных-работ. Апробация_работн. Материалы диссертации были доложены на VII
Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, октябрь 1937 г. Таллинн; на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторше клетки", сентябрь 1939 г. Суздаль; на заседании лаборатории сравнительной биохимии нервной системы ИЭФБ им.И.М.Сеченова РАН (декабрь 1990 г); на заседании межлабораторного совещания ИЭФБ им.И.М.Сеченова РАН (январь 1994 г).
Ст^укту^а_и_объем_диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложеїшя результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на а^страницзх машинописного.. . текста, содержит ? таблицы и2^рисунков. Список включает 2.35" источников, из них ті Я отечественных. .